Orientador: Patricia Pasquali Parise-Maltempi / Coorientador: Thiago Gazoni / Banca: Vanessa Bellini Bardella / Banca: Cintia Pelegrineti Targueta de Azevedo Brito / Resumo: Dados citogenéticos de Proceratophrys ainda são escassos na literatura quando comparados a alguns outros grupos de anuros, e são restritos atualmente às espécies P. boiei, P. appendiculata e P. renalis, que possuem um número diploide de 2n = 22 cromossomos e Região Organizadora de Nucléolo (RON) localizada no par 8, além de um padrão incomum de distribuição da heterocromatina constitutiva nos cromossomos de P. boiei, que apresentam grandes blocos heterocromáticos, além de um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ:ZW. A maioria dos genomas eucarióticos são compostos por grandes porções de sequências de DNAs repetitivos que estão localizadas principalmente na heterocromatina altamente compactada, e em muitos casos, é um dos componentes mais abundantes dos cromossomos sexuais. Nesse sentido, o grupo dos Proceratophrys torna-se interessante alvo para análises citogenéticas juntamente com a aplicação de ferramentas moleculares e genômicas, as quais podem contribuir no entendimento da evolução e diversidade de DNAs repetitivos, e com isso explorar discussões em relação a diferenciação de cromossomos sexuais. Portanto, o objetivo deste estudo foi analisar citogeneticamente a espécie P. boiei, sob o ponto de vista clássico e genômico, em busca de sequências repetitivas, avaliar a presença dessas sequências e buscar entender a sua organização no genoma dessa espécie. Ainda, o trabalho teve como objetivo descrever citogeneticamente outras espécies de Proceratophrys, aumentando a amo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cytogenetic data from Proceratophrys are still scarce in the literature when compared to some other groups of anurans, and are currently restricted to the species P. boiei, P. appendiculata and P. renalis, which have a diploid number of 2n = 22 chromosomes and the Nuclear Organizing Region (NOR) located in pair 8, in addition to an unusual pattern of distribution of constitutive heterochromatin in the P. boiei chromosomes, which present large heterochromatic blocks, as well as a system of ZZ:ZW sex chromosomes. Most eukaryotic genomes are composed of large portions of repetitive DNA sequences that are located primarily in highly compacted heterochromatin, and in many cases, is one of the most abundant components of sex chromosomes. In this sense, the Proceratophrys group becomes an interesting target for cytogenetic analysis along with the application of molecular and genomic tools, which may contribute to the understanding of the evolution and diversity of repetitive DNAs, and thereby explore discussions regarding the differentiation of sex chromosomes. Therefore, the objective of this study was to analyze the P. boiei species, from a classical and genomic point of view, in a search for repetitive sequences, evaluating the presence of these sequences and seeking to understand their organization in the genome of this species. In addition, the objective of this work was to describe cytogenetically other species of Proceratophrys, increasing the karyotype sample described in th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / El alcoholismo es un grave problema socio-económico. El costo asociado al abuso del alcohol se ha estimado en 1.300 millones de dólares para la economía chilena y en 185 billones para Estados Unidos, costo que se debe principalmente a la perdida de la productividad, tratamientos médicos y costos sociales. El etanol es metabolizado en el hígado en dos pasos. El primero depende de la enzima Alcohol deshidrogenasa (ADH) y el segundo de la enzima Aldehído deshidrogenasa (ALDH2). En individuos de la población asiática existe una alta prevalencia de una mutación en el gen de la ALDH2, por lo que tienen una capacidad reducida para metabolizar el acetaldehído, produciendo fuertes efectos como mareos, hipotensión, palpitaciones, etc. Esto resulta en un rechazo al consumo de etanol y protección frente al alcoholismo. Este fenómeno sugiere que la modulación de la expresión de la ALDH2 mediante tecnologías genéticas puede resultar en un fenotipo similar. Por lo tanto, la terapia génica se presenta como una alternativa atractiva para el