Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:36:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_FabioTadeuArrojo_M.pdf: 6195877 bytes, checksum: 88704a1b2448dcb2851e78b62c37e6b9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A perda auditiva é a deficiência sensorial mais frequente em humanos, atingindo aproximadamente 10% de toda a população mundial. A restrição da comunicação pela expressão oral resulta em alterações no desenvolvimento cognitivo e psicológico do indivíduo afetado. Em países desenvolvidos, um a cada 500 indivíduos apresenta perda auditiva neurossensorial bilateral profunda/severa. Já nos casos de indivíduos com até 5 anos, a porcentagem é maior, atingindo 0,27% de 1000 indivíduos, número que se torna maior ainda nos casos em jovens, chegando a 0,35%. Dentre as causas da perda auditiva, mais de 60% dos casos de perda auditiva congênita são genéticos. Até o momento já se tem conhecimento de 150 loci e 103 genes envolvidos com a perda auditiva, sendo que a maioria deles apresenta, no mínimo, 20 alterações (mutações de ponto, deleções, inserções, etc.) que podem causar a perda. O gene que apresenta maior número de alterações é o GJB2, codificador da conexina 26, uma proteína relacionada a trocas iônicas intercelulares, mantendo a homeostase de potássio do sistema auditivo, essencial para a audição. Apenas este gene apresenta mais de 302 alterações confirmadas até o presente momento, sendo o principal gene relacionado aos casos de perda auditiva de origem genética. Tendo em vista a grande heterogeneidade clínica e genética da perda auditiva e a importância do diagnóstico molecular correto dos indivíduos que apresentam perda auditiva hereditária, o presente trabalho propôs padronizar um layout para diagnóstico através de genotipagens utilizando uma tecnologia 'high-throughput' baseada em PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real denominada TaqMan® OpenArrayTM Genotyping. Com esta, foi desenvolvido um layout das placas de genotipagem de OpenArrayTM, sendo possível analisar 32 alterações de 96 indivíduos simultâneamente por placa. Ao todo, foram analisados 376 indivíduos, sendo 94 deles controles ouvintes, totalizando 4 placas em duplicata. Todas as 31 alterações analisadas estavam presentes nos genes nucleares GJB2, GJB6, CRYL1, TMC1, SLC26A4, miR-96, OTOF e nos genes mitocondriais 12S rRNA e MT-TR1. As reações foram validadas posteriormente por técnicas previamente estabelecidas (sequenciamento direto, PCR Multiplex e RFLP-PCR) nos testes utilizados para o diagnótisco molecular da perda auditiva do Laboratório de Genética Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Ao total, foram realizadas 11.656 reações de genotipagem. Apenas 353 reações falharam, representando, aproximadamente, 3,03% das reações. Dentre as reações que falharam, estavam as amostras de nove indivíduos que não obedeciam aos requisitos mínimos de concentração, pureza e integridade do DNA para a realização dos experimentos. Com isso, calculou-se o rendimento médio das placas de genotipagem utilizando as placas de OpenArrayTM, que apresentou acurácia de, aproximadamente, 96,97%. Tais resultados comprovam a ótima acurácia, o baixo custo e a fácil reprodutibilidade da técnica, tornando este layout customizado para a plataforma TaqMan® OpenArrayTM Genotyping uma ferramenta ótima e confiável a ser empregada nos teste de diagnóstico molecular da perda auditiva no nosso país / Abstract: Hearing loss is the most common sensory deficit in humans, affecting approximately 10% of the entire world population. The restriction of communication by the oral expression results in changes in cognitive and psychological development of the affected individual. In developed countries, one in every 500 individuals has severe/profound bilateral sensorineural hearing loss. In cases of individuals with up to 5 years, the percentage is higher, reaching 0.27% of 1000 individuals, that number becomes even greater in cases where young people, reaching 0.35%. Among all the causes of hearing loss, more than 60% of congenital hearing loss is genetics. So far already aware of 150 loci and 103 genes involved in hearing loss, and most of them have at least 20 changes (point mutations, deletions, insertions, etc.) which may cause the loss. The gene that has the higher number of changes is the GJB2, encoding connexin 26, a protein related to ion exchange intercellular maintaining homeostasis potassium auditory system, essential for hearing. Only this gene has over 302 changes confirmed so far, being the main gene related to cases of hearing loss with genetic origin. Due to the great clinical and genetic heterogeneity of hearing loss and the importance of correct molecular diagnosis of individuals with hereditary hearing loss, this work proposes standardize a layout to the diagnosis by a genotyping technology using a high-throughput technique based on real-time PCR called TaqMan® OpenArrayTM Genotyping. With this, we customized a layout to the OpenArrayTM genotyping plates, being possible to analyze 32 changes of 96 individuals per plate simultaneously. Were analyzed 376 individuals, being 94 of them controls listeners, totaling 4 plates in duplicate. All 31 changes analyzed were present in the nuclear genes GJB2, GJB6, CRYL1, TMC1, SLC26A4, miR-96, OTOF and in the mitochondrial genes 12S rRNA and MT-TR1. Reactions were subsequently validated by previously established techniques (direct sequencing, multiplex PCR and RFLP-PCR), tests used for the molecular diagnostic of the hearing loss at Human Genetics Laboratory of the Center for Molecular Biology and Genetic Engineering (CBMEG), located at State University Campinas (UNICAMP). In total, 11.656 reactions of genotyping were performed using this platform. Only 353 reactions failed, representing approximately 3.03% of the reactions. Among the reactions that failed, were samples of nine individuals who did not meet the minimum concentration, purity and integrity of the DNA for the experiments. With this, was calculated the average income of the OpenArrayTM genotyping plates, which showed an accuracy of approximately 96.97%. These results and the comparative analysis of the costs among OpenArrayTM platform and the others molecular techniques demonstrated the great accuracy, low cost and easy reproducibility of the technique, making this layout customized for the platform TaqMan® OpenArrayTM Genotyping a good and reliable tool to be used in the molecular diagnostic of hearing loss in our country / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:43:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caminha_IsabelPereira_D.pdf: 4630571 bytes, checksum: d16d4c6474c6966dc1040d1c4185c4a5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A mutação germinativa p.R337H do gene TP53 está associada à alta incidência de tumores do córtex da adrenal (TCA) em regiões Sul e Sudeste do Brasil, onde as evidências indicam a ocorrência de efeito fundador. A alta frequência de relatos desta mutação no Sul do Brasil nos encorajou a desenvolver um método adequado para a detecção de mutações em larga escala, com o objetivo de determinar a incidência da p.R337H em uma população de São Paulo, o Estado mais populoso do Brasil. Um novo método foi desenvolvido a fim de detectar a mutação p.R337H em amostras armazenadas em papel filtro, utilizando PCR em tempo real. Amostras de DNA genômico de 34.344 recém-nascidos de uma região específica do Estado de São Paulo foram selecionadas para detectar a frequência desta mutação germinativa. PCR Alelo-específico e Nested-PCR foram utilizados para verificar a presença do haplótipo fundador brasileiro em recém-nascidos portadores da mutação. Entre as 34.344 amostras triadas, 75 foram identificadas como portadores da mutação p.R337H. Esta frequência (0,21%) é semelhante à encontrada na região Sul do Brasil. O haplótipo fundador brasileiro foi identificado em todos os pacientes em que a amostra foi adequada para esta análise. A distribuição da mutação mostrou-se heterogênea, sendo mais abundante em cidades da fronteira com o sul do Estado de Minas Gerais. Nossos dados indicam que a frequência encontrada na população analisada está próxima à encontrada em outras regiões do Brasil. Além disso, a presença do haplótipo fundador em todas as portadoras corrobora a hipótese de efeito fundador. Desenvolveu-se tecnologia adequada para triagem em larga escala, utilizando amostras coletadas em papel filtro. A identificação de portadores ao nascimento pode aumentar as chances de diagnóstico precoce, melhorando o prognóstico destes pacientes e alertando os membros da família sobre um aumento da susceptibilidade para outros tipos de câncer. Entretanto, estudos posteriores são necessários, por exemplo, para avaliar a ocorrência de câncer de adulto em portadores da mutação, bem como o impacto psicológico de um programa de triagem na população saudável e na grande maioria dos portadores, os quais não desenvolverão a doença / Abstract: The germline p.R337H mutation of TP53 gene is associated with high incidence of adrenocortical tumors (ACT) in South and Southeastern regions of Brazil, where evidence indicates the occurrence of founder effect. The high frequency of this mutation in Southern Brazil encouraged us to develop a suitable method for mutation detection on a large scale, aiming to determine the frequency of p.R337H in a population of the most populous state in Brazil, São Paulo. A novel method was developed in order to detect p.R337H mutation in samples collected on Guthrie card, using real time PCR. Genomic DNA samples from 34.344 newborns from a specific region of São Paulo State were screened for this germline mutation. Alelle-Specific-PCR and Nested-PCR Assays were used to verify the presence of the Brazilian founder p.R337H haplotype in newborn mutation carriers. Among the 34.344 screened samples, we found 75 carriers of the TP53 p.R337H mutation. This frequency (0,21%) is close to that found in Brazil Southern region. We identified the haplotype A3 in all patients in whom the sample was suitable for analysis. The distribution of the mutation was shown to be heterogeneous, being more abundant in cities bordering the south of Minas Gerais. Our data indicate that the frequency found in a population of the State of São Paulo is close to that found in other regions of Brazil. Furthermore, the presence of the founder haplotype in all carriers, support the hypothesis of founder effect. We developed an appropriate technology for large-scale screening, using samples collected on filter paper. The identification of patients at birth may increase the chances of early diagnosis, improving the prognosis of these patients and alerting family members about an increased susceptibility to other cancers. However, further studies are required, for example, to assess the occurrence of cancer in adult patients with the mutation as well as the psychological impact of a screening program in the healthy population and in most carriers, who do not develop the disease / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaClaraferraz.pdf: 1870286 bytes, checksum: d17e1fe96ee32ca1852c51743beff160 (MD5) Previous issue date: 2010-01-12 / The progress of Molecular Biology and Genetics provided the appearance of several molecular markers that detect the genetic polymorphism directly at DNA. Among these markers are the microsatellites (SSR), which are distinguished by their high degree of polymorphism. The use of these markers for individual genotyping has evolved into multiplex systems, which allow many SSR fragments to be detected and analyzed simultaneously. Currently there are several articles in literature discussing the criteria to be used in the primer design for use in PCR, as well as various softwares are available for this end. However, there are few studies and tools for the analysis of compatibility between pairs of primers for use in multiplex systems, where multiple fragments are simultaneously amplified using PCR. This paper evaluated different criteria for compatibility between pairs of primers. A set of 74 combinations of pairs of primers, involving the amplification of 94 SSR loci were evaluated in duplex systems. The same combinations were evaluated according to different criteria, including the degree of complementarity between primers, the magnitude of differences of denaturation temperatures (Tm) and the tendency to annealing between pairs of primers based on the Gibbs free energy resulting from the association between them. The comparison between the different criteria allowed the identification of a set of criteria with positive predictive value equal to 94%. These criteria were implemented for use in a software called Multiplexer, which from the analysis in sequence of pairs of primers, suggests compatible combinations for use in multiplex genotyping systems. Using this tool can significantly reduce the costs related to laboratory activities for genotyping using PCR. / Os avanços da Biologia Molecular e da Genética proporcionaram o surgimento de diversos marcadores moleculares que detectam o polimorfismo genético diretamente no DNA. Entre estes marcadores se encontram os microssatélites (SSR), que se destacam pelo seu elevado grau de polimorfismo. O uso desses marcadores para fins de genotipagem individual tem evoluído para sistemas multiplex, os quais permitem que vários fragmentos SSR sejam detectados e analisados simultaneamente. Atualmente são abundantes na literatura artigos que discutem os critérios a serem utilizados no desenho de pares de primers para aplicação em PCR, bem como estão disponíveis diversos softwares para este fim. No entanto, ainda são escassos os estudos e ferramentas destinados à análise de compatibilidade entre pares de primers para aplicação em sistemas multiplex, onde vários fragmentos são amplificados simultaneamente por PCR. Neste trabalho são avaliados diferentes critérios de compatibilidade entre pares de primers. Um conjunto de 74 combinações de pares de primers, envolvendo a amplificação de 94 locos SSR foram avaliados em sistemas duplex. As mesmas combinações foram avaliadas segundo diferentes critérios, incluindo o grau de complementariedade entre primers, magnitude das diferenças de temperaturas de desnaturação (Tm) e a tendência ao anelamento entre pares de primers com base na energia livre de Gibbs resultante da associação entre eles. A comparação entre os diferentes critérios permitiu a identificação de um conjunto de critérios com valor preditivo positivo igual a 94%. Estes critérios foram implementados para utilização em um software denominado Multiplexer, que a partir da análise de sequências de pares de primers, sugere combinações compatíveis para a utilização em sistemas de genotipagem multiplex. O uso dessa ferramenta pode reduzir consideravelmente os custos laboratoriais relativos às atividades de genotipagem utilizando PCR.

As leveduras do gênero Candida são responsáveis por 80% das infecções fúngicas sistêmicas. Nas Unidades de Terapia Intensiva, essas leveduras estão envolvidas em aproximadamente 17% das infecções. Essas doenças aumentam o tempo de hospitalização, resultando em aumento de gastos; além disso, as infecções sistêmicas causadas por Candida spp. apresentam elevada taxa de mortalidade. A candidemia representa grande parte das candidíases invasivas e sua epidemiologia pode variar de acordo com o local de estudo, práticas hospitalares e país estudado. Assim, o objetivo do presente estudo foi caracterizar 79 isolados de candidemia de pacientes internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto de junho de 2014 a novembro de 2015. Para isso, os isolados foram submetidos a testes de microdiluição em caldo para a determinação da Concentração Inibitória Mínima dos antifúngicos anfotericina B, caspofungina, fluconazol e voriconazol; testes para avaliar a produção de fatores de virulência: hemolisina, fosfolipase e proteinase; e genotipagem por Pulsed-field Gel Electrophoresis, Microsatellite Length Polymorphism e Multilocus Sequence Typing. Como esperado, C. albicans foi a espécie predominante (44%), seguida por C. glabrata (19%), C. tropicalis (19%), C. parapsilosis (14%) e C. orthopsilosis (4%). Os isolados, em geral, não apresentaram resistência aos antifúngicos testados. Entretanto, todos os isolados de C. glabrata e um isolado de C. parapsilosis apresentaram-se suscetíveis dose-dependentes ao fluconazol, três isolados de C. glabrata foram suscetíveis dose-dependentes à caspofungina, um isolado de C. albicans foi suscetível dose-dependente ao voriconazol e um isolado de C. albicans apresentou-se resistente ao fluconazol e voriconazol. Os isolados da espécie C. albicans foram os principais produtores de fatores de virulência. Os resultados dos testes de genotipagem indicaram a espécie C. glabrata apresentou menor variabilidade genética. A incidência de candidemia no período estudado foi de 1,52/1000 admissões e a taxa de mortalidade foi de 52%. O principal fator de risco foi antibioticoterapia (86%), seguido de sonda vesical (68%), acesso venoso central (60%), cirurgias (54%), nutrição parenteral (42%) e neutropenia (14%). Das doenças de base, o câncer sólido estava presente em 28% dos pacientes, seguido por diabetes (23%), doenças gastrointestinais (20%) e doenças hepáticas (15%). Finalmente, os resultados obtidos são úteis para o melhor entendimento do perfil da candidemia no hospital estudado e podem auxiliar na escolha da terapia empírica para essa doença / Candida spp. are responsible for 80% of all systemic fungal infections. In the Intensive Care Units, these yeasts are present in 17% of all infections. These diseases result in extended hospitalization, leading to increased hospital costs; besides, the systemic infections caused by Candida spp. are related to high mortality rates. Candidemia is the main invasive candidiasis and its epidemiology may vary among study location, local healthcare practices and studied countries. Therefore, the aim of this study was to characterize 79 bloodstream isolates from patients of the Hospital das Clínicas of Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, from June 2014 to November 2015. The Minimal Inhibitory Concentration of amphotericin B, caspofungin, fluconazole and voriconazole was determined using broth microdilution; virulence factor production was analyzed; and the strains were typed by Pulsed-field Gel Electrophoresis, Microsatellite