Die Familie der NFAT-Transkriptionsfaktoren (NFATc1-c4) ist im Zuge einer Immunreaktion endscheidend an der transkriptionellen Regulation der Genexpression beteiligt. Wurden NFAT-Faktoren zunächst als T-zell-spezifische Aktivatoren von Zytokinpromotoren beschrieben, so hat sich inzwischen gezeigt, dass sie in einer Vielzahl von Geweben eine wichtige Rolle spielen. Als Beispiele seien die Herzklappenentwicklung, die Bildung von Blutgefässen, die Ausbildung neuronaler Axone oder die Osteoklastendifferenzierung genannt [10, 24]. In der hier vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass die starke Expression der kurzen Isoform NFATc1/αA in Effektor-T-Lymphozyten durch die induzierbare Aktivität des Promoters P1 kontrolliert wird. Die P1 Aktivierung führt zum Splicing des Exon 1 zu 3 (α-Isoformen) und endet meist durch Benutzung der Polyadenylierungsstelle pA1 hinter Exon 9 (A-Isoformen). Der zweite, schwächerer Promoter P2 befindet sich vor dem zweiten Exon und ist für die konstitutive Synthese der β-Isoformen verantwortlich. Der Transkriptionstart am zweiten Exon geht meist mit der Benutzung einer zweiten, hinter dem 11. Exon gelegenen Polyadenylierungsstelle pA2 einher, die durch alternatives Splicing zur Synthese der Isoformen B und C führt. Insgesamt können so vom nfatc1-Lokus sechs verschiedene Isoformen (αA, αB, αC, βA, βB und βC) generiert werden. Die induzierbare Aktivität des P1-Promoters ist, im Gegensatz zum eher konstitutiv aktiven P2-Promoter, NFAT-abhängig und somit eine Form der Autoregulation. In ruhenden T-Lymphozyten sind einzig die Transkripte der NFATc1/β-Isoformen nachweisbar. Nach einer T-Zell-Aktivierung nimmt ihre Häufigkeit dann ab, während nun die α-Isoformen dominant werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass es nach Induktion primärer Effektor-T-Helfer-Zellen oder in T-Zell-Linien zu einer 15-20-fachen Akkumulation der NFATc1/αA mRNA bzw. einer 2-5-fachen Zunahme der NFATc1/αB und C mRNAs kommt. Zur maximalen Induktion des P1-Promotors bedarf es zum einen eines anhaltenden Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration, die zur Aktivierung der Phosphatase Calcineurin und damit zur Kernlokalisation der NFAT-Faktoren führt. Zum anderen ist die Aktivierung der Proteinkinase C-Enzyme und der MAP-Kinasen notwendig, wie sie durch Phorbolester in der Zelle vermittelt wird. Dies lässt darauf schließen, dass für eine optimale Aktivierung des P1-Promotors sowohl Signale des T-Zell-Rezeptors als auch Signale von Korezeptoren - wie von CD28 - notwendig sind. Da die Induktion von NFATc1/αA in NFATc2/NFATc3 doppeldefizienten Mäusen normal erfolgt, kann man schlussfolgern, dass NFATc1 in Form einer Autoregulation die Aktivität des P1-Promoters und damit die Synthese der α-Isoformen kontrolliert. Die NFAT-vermittelte Aktivierung des P1-Promoters erfolgt über zwei tandemartig angeordnete NFAT-Bindungsstellen der Nukleotidsequenz TGGAAA, an die jeweils ein NFAT-Protein binden kann. Daneben enthält der Promoter konservierte Bindemotive für CREB-, AP-1, Sp-, NF-kB- und GATA-Faktoren, die wahrscheinlich an der komplexen Kontrolle dieses induzierbaren NFATc1-Promoters beteiligt sind. Zusammengefasst ergibt sich aus diesen Daten das folgende Modell. Die Transkription im nfatc1-Genlokus erfolgt in naiven und in ruhenden Effektor-T-Zellen konstitutiv und gesteuert durch den P2-Promotor. In Folge einer Aktivierung der Zelle verringert sich die Aktivität des P2-Promotors, während gleichzeitig der P1-Promotor induziert wird, der zusammen mit einer verstärkten Nutzung der pA1-Polyadenylierungssequenz für die massive Zunahme der NFATc1/αA-Isoform verantwortlich ist. Dies deutet auf eine besondere Bedeutung dieser kurzen Isoform in der Effektorphase der T-Zell-Aktivierung hin, insbesondere in Th1-Zellen, die NFATc1/αA in hohen Konzentrationen produzieren. / NFAT transcription factors play critical roles in gene transcription during immune responses. Besides regulation of lymphokine promoters in T lymphocytes, NFAT factors are also expressed in other cell types and regulate the activity of numerous genes that control the generation of cardiac septa and valves in embryonic heart, the formation of blood vessels, the outgrowth of neuronal axons and the differentiation of osteoclasts during bone formation [10, 24]. Here we show that the induction of NFATc/αA in effector T cells is controlled by a strong inducible promoter, P1. It results in splicing of exon 1 to exon 3 transcripts and, in concert with the activity of a poly A site downstream of exon 9, leads to the massive synthesis of NFATc/αA in effector Th1 cells. A second, weak promoter, P2, lies in front of exon 2 and directs the synthesis of longer NFAT β isoforms. Both P1 and P2 direct the synthesis of three different RNAs: αA, αB, αC and βA, βB, βC correspondingly. The B and C isoforms arise from alternative splicing and poly A addition at the distal site pA2. P1 but not P2 activity is autoregulated by NFAT factors which bind to two tandemly arranged NFAT sites within P1 and enhance its induction. In