tratamiento del alcoholismo, simulando el fenotipo asiático, mediante la inhibición específica de la enzima ALDH2, utilizando vectores virales codificantes de un shRNA como herramienta silenciadora. Los virus adeno-asociados (AAV) han sido utilizados como poderosas herramientas para la transferencia de genes en estudios in vivo, en modelos animales y en ensayos clínicos en humanos, con resultados prometedores. La única terapia génica aprobada en el mundo occidental para comercialización es Glybera y está formulada con vectores AAV. En este trabajo se utilizaron vectores scAAV2 que codifican un ALDH2 shRNA, para silenciar la expresión del gen de ALDH2 en líneas celulares humanas. Las líneas celulares HEK-293 y HepG2 se infectaron con el virus scAAV2/shRNA resultando en una reducción de la expresión de ALDH2 a nivel de RNA y proteínas en las dos concentraciones virales probadas (1x104 y 1x105 vg/cel) cada una probada en dos periodos de tiempos. En ambas líneas celulares los niveles de RNA de ALDH2 se redujeron en un 90% y la expresión a nivel proteico se inhibió en un 90% y 52% respectivamente, cinco días después de la infección. Las células HepG2 VL17A (ADH+) tratadas y expuestas a etanol mostraron un aumento de hasta el 50% en los niveles de acetaldehído. Estos resultados sugieren que la terapia génica puede ser una herramienta útil para el tratamiento del alcoholismo, a través del silenciamiento de la expresión de ALDH2 utilizando tecnología shRNA entregada las células por vectores AAV.

En la actualidad, la humanidad se ve enfrentada a dilemas que plantea el avance científico, tecnológico, biomédico, que afectan de cierta manera los derechos del hombre, el ordenamiento jurídico y la concepción ética de la vida. En el ámbito de los derechos humanos, la posible clonación humana significaría una violación de los dos principios fundamentales en los que se basan todos los derechos del hombre: el principio de igualdad entre los seres humanos y el principio de no discriminación El reciente descubrimiento del Genoma Humano y la posibilidad de la Clonación nos lleva a la discusión a estar o no de acuerdo con estas prácticas, la razón del rechazo radica en la negación de la dignidad de la persona sujeta a clonación y en la negación misma de la dignidad de la procreación humana. La investigación científica en beneficio del hombre representa una esperanza para la humanidad, encomendada al genio y al trabajo de los científicos, cuando tiende a buscar remedio a las enfermedades, aliviar el sufrimiento, para hacer que la ciencia biomédica mantenga y refuerce su vínculo con el verdadero bien del hombre y de la sociedad. Existen dos posiciones o formas de clonación que se enfrentan una a la otra, por un lado están aquellas que tienen fines terapéuticos y las otras que el objetivo es crear seres genéticamente idénticos. Por lo que clonación es un procedimiento técnico, producto de avanzadas técnicas de Ingeniería Genética, mediante el cual se obtiene un nuevo individuo a partir de una célula extraída de otro individuo ya existente e introducida en un óvulo previamente enucleizado, de modo que los clonados son idénticos al original. Al presenciar el avance científico de la clonación, el objetivo principal será regular la misma a fin de que esta se realice con el propósito de utilizar para el beneficio de la salud en la humanidad y porque no hacerlo si en estos casos de manipulación genética de embriones de humanos, en las investigaciones se emplean embriones desechados en tratamientos de fertilización in vitro. En cuanto a la Regulación de la Clonación podríamos indicar que todos los países están en contra de la clonación reproductiva por diversos aspectos éticos, jurídicos, morales, fuera de éste ámbito se esta comenzando a hablar de lo que es la clonación terapéutica, aquella destinada a curar enfermedades, los embriones antes del estadio pre – implantatorio no son personas ni hay vida humana, y que a todos los efectos jurídicos se le aplican las disposiciones aplicables a las cosas. Asimismo, las declararía cosas fuera del comercio

En el presente trabajo, se ahondó en el estudio de las diferencias entre las variantes intratípicas CVB1N y CVB1Nm con respecto a sus diferencias genómicas, replicativas ex vivo, in vivo, estructurales y en el uso de los receptores celulares.

El cromosoma humà 21 (HSA21), és el cromosoma autosòmic humà més petit. La trisomia total o parcial del HSA21 està associada a síndrome de Down (SD). El fet de tenir la seqüència del HSA21 pràcticament complerta, ha accelerat molt el procés d'identificació de gens, pas previ per a l 'establiment de relacions causa-efecte entre els gens del HSA21 i els fenotips clínics de la SD.L'objectiu final d'aquesta tesi és la identificació i caracterització de nous gens del HSA21. Els resultats obtinguts es poden resumir en :· S'ha participat en la construcció d'un contig de cosmidis de tres regions del HSA21, cobrint al voltant de 3 Mb. · S' ha participat en la construcció d'un mapa transcripcional de les tres regions. Es va realitzar una selecció de cDNAs, aïllant en total 45 cDNAs parcials no redundants, dels quals 25 no mostraven similitud amb cap seqüència de les bases de dades. Tots s'expressaven en una barreja de RNA poliA+ de cervell, pulmó, fetge i ronyó fetals. Els intents d'aïllar els cDNAs complerts corresponents a cada un dels clons varen resultar negatius. · S' ha aïllat un nou gen del HSA21, KCNE2, identificat inicialmente mitjançant una anàlisi computacional de la seqüència genòmica AP000052. El cDNA complert té 850 pb. KCNE2 codifica per a una proteïna de 123 aa amb elevada homologia a KCNE1, una subunitat ß de canals de potassi depenents de voltage. L'estructura genòmica té un únic exó codificant i mapa a 21q22.1. KCNE2 s'expressa com un RNA de 1.2 kb, majoritàriament a estómac. La seqüència de la proteína KCNE2 conté 2 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. En experiments de western amb extractes de cèl·lules de mamífer transfectades, la proteïna es detecta com a tres bandes entre 16 kDa i 20 kDa, essent la més petita la del pes molecular esperat. Experiments amb tunicamicina han demostrat que KCNE2 es glicosila en asparagines, in vivo. Es van generar dos mutants en els llocs consens de glicosilació, N6Q i N29Q, que han demostrat que ambdós llocs són susceptibles de ser glicosilats. Experiments d'immunofluorescència indirecta suggereixen que KCNE2 s'inserta en la membrana amb el seu extrem N-terminal cap al medi extracel·lular i que amb un únic residu glicosilat n'hi ha prou per integrar-s'hi. Experiments de RT-PCR semiquantitativa indiquen que no hi ha sobre-expressió en SD ni de KCNE1 ni de KCNE2, a cors fetals SD. Es van buscar mutacions a KCNE2 en pacients de sordesa no sindròmica i es va trobar un canvi de nucleòtid A22G, que dóna lloc a un canvi d'aminoàcid T8A. Aquest canvi afectaria el punt de glicosilació.· Es va identificar un nou gen, por homologia a KCNE1 i KCNE2, al qual se li va donar el nom de KCNE3. El cDNA complert té 1646 pb i conté una pauta de lectura oberta de 103 aa. L'estructura genòmica és similar a la de KCNE1 i KCNE2, amb un únic exó codificant, per tant podria tractar-se d'una família de gens paràlegs. KCNE3 es va mapar a la regió 11q13-14, utilitzant el pannell d'híbrids de radiació G3 d'Stanford. KCNE3 s'expresa com a un mRNA de 3 Kb a colon, intestí prim, ovari i a sang perifèrica. La seqüència de aminoácidos conté 3 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. S' ha demostrat que KCNE3 es N-glicosila en cèl·lules de mamífer i que s'inserta a la membrana amb l'extrem N-terminal dirigit cap al medi extracel·lular. S'ha trobat un polimorfisme T198C, que provoca el canvi d'aminoàcid F66L, amb una freqüència del 15% en la población general.

Es coneix com era post-genòmica els anys posteriors a la seqüenciació massiva dels genomes d'organismes i espècies superiors (entre elles la humana) i que ens permeten per primer cop, tenir una visió global dels mecanismes biològics que regulen la vida de cèl·lula. En aquests primers anys d'aquesta nova era, s'ha donat especial rellevància a la identificació i estudi funcional de motius de seqüència en el genoma, assumint la hipòtesi que la capa física (la molècula d'ADN) es un mer suport per a un codi que és interpretat per la cèl·lula. El treball exposat en aquesta memòria posa en relleu la importància del nivell físic de l'ADN (ja sigui en la molècula de doble hèlix o en estructures d'ordre superior), en tots els aspectes funcionals de la molècula. Els resultats exposats en les publicacions científiques que integren aquest treball es demostra la relació entre la estructura de l'ADN i les regions reguladores dels gens (els promotors). Es prova també la viabilitat de l'ús d'estructures no canòniques de l'ADN (com per exemple les triple hèlices) en teràpies anti-gèniques. Finalment es descriu la implementació d'una plataforma bioinformàtica que permet per primer cop, l'estudi dels factors fisicoquímics en escala genòmica. / The post-genomics era is known as the years before the massive sequencing of genomes (the human between others) and that allow us for the first time have a global vision of biological systems that regulates the cellular activity. The main studies of the first years of this new era prioritized the identification of sequence motives and the study of their functionality, assuming the hypothesis that the physical layer behind (the DNA molecule) is just a support for code that is interpreted by the cell.The work presented in this document highlight the relevance of the DNA physical layer (from the double helices to higher level structures and chromatin) in all the cellular aspects.The results of this thesis prove the relationship between DNA structure and gene regulatory regions (the promoters). The feasibility of using non-canonic DNA conformations (as DNA triple helices) in anti-gene therapies is also shown. Finally the implementation of a bioinformatics platform to study for the first time the physicochemical factors of DNA at genomics scale is described.

Dado o grande número de proteínas presentes em um organismo, as associações funcionais entre elas são estudadas através da teoria de redes, com intuito de verificar suas propriedades estatísticas. Diversos modelos de crescimento têm sido propostos para representar as redes de associação proteica. Estes buscam principalmente reproduzir uma distribuição de grau na forma de lei de potência. Entretando, a distribuição de grau das redes de associação proteica não é uma lei de potência pura e outras medidas da rede, como alta clusterização e assortatividade, também não são adequadamente reproduzidas por estes modelos. Neste trabalho procuramos reproduzir as propriedades topológicas das redes de associação proteica. Propomos um modelo baseado em premissas biológicas que considera como fundamental a topologia local da rede para determinar a regra de crescimento. Este modelo reproduz as principais medidas das redes de associação proteica, e a investigação da proposta topológica local pode contribuir para a compreensão biológica dos mecanismos de crescimento do genoma. / Given the large number of proteins in a living being, the functional associations between them are studied as networks, in order to verify its statistical properties. Many models of growing networks have been proposed to represent the protein association networks. These models try to reproduce a power law degree distribution. However, the degree distribution of the protein association networks are not a pure power law, and other measures, such as high clustering coefficient and assortativity, are not correctly reproduced by these models. In this work we try to reproduce the topological properties of protein association networks. We propose a biologicaly based model which considers the local network topology as a fundamental ingredient in determining the network growth rule. This model reproduces the essential measures of the protein association networks and the investigation of the local topology proposition may contribute to the biological understanding of the genome growth mechanisms.

Orientador: Guilherme de Camargo Ferraz / Coorientador: Amanda Piaia Silvatti / Banca: Adalgiza Souza Carneiro de Rezende / Banca: Rogerio Abdallah Curi / Banca: Fernanda Nascimento de Godoi / Banca: Paulo Aléscio Canola / Resumo: Considerando a importância nacional da raça Mangalarga Marchador (MM) e sua crescente internacionalização, estudos que avaliam diferentes aspectos de seus andamentos singulares, marcha batida (MB) e marcha picada (MP), são necessários. Os objetivos desse estudo foram descrever e comparar as variáveis cinemáticas (VCine) da MB e da MP e verificar associações entre as medidas morfométricas e as VCine de equinos da raça MM; avaliar a influência do alelo mutante do DMRT3 em homozigose (AA) ou heterozigose (AC) no padrão de movimento da MP; identificar, por meio de estudo amplo de associação do genoma (GWAS), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões genômicas que contenham possíveis genes responsáveis pelo fenótipo da MB na raça MM. Para análise cinemática, dezoito câmeras optoeletrônicas (240 Hz) foram posicionadas para a aquisição dos dados tridimensionais de três marcadores retrorreflexivos fixados no casco. Determinou-se duração, comprimento, frequência e velocidade de cada passada; dissociação relativa diagonal de decolagem e de apoio; e distribuição do tempo da passada em cada tipo de apoio (quadrupedal, tríplice, bipedal, monopedal e suspensão). Quarenta e oito cavalos pertencentes aos dois grupos de andamentos distintos: MP com genótipo AA e AC do SNP 22999655C>A (n=20) e MB com genótipo CC (n=28) foram analisados por meio do Equine SNP70 BeadChip e em seguida realizado GWAS. Para caracterização cinemática dos andamentos, os dados foram submetidos à analise desc... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Considering the national significance of the Mangalarga Marchador (MM) breed and its increasing internationalization, studies that evaluate different aspects of their singular gaits, marcha batida (MB) and marcha picada (MP) are necessary. The objectives of this study were to describe and compare the kinematic variables (VCine) of MB and MP and to verify associations between the morphometric measurements and the VCine of MM horses; to evaluate the influence of the mutant allele of DMRT3 on homozygous (AA) or heterozygosis (AC) in the MP movement pattern; to identify, through genome-wide association study (GWAS), single nucleotide polymorphisms (SNPs) and genomic regions containing possible genes responsible for the phenotype of the MB in MM breed. For kinematic analysis, eighteen optoelectronic cameras (240 Hz) were positioned to acquire the three-dimensional data of three retroreflective markers fixed to the hooves. Duration, length, frequency and speed of each stride; diagonal advanced placement and lift-off and support phases (quadrupedal, tripedal, bipedal, Monopedal and suspension) were determined. Fortyeight horses belonging to the two gait groups, MP with AA and AC genotypes of the 22999655C>A SNP (n = 20) and MB with CC genotype (n = 28), were analyzed using the Equine SNP70 BeadChip and then performed GWAS. For kinematic characterization of the gaits, the data were submitted to descriptive analysis. For comparison between females and males, and for comparison between... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo não disponível.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T14:33:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 756581 bytes, checksum: 1fd2b04358832c05c8ee23d442db0c7c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:33:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 756581 bytes, checksum: 1fd2b04358832c05c8ee23d442db0c7c (MD5) Previous issue date: 2005-02-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Na construção de mapas genéticos são usados vários tamanhos de população e número de marcas. Contudo, não se sabe a priori qual é o número mínimo de indivíduos e marcas a ser utilizado para a obtenção de mapas confiáveis. Desta forma, este trabalho, por meio da simulação de dados em computador, teve como objetivos o estudo de população RIL (Recombinant Inbred Line), buscando determinar: 1) a influência do número de indivíduos na população segregante sobre o mapeamento; 2) o efeito da saturação do genoma por marcas sobre o mapeamento e; 3) o número adequado de indivíduos a ser utilizado no mapeamento. Foram gerados três genomas com níveis de saturação de 5, 10 e 20 cM, com 231, 121 e 66 marcas, respectivamente. Cada genoma foi composto por 11 grupos de ligação, 100 cM cada. Para cada saturação do genoma foram geradas populações com 50, 100, 154, 200, 300, 500 e 800 indivíduos, com 100 repetições cada. Portanto, foram geradas um total de 2.100 populações. Estas populações foram mapeadas utilizando um LOD mín de 3 e freqüência máxima de recombinação de 30%. Dos mapas obtidos foram extraídas as informações: número de grupos de ligação e de marcas por grupo, tamanho de grupo de ligação, distância entre marcas adjacentes, variância das distâncias entre marcas adjacentes, inversão de marcas (dada pela correlação de Spearman) e grau de concordância das distâncias nos mapas com o genoma original (dada pelo estresse). População com tamanho igual ou superior a 100, 154 e 500 indivíduos, saturação de 5, 10 e 20 cM, respectivamente, levaram a formação de 11 grupos de ligação, em todas as repetições. Inversão na ordem de marcas e presença de marcas não ligadas foi maior tanto quanto menores foram os tamanhos de populações estudadas. A precisão na estimativa de distância entre marcas adjacentes foi maior tanto quanto maiores foram os tamanhos de população, independente do nível de saturação do genoma. Valores de estresse e variância reduziram significativamente com o aumento do tamanho de população. Concluindo, obtenção de mapas confiáveis a partir de população RIL deve, necessariamente, levar em conta o tamanho da população e número de marcas, uma vez que mapas com sérias distorções foram obtidos com utilização de populações de tamanhos insuficientes, mesmo com grande quantidade de marcas. Também, mapas com sérias distorções foram obtidos com o uso de pequena quantidade de marcas, mesmo com populações com grande número de indivíduos. Tamanhos mínimos de 100, 154 e 500 indivíduos foram necessários para a obtenção de mapas com o mesmo número de marcas por grupo de ligação do genoma original, nos casos de saturação de 5, 10 e 20 cM, respectivamente. / During the construction of genetic maps different population sizes and number of markers have been used by different authors. However, the minimum numbers of individuals and markers to be used in order to obtain reliable maps are not known. This work used data simulation aiming to determine: 1) the influence of population size; 2) the effect of genome saturation degree by markers and; 3) the adequate number of individuals to be used in the mapping of recombinant inbred line populations. Three genomes were generated with saturation levels of 5, 10 and 20 cM, each with 231, 121 and 66 markers, respectively. The genomes consisted of 11 linkage groups, each with 100 cM in length. For each saturation level, populations containing 50, 100, 154, 200, 300, 500 and 800 individuals were generated and for each population size 100 replications were analyzed. Thus, a total of 2,100 populations were generated. These populations were mapped using a LOD minimum of 3 and a maximum recombination frequency of 30%. From these maps the following variables were determined: number of linkage groups and number of markers in each group, length of the linkage group, distance between adjacent markers, variance of the distance between adjacent markers, inversion of markers (given by the Spearman correlation) and level of agreement between map distances and original genome distances (given by the stress). Population sizes equal to or greater than 100, 154 and 500 individuals in the saturation levels of 5, 10 and 20 cM, respectively, led the formation of 11 linkage groups, in all replications. As the population size increased, the inversion of markers and the presence of non-linked markers decreased, and the precision of the distance estimates between markers increased, independently of the genome saturation level. Values of stress and variance decreased significantly with the increase on the population size. In conclusion, the construction of reliable maps from RIL populations necessarily needs to consider the population size and the number of markers used, as maps with serious distortions were obtained from small sized populations, even using a large number of markers. On the other hand, maps with xserious distortions were obtained with a small number of markers, even using populations with a large number of individuals. The minimum sizes of 100, 154 and 500 individuals were necessary for obtaining maps with the same number of markers per linkage group of the original genome, in the cases of saturation level of 5, 10 and 20 cM, respectively.