resting T cells, the NFATc1/β RNAs are the most prominent nfatc1 transcripts and their synthesis is reduced upon T-cell activation. However, following activation in primary effector T cells or in T-cell lines of human or murine origin, a 15–20-fold induction of NFATc1/αA RNA was detected, whereas only a 2–5-fold increase was observed for the NFATc1/αB or NFATc1/αC RNAs. Optimal induction of P1 promoter require involving of a persistent increase in free cytosolic Ca2+ induced by ionomycin, which stimulates the nuclear translocation and transcriptional activation of all NFATc factors and phorbol esters, which activate protein kinase C and other protein kinase pathways in T cells. This suggests that both TCR and co-receptor signals contribute to give full P1 nfatc1 induction. Because NFATc1/αA induction is unaffected in NFATc2+c3 double-deficient T cells, NFATc1 autoregulates its own synthesis by controlling P1 activity and NFATc1/αA induction. P1 promoter contains tandemly arranged NFAT core binding motif TGGAAA to witch bind monomeric NFATc1 proteins and numerous conservative binding sites of other transcriptional factors like CREB, Fos, ATF-2, Sp1, NF-kB and GATA suggesting complex multi-factor regulation of NFATc1 gene. We also highlight that initial phase of nfatc1 transcription in naive CD4+ T cells is controlled by the promoter P2 which is constitutively active in resting T cells. The activation of resting T cells results in a decrease of P2 and the induction of P1 activity and, under optimal conditions, in the predominant synthesis of NFATc1/αA in effector T cells. In addition to the high concentrations of poly A factors required for optimal pA1 function, the levels of transcription factors, in particular NFATs, must also increase for P1 induction. That could be explained by achievement of certain threshold levels for transcriptional activation. Finally, the altered transactivation potential of NFATc1/αA suggests a specific role for this NFATc1 protein in gene control, such as in Th1 effector cells where NFATc1/αA is synthesized at high concentrations.

Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin. / Neisseria meningitidis ist ein fakultativ pathogener menschlicher Kommensale und eng an die Bedingungen seiner spezifischen Nische, den Nasopharynx, angepasst. Über die regulatorischen Mechanismen, die für diese Anpassung vonnöten sind, ist nicht viel bekannt. Daher wurde die Rolle des Transkriptionsregulators NMB1843 untersucht, eines der beiden prognostizierten Regulatoren der MarR Familie im Meningokokken-Genom. Aufgrund einer hohen Sequenzhomologie dieses Gens zu FarR, dem Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, nannten wir das Meningokokken-Protein ebenfalls FarR (NmFarR). Homologie-Modellierung dieses Proteins ergab eine dimere Struktur mit dem charakteristischen winged helix-turn-helix DNA-Bindemotiv der MarR Familie. Es wurde gezeigt, dass NmFarR in Meningokokken-Stämmen hochkonserviert ist. Die Expression von farR wird während des exponentiellen Wachstums posttranskriptional kontrolliert und erreicht ihren Höchststand in der spätexponentiellen Phase. Wie bei seinem Homolog in Gonokokken konnte die direkte und spezifische Bindung von FarR an die farAB Promotorregion nachgewiesen werden. Da FarR in N. gonorrhoeae an der Fettsäureresistenz beteiligt ist, wurde die Suszeptibilität einer großen Auswahl von Stämmen beider Spezies gegenüber drei unterschiedlichen Fettsäuren getestet: Laurinsäure (C12:0), Palmitinsäure (C16:0) und Linolsäure (C18:2). Im Gegensatz zu den ungewöhnlich sensitiven Gonokokken konnte eine hohe inhärente Fettsäureresistenz in fast allen Meningokokken-Isolaten beobachtet werden. Nach Analyse der molekularen Grundlage dieser Resistenz konnte gezeigt werden, dass sowohl eine funktionale FarAB Efflux-Pumpe als auch ein intaktes Lipopolysaccharid (LPS) für die Palmitinsäureresistenz verantwortlich sind. Trotz Umgehung der inhärenten Resistenz konnte keine Verbindung von FarR mit Fettsäureresistenz in Meningokokken hergestellt werden. Stattdessen reprimiert FarR direkt und spezifisch die Expression des Neisseria Adhäsins A (nadA), eines vielversprechenden Impfstoffbestandteils. Microarrays bestätigten diese Ergebnisse, zeigten aber keine weiteren ähnlich regulierten Gene auf. Somit ist das FarR-Regulon das bisher kleinste Regulon in Meningokokken. Die genaue FarR-Bindestelle innerhalb des nadA Promotors wurde als ein 16 bp Palindrom identifiziert und dessen Einfluss auf die Transkription von nadA mittels Reportergenanalysen gezeigt. Auch in Infektionsversuchen wurde die Relevanz dieser Repression deutlich, da ein farR-deletierter Stamm eine höhere Adhärenz an Epithelzellen aufwies. Die Transkription von farR sank nach Kontakt mit aktiven Komplementbestandteilen aus humanem Serum. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass FarR eine Rolle in der Nischenadaptation von Meningokokken zukommt, indem er zwischen Immunevasion durch Repression des hoch-immunogenen nadA und Wirtszelladhäsion durch eben dieses Adhäsin vermittelt.

Das Follikuläre Lymphom (FL) ist nach dem Diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) das häufigste Non-Hodgkin-Lymphom in der westlichen Welt. Die aktuelle WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphoiden Gewebe aus dem Jahr 2008 unterteilt dieses maligne Lymphom nach Histologie und Wachstumsmuster in vier Gruppen, FL 1 bis FL 3A und FL 3B. Obwohl die FL 1 und FL 2 zu den indolenten Tumoren gezählt werden, und FL 3A und FL 3B tendenziell eher als aggressiv gelten, so wurde in einigen Studienarbeiten gezeigt, dass das FL 3A aufgrund seiner immunhistologischen und genetischen Charakteristika, insbesondere dem Vorhandensein der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21) Translokation, eher den low-grade-Lymphomen (FL 1 und FL 2) nahe steht, während das FL 3B durchaus Eigenschaften des DLBCL, wie das Fehlen einer BCL2/IGH-Translokation und das vermehrte Auftreten von Aberrationen des BCL6-Gens, zeigt. In verschiedenen Arbeiten wurde des Weiteren eine Einteilung in reine FL 3B und FL 3B mit Anteilen eines DLBCL (+ DLBCL) vorgenommen, da sich auch diese beiden Subgruppen durch unterschiedliche Proteinexpression und genetische Eigenschaften auszeichnen würden. Laut den bislang in der Literatur vorliegenden (spärlichen) Daten zeigen FL 3A und FL 3B unterschiedliche Antigen-Profile und offenbar auch unterschiedliche (primäre) genetische Veränderungen, wobei gerade für das FL 3B nur wenige Daten vorliegen. Während Grad 3A-Tumoren einige Ähnlichkeiten zu den FL 1 und 2 zeigen, scheint das FL 3B im Immunphänotyp wie in der Genetik eher dem DLBCL zu ähneln. Allerdings lässt sich bei kritischer Durchsicht der Literatur erkennen, dass die meisten Fälle eines FL Grad 3 entweder gar nicht den Graden 3A oder 3B zugeordnet, beziehungsweise in diese unterschieden wurden, oder häufig bereits einen zusätzlichen diffusen Wachstumstyp aufweisen, nach den Regeln der WHO-Klassifikation für Tumoren der Hämatopoetischen und Lymphatischen Gewebe (2008) also als DLBCL mit einem zusätzlichen follikulären Wachstumsanteil klassifiziert würden. Somit sind die Daten insbesondere über die rein follikulär wachsenden FL 3B äußerst spärlich. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der immunhistochemischen und genetischen Charakterisierung der FL 3B. Von besonderem Interesse war die Bestimmung der Häufigkeit der BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21), BCL6/IGH t(3;14)(q27;q32) und MYC/IGH t(8;14)(q24;q32) Translokationen in den verschiedenen Typen der FL. Weiterhin sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Anwendung der Tissue Microarray (TMA)-Technik und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an TMAs robuste Daten zu dieser Fragestellung liefern kann. In einem ersten Schritt wurden vorhandene TMAs von FL, DLBCL und MALT-Lymphomen mit break-apart-Sonden für BCL2, BCL6, MYC und IGH hybridisiert, und die gewonnenen Ergebnisse mit Daten der konventionellen Zytogenetik abgeglichen. Hierdurch sollte nachgewiesen werden, dass die FISH in Kombination mit der TMA-Technik eine valide Testmethode zur Aufdeckung der gesuchten chromosomalen Aberrationen darstellt, die in Sensitivität und Spezifität der klassischen Zytogenetik nicht nachsteht. In einem zweiten Schritt wurden FL aus dem Archiv des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg anhand der aktuellen WHO-Kriterien in die Grade 1, 2, 3A und 3B eingeteilt (und reklassifiziert). Diese Tumoren wurden im TMA und im Vollschnitt durch immunhistochemische Färbungen auf ihre Protein-Expression und mittels FISH auf ihre genetischen Eigenschaften untersucht und charakterisiert. / Follicular lymphoma (FL) and Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) each account for approximately 30 % to 40 % of all Non-Hodgkin-lymphomas (NHL) in the Western world, thus representing the most frequent subtypes of NHL. FL are homogenously characterized by their follicular growth pattern, and the current WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues recommends their subclassification into 3 grades (FL grade 1, 2 and 3) according to the number of centroblasts. FL grade 3 have gained considerable interest because of their unresolved status as indolent or aggressive neoplasms, and their varying immunophenotypic, cytogenetic and possibly clinical features. FL grade 3 can be further distinguished into two subtypes, FL grade 3A (FL 3A, with centrocytes) and FL grade 3B (FL 3B, without centrocytes). FL 3A shows overlapping morphological and genetic features to FL 1 and FL 2, whereas FL 3B is poorly characterized on the genetic level. Almost all available data have been generated from FL 3B with an additional DLBCL component. Purely follicular FL 3B, on the other hand, is a rare neoplasm. The cytogenetic constitution of purely follicular FL3B is largely unknown. In the present work, therefore, we set out to define immunophenotypic and cytogenetic data of FL 3B, especially also paying attention to their sometimes difficult delineation from FL 3A and related variants. We performed a detailed immunohistochemical and molecular investigation of purely follicular FL 3B. In this study, we also included FL with large centrocytes (FL LCC) and FL, in which a straightforward and reproducible distinction between grades 3A or 3B was not possible (FL 3U). Moreover, we analyzed FL 1, FL 2, FL 3A and FL 3B + DLBCL, with regard to their delineation from purely follicular FL 3B. The study focussed on the expression of immunohistochemical markers and the examination of translocations involving the BCL2, BCL6, and MYC gene loci via FISH. To ensure homogenous and rapid sample processing, we constructed tissue microarrays (TMAs). To obtain insights in the reliability of FISH analysis performed on TMAs, we initially investigated B-NHL samples, whose genetic aberrations previously have been well-defined and characterized by chromosome banding approaches.

Neisseria meningitidis, ein pathogenes Bakterium, das schwere Fälle von Sepsis und Meningitis verursacht, interagiert während der Infektion mit verschiedenen Oberflächen des Wirtes. Die schnellstmögliche Anpassung an die spezifischen Milieubedingungen im Wirtsorganismus ist daher ein essentieller Schritt in der Pathogenese. Durch Verwendung von DNA-Mikroarrays, die auf gespotteten Oligonukleotiden basieren, wurde das Transkriptionsprofil von N. meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen analysiert. Zur Analyse wurde die isogene kapseldefiziente siaD-Mutante des N. meningitidis Stammes MC58 verwendet. 72 Gene konnten nach Kontakt mit Epithelzellen und 48 Gene nach Kontakt mit Endothelzellen als differential reguliert identifiziert werden. Darunter auch eine große Anzahl von Virulenzgenen. Während ein Teil der detektierten Gene in beiden Systemen als differentiell reguliert galt, gab es doch eine Anzahl von ORF´s, die nur für ein Zellkulturmodell spezifisch reguliert waren (59 spezifische Gene für HEp-2 und 35 spezifische Gene für HBMEC). Für einige ausgewählte Gene wurde die im Mikroarray detektierte Regulierung durch Quantitative RT-PCR nochmals bestätigt. Die Funktion von den als induziert identifizierten Genen rfaF, hem und NMB1843 wurde im Anschluß durch die Konstruktion von Mutanten näher untersucht. Das rfaF-Gen, eine in der LPS Biosynthese involvierte Heptosyl-II-transferase, wurde in beiden Zellkultursystemen als differentiell reguliert identifiziert. Die Deletion des Gens führte speziell für den bekapselten Stamm MC58 zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasion nach Infektion von Epithelzellen. Untersuchungen des Infektionspotential für HBMEC Zellen ergaben keine signifikant veränderte Adhärenz und Invasion. Bei zusätzlicher Deletion von rfaF in einem opc negativen Stamm konnte eine Abnahme der bakteriellen Aufnahme im Zellkulturmodell HBMEC beobachtet werden. Dagegen zeigten die opc, rfaF negativen Mutanten nach Kontakt mit HEp-2 Zellen keine verminderte Invasion. Weiterhin führte die Deletion des rfaF-Gens zu einer verstärkten Sensibilität gegenüber humanen Serum. Diese Daten deuten daraufhin, dass die LPS-Struktur eine Rolle in der bakteriellen Zellinteraktion spielt, speziell wenn eine für die Adhäsion wichtige Komponente nicht mehr exprimiert wird. Der ORF NMB1843, der für einen Transkriptionsregulator aus der MarR-Familie kodiert, ebenso wie das Hämolysin Gen konnten nur nach Kontakt mit HBMEC Zellen als differentiell reguliert identifiziert werden. In Infektionsstudien zeigten die hem-Mutanten keine veränderte Adhärenz und Invasion. Weiterhin war die Zytotoxizität der Mutanten nicht eingeschränkt. Ob der ORF NMB1646 daher als Hämolysin fungiert bleibt zu klären. Durchgeführte Mikroarraystudien mit den NMB1843-Mutanten, führten zur Identifizierung einiger ORF´s, die möglicherweise unter der Kontrolle dieses Regulators stehen. Dazu gehören die Virulenz assoziierten Gene sodC, iga und nadA sowie das für ein Hämolysin kodierende Gen NMB1779. Die Untersuchung des Expressionsprofils mittels SDS-PAGE Analyse führte zur Identifizierung einer Proteinbande bei 210 kDa, die spezifisch für die NMB1843 negativen Stämme ist. Dieses Protein wurde als nadA identifiziert. NadA induziert im Tiermodell bakterizide Antikörper und gilt daher als möglicher Impfstoffkandidat. Die in dieser Arbeit vorgelegten Daten liefern neue Einblicke in die Pathogenitätsmechanismen von N. meningitidis und belegen die Bedeutung der transkriptionellen Genregulation in den einzelnen Stadien der Meningokokkeninfektion. / Neisseria meningitidis is a major cause of septicemia and meningitis. During the course of infection, N. meningitidis encounters multiple environments within its host, which makes rapid adaptation to environmental changes a crucial factor for neisserial pathogenicity. As technology platform oligonucleotide-based DNA microarrays were employed to analyse the transcriptome profile of N. meningitidis during two key steps of meningococcal infection: the interaction with epithelial and endothelial cells. The isogenic capsule deficient siaD mutant of the N. meningitidis strain MC58 was used for this study. Seventy-two genes were differentially regulated after contact with epithelial cells, and 48 genes were differentially regulated after contact with endothelial cells, including a considerable proportion of well-known virulence genes. While several genes were in concordance between bacteria adherent to both cell types, there were a considerable number of open reading frames that were differentially regulated in only one system (59 genes specific for HEp-2 and 35 genes specific for HBMEC). Quantitative RT-PCR analyses confirmed the microarray observed regulation for several selected ORF´s. Subsequently, the function of the upregulated genes rfaF, hem and NMB1843 was investigated by construction of mutants. The rfaF gene, encoding a heptosyl-2-transferase involved in LPS biosynthesis, were detected as being differentially regulated in both cell systems. Disruption of the rfaF gene in meningococcal strain MC58 resulted in a significantly increased adhesion and invasion to epithelial cells in particular for the capsulated mutant. Investigations of the infection potential for HBMEC cells did not result in a significant change in adherence and invasion pattern. The additional deletion of the rfaF gene in an opc negative strain leads to a significantly decrease in the bacterial uptake for HBMEC cells. Compared to HBMEC, opc, rfaF mutants showed no differences in internalisation after contact with HEp-2 cells. Moreover rfaF deficient meningococci demonstrated enhanced sensitivity to normal human serum (NHS). These data provide evidence that the LPS structure plays a role in the bacterial cell interaction, particularly if an important adhaesive structure is absent. The ORF NMB1843, which encodes a transcriptional regulator of the MarR family, as well the hemolysin gene, were detected as being upregulated only after contact with endothelial cells. Using infection assays, no changes were detected in the adherence and invasion pattern for hem mutants. Furthermore the cytotoxic potential of the mutants was not different from the parental strains. Therefore it remains to be clarified whether the ORF NMB1646 actually act as a hemolysin. Microarray studies for the NMB1843 mutants showed some ORF´s, which possibly are under control of this regulator, for example the virulence genes sodC, iga and nadA as well as the hemolysin coding gene NMB1779. The analysis of the expression profile by SDS-PAGE led to the identification of a 210 kDa protein, which is specific for the NMB1843 negative strains. This unknown protein was identified as nadA. NadA evokes a strong antibactericidal antibody response in laboratory animals. For this reason NadA is regarded as a good vaccine candidate. The data represented in this study provide new insight into the pathogenicity mechanisms of N. meningitidis and could demonstrate the importance of gene regulation on the trancriptional level during different stages of meningococcal infection.

The relationship between leaf and its environment has resulted in a tremendous diversification of leaf shape within and between plants species, which is important to cope with the differing environmental conditions. Arabidopsis lyrata is a prime model plant that shows leaf shape variation within species and between related species. In Cardamine and Capsella, the RCO genes (homeodomain leucine zipper family transcription factors) are involved in shaping leaves, yielding more complex shaped leaves (leaflets). In A. thaliana, over the course of evolution, the RCO-A and RCO-B paralogous genes have been deleted that led to the loss of lobes (leaf simplification). Based on previous quantitative trait locus (QTL) mapping results, these gene family members are thought to control leaf shape variation also in A. lyrata. Since the paralog involved in leaf shape variation is unknown, both copies of the RCO genes (AL6G13350 and AL6G13360) were sequenced. The study aimed to identify whether DNA sequence variation exists in the two paralogous RCO genes, which could explain the phenotype variation both within population and between A. lyrata populations, along with related species A. arenosa. The results showed limited variation in the coding regions in the form of indels, single nucleotide polymorphisms (SNPs) and amino acid substitutions resulting in no significant difference in phenotype between genotype (p>0.139). The most variants were rare and increasing the number of individuals within the populations, to cover the full phenotypic spectrum, may lead to different results. Not being able to obtain the nucleotide sequence of the promotor region, further analysis is required since it is an important region for gene expression, which could explain phenotype variation for leaf shape in Arabidopsis lyrata.

Um chromosomale Veränderungen zu untersuchen, die mit dem metastatischen Phänotyp assoziiert sind, zu identifizieren, wurde die Comparative Genomische Hybridisierung (CGH) an Plattenepithelkarzinomen der Lunge durchgeführt. Der statistische Vergleich zwischen metastasierten und nicht-metastasierten Tumoren legte nahe, daß Deletionen von 3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q26, 8p21-p23, 10q und 21q22 sowie DNA-Gewinne bei 1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13 und 15q11-q13 signifikant mit der Metastasierung assoziiert waren. Ausgedehnte Allelotypisierungsstudien konnten 3 minimale Deletionsregionen auf Chromosom 10q nachweisen. Die Untersuchung der Kandidatengene PTEN/MMAC1, MXI1 und DMBT1 in diesen Bereichen war jedoch negativ. Zur Identifizierung neuer Kandidatengene in der Lungenkrebs-Progression zu identifizieren, wurde die Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH) eingesetzt. Der Expressionsvergleich einer metastasierten Adenokarzinomzellinie mit einer Primärkultur normaler Lungenepithelzellen resultierte in der Klonierung von 2 cDNA-Bibliotheken mit insgesamt 752 Klonen, welche sequenziert und im Northern Blot auf differentielle Expression untersucht wurden. In weniger als 40% zeigten sich Homologien zu bereits bekannten Genen. Die weitere Analyse eines unbekannten cDNA-Fragmentes führte zur Klonierung und Charakterisierung eines neuen Genes, welches das humane Calcyclin-bindende Protein kodiert, auf Chromosom 1q24-q25. Die Überexpression dieses Genes in Lungenkarzinomzellinien sowie die Aufdeckung intra- und interchromosomaler Rearrangements mittels Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung (FISH) weist auf eine mögliche Bedeutung in der Progression von Lungenkarzinomen hin. / To identify chromosomal imbalances associated with the metastatic phenotype Comparative Genomic Hybridization (CGH) was applied to squamous cell carcinomas of the lung. The comparison of metastatic and non-metastatic tumors suggested that deletions of 3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q26, 8p21-p23, 10q, and 21q22 as well as DNA gains of 1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13, and 15q11-q13 were significant associated with the metastasis formation. Extensive allelotyping studies revealed 3 minimal deleted regions of chromosome 10q. The mutational analysis of the three candidate genes PTEN/MMAC1, MXI1, and DMBT1 located near these regions was negative. To isolate new candidate genes involved in lung cancer progression suppression subtractive hybridization (SSH) was used. The comparison of the expression pattern of a metastatic lung adeno carcinoma cell line with a primary culture of normal airway epithelial cells resulted in the cloning of 752 cDNA fragments which were sequenced and investigated by Northern blot hybridization. The sequence comparison showed homology to known genes in less than 40%. The further investigation led to the cloning and characterization of a new gene encoding the human Calcyclin-binding protein on chromosome 1q24-q25. The gene was overexpressed in a panel of lung cancer cell lines and showed intra- and interchromosomal reaarangements using fluorescence in situ- hybridization (FISH) suggesting the involvement of this gene in lung cancer progression.

The postglacial recolonization of northern Europe supposedly originated from Western Europe and the Russian Plain, however, recent molecular and macrofossil-based investigations suggest that the history may be more complex than previously thought. This study aims to investigate the genetic diversity and population structure of Scots pine from Scandinavia to Russia to re-evaluate its recolonization history, and to examine whether the pattern of spatial genetic diversity has any adaptive significance. Populations ranging from Norway to Russia were sampled and genotyped using genotyping-by-sequencing. The seedlings were freeze tested to provide an average degree of hardiness for every population. Eight hundred and thirty-two seedlings were analyzed, and 6,034 SNPs were recovered in these individuals after stringent filtering. Population structure was investigated using fastStructure and differentiation between populations was estimated with pairwise FST and analysis of molecular variance (AMOVA) to assess the genetic variability. Genetic diversity was measured as observed heterozygosity, H0, in populations, clusters and overall. Two genetic clusters were detected in the samples, one in Norway and Sweden and one in Russia. These clusters are weakly differentiated (FST = 0.01202) with only 0.66 % variation between them. Highest variation was found within populations (98.8 %) and the overall genetic diversity for all populations was high (Ho = 0.2573). The weak differentiation and high diversity are indicative of extensive gene flow between populations in this species. The composition of the clusters across the sampled area suggests a westward recolonization from the Russian Plain into Scandinavia, and a possible local origin of another polymorphism in Norway and Sweden. No clear relationship between cold hardiness and genetic variation was detected. The clinal variation in cold hardiness reflects local adaptation, and the difference between genetic and phenotypic variation is likely due to epigenetic regulation or polygenic inheritance. More extensive genome scan is needed to understand the genetic basis of local adaptation.

In den histopathologischen Mustern III und IV nach Lucchinetti et al. 2000 ist die Anzahl der Oligodendrozyten in MS-Läsionen deutlich reduziert. Zugleich findet man in diesen Subtypen eine vermehrte Expression von p53. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit zu untersuchen, ob das vermehrte Vorkommen von Sequenzveränderungen im p53-Gen ursächlich für die vermehrte p53-Expression in Oligodendrozyten der MS-Plaques sein könnte. Dazu wurden DNA-Proben von MS-Patienten und gesunden Kontrollen mittels PCR-SSCP untersucht, verglichen und ggf. sequenziert. Dabei fand sich mit Hilfe der angewendeten Methoden kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Kollektiven. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben nichtsdestotrotz Anlass zu vermuten, dass p53 in einigen histologischen Subtypen der MS - in welcher Form auch immer - an der Pathogenese oder dem Untergang von Oligodendrozyten in MS-Läsionen beteiligt zu sein scheint. Die gefundene erhöhte Expression ist in ihrer Ätiologie bislang noch nicht geklärt. Dennoch könnten weitere Untersuchungen p53-abhängiger Mechanismen, die zu einer Zerstörung von Myelin/Oligodendrozyten führen, einen Beitrag zur Entwicklung neuer Therapiestrategien leisten. Sowohl neue immunmodulatorische als auch neuroprotektive Therapien erscheinen in diesem Zusammenhang denkbar. / Clinical course, outcome, radiological features, severity, and histopathology are heterogenous in multiple sclerosis (MS). Since MS is considered to be a polygenic disease, the genetic background may at least partly be responsible for this variability. Some MS cases are histopathologically characterized by a dramatic oligodendrocyte loss that is in part caused by apoptosis. A dysregulated apoptotic elimination of self-reactive T cells may also contribute to disease susceptibility. To analyze genetic differences in the apoptosis regulating factors p53 we investigated polymorphisms of these gene in 105 patients with a relapsing remitting disease course, 49 patients with a primary progressive course and 100 controls by PCR-SSCP and direct sequencing. We identified so far unpublished sequence alterations in the promotor region of the in exon 7 of the p53 gene.. No differences were observed between MS patients and controls. Additional known polymorphisms were found in exon 6 of the p53 gene. No significant differences in the frequency of gene sequence variations were found between MS patients and controls. The apoptosis gene studied here therefore appear less likely to be important effector genes in MS.

Das Studium der Entwicklung von Tieren ist eine der ältesten Disziplinen in der Biologie. Die gesammelten Daten von unzähligen Untersuchungen an den verschiedensten Spezies wurden dazu benutzt, um ein generelles Verständnis des tierischen Lebenszykluses zu formulieren. Ein wichtiges Ergebnis der intensiven Untersuchungen war vor etwa einem Jahrhundert die Entdeckung spezifischer morphologischer Veränderungen, die sich während der Teilungsphase, der Zeitperiode die der Befruchtung und Aktivierung des Eies am Anfang der Embryogenese folgt, vollziehen. Diese Befunde führten schlussendlich zur Formulierung des Konzepts einer „Mid-Blastula Transition“ (MBT). Bisher gibt es nur eine Theorie die die Regulierung der MBT in befriedigender Weise erklärt. Dies ist das Model des Kern/Plasma-Verhältnis, welches sich aus dem Verhältnis DNA-Menge zu Zytoplasmavolumen ableitet. Es erklärt die MBT-Aktivierung durch bisher unbekannte, maternal deponierte Faktoren im Ei, welche die MBT Aktivierung kontrollieren, deren Konzentration allerdings mit jeder Zellteilung verdünnt wird, bis sie schließlich ihre blockierende Funktion verloren haben. Zwar wurde die Existenz dieses Mechanismuses schon in zahlreichen Spezies experimentell bewiesen, allerdings bleibt er nur eine ungenaue Beschreibung der ablaufenden Prozesse und lässt weiterhin viele Fragen unbeantwortet. Vor diesem Hintergrund hat diese Arbeit gezeigt, dass die Zellzyklen in Embryonen von Medaka (Oryzias latipes) ihre Synchronität schon nach dem vierten oder fünften Teilung verlieren, und diese durch ein Teilungsmuster ersetzt wird, das als „metasynchron“ bezeichnet wird. In diesem Teilungsmuster verlaufen die Zellteilungen in Wellen, die im Zentrum des Embryos beginnen und sich von dort nach außen hin radial ausbreiten. Noch ist der Sinn einer auf diese Art verlaufenden Zellteilung unbekannt, auch wenn es verschiedene Theorien gibt die versuchen den zugrunde liegenden Mechanismus zu erklären. Allen voran steht die Theorie eines unterschiedlichen Zugangs zu Faktoren innerhalb des Dotters. Allerdings wird diese Theorie durch die Beobachtungen in verformten Embryonen wiederlegt, in denen sich die Teilungswellen von einer Seite des Embryos zur gegenüberliegenden Seite ausgebreitet haben. Somit bleibt der Mechanismus für diese Art der Zellteilung weiterhin unklar. Nicht zu vergessen ist, dass diese deformierten Embryonen eine der möglichen Konsequenzen asymmetrischer Furchung während einer frühen Zellteilung sind. Asymmetrische Teilungen treten in Medaka in einer erheblichen Anzahl von Embryonen auf und haben einen direkten Einfluss auf die gleichmäßige Verteilung des Zytoplasma. Leider war es nicht möglich die Auswirkungen einer solchen ungleichmäßigen Verteilung aufzudecken, auch wenn man davon ausgehen kann, dass ein ausreichend großes Ungleichgewicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten der MBT-Aktivierung in verschiedenen Zellgruppen führen müsste. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits in anderen Spezies gemacht, und es wurde vermutet, dass diese in ungleichmäßigen Zellteilungen begründet lagen. Weiterhin wurde bewiesen, dass die zygotische Transkription schon wesentlich vor dem bisher angenommenen frühesten Zeitpunkt aktiv ist. Darüber hinaus wurden Hinweise gefunden, die darauf hindeuten, dass die Transkription in Embryonen von Medaka in zwei Schritten einsetzt. Der erste Zeitpunkt ist das 16-Zellen-Stadium, in dem die ersten Zellen identifiziert wurden, die Phosphorylierung für RNAPII zeigten, und der zweite das64-Zellen Stadium, in dem der Anteil an p-RNAPII positiven Zellen signifikant anstieg. Ein schrittweiser Anstieg der Transkription wurde bereits in anderen Spezies beobachtet, auch wenn in diesen Fällen nur eine Erhöhung der mRNA-Menge festgestellt wurde, und nicht die unterschiedliche Anzahl an transkriptionell aktiven Zellen untersucht wurde.Zusammenfassend bestätigen und erweitern die hier gezeigten Daten die grundliegenden Kenntnisse über die Prozesse vor und währen der MBT, liefern darüber hinaus aber auch Anzeichen für viele Prozesse vor und während der MBT, die nur wenig oder gar nicht verstanden sind. / The study of animal development is one of the oldest disciplines in the field of biology and the collected data from countless investigations on numerous species have formed a general understanding of the animal life-cycle. Almost one century ago, one consequence of these intense investigations was the discovery of specific morphological changes that occur during the cleavage phase, a period that follows fertilization and egg activation at the very beginning of animal embryogenesis. These observations resulted into the formulation of the concept of a midblastula transition (MBT). So far, the mechanism of the nucleo-cytoplasmic ratio model is the only one that explains MBT regulation in a satisfying way. It suggests that the MBT is controlled by several maternal repressive factors in the egg, which are titrated out by every cell division until they lose their repressing potential. Although this regulatory mechanism was proven for several species and in different approaches, it is still only a rudimentary model for MBT control and leaves numerous questions unanswered. On this conceptual background, this thesis has shown that embryos from the medaka fish (Oryzias latipes) lose their cell cycle synchrony already after the fourth or fifth round of cell divisions, and replace it by a metasynchronous divisions pattern, in which cell division occurs in clear waves beginning in the embryo's center. The reason for this change in division mode is still unknown, although several hypotheses were put forward, most notable a difference in yolk-access between cells. However, this theory was weakened by division waves that progressed from one embryonic pole to the opposing one, which were occasionally observed in deformed embryos, leaving the mechanism for this phenomenon furthermore unclear. Those deformed embryos were most likely the result of asymmetric cell divisions at very early stages, a phenomenon which occurred in a significant percentage of medaka embryos and which directly influenced the equal distribution of cytoplasmic material. It could not beuncovered what kind of effects this unequal distribution of cytoplasm exerted on the progression of embryonic development, but it can be argued that relevant differences in cell volumes could result in cell clusters that will enter MBT at different time points. Comparable observations were already made in other species and it was hypothesized that they were the direct results of early unequal cell cleavages. Finally, it was demonstrated that zygotic transcription in medaka embryos is activated prior to the hitherto assumed time of the first transcriptional initiation. Moreover, indications were found that strongly speak for a transcriptional activation that occurs in two steps; a first step at the 16-cell stage when first cells were identified positive for RNAPII phosphorylation, and a second step at the 64-cell stage, when the number of p-RNAPII positive cells significantly increased. A stepwise activation of zygotic transcription was already observed in other species, but only for the overall increasing amount of mRNAs and irrespective of the actual number of transcriptionally active cells within the embryos. .. Overall, these data confirm and expand the basic knowledge of pre-MBT embryos and about the MBT itself. Furthermore, they also suggest that many early processes in pre-MBT embryos are only rudimentarily understood or still totally unknown.

Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern. / Discrimination between self and nonself is a major challenge during a specific immune reaction. Pathological alterations of this fine boundary can cause severe autoimmune diseases, such as Diabetes Mellitus, Rheumatoid Arthritis or Multiple Sclerosis. In order to prevent unwanted (auto-) immune reactions, several mechanisms of peripheral tolerance exist. Transcription factors, including ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells), and Foxp3 (forkhead box protein p3), are critical components thereby. Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) are specialized immune-suppressive lymphocytes and inhibit the activation of conventional immune cells. One mechanism of Treg-mediated suppression is the transfer of cyclic adenosine-monophosphat (cAMP) from Treg cells into conventional T- and B-lymphocytes. Elevated concentrations of cAMP induce the transcription and subsequent nuclear translocation of ICER. The transcriptional repressor ICER arrests expression of NFAT-regulated genes and even the induction of the short NFATc1/αA-isoform. Upregulation of NFATc1/αA is a hallmark of activated effector cells, controlling their transcriptional program. Foxp3 is essential for the development and function of thymus-derived nTregs as well as peripheral (TGFβ-) induced iTregs. The Foxp3-gene is regulated in iTregs – but surprisingly not in nTregs – by NFAT-factors. Likewise, Foxp3 represses NFATc1/αA in a negative feedback loop and, thereby, controls both plasticity and function of immune-suppressive Treg cells. In addition, NFAT-proteins also affect antigen-presenting dendritic cells (DCs). While NFATc1 and NFATc2 influence differentiation and proliferation of DCs, NFATc3 is important for cytokine secretion and the subsequent T cell response. Taken together, these results show that the transcription factors ICER, NFAT, and Foxp3 exert specific functions in controlling both immunity and tolerance, the opposing „faces“ of the immune system. The appropriate transcriptional regulation of this ambivalent situation is a requisite to achieve optimal immune responses and, coincidentally, to prevent deleterious (auto-) immune reactions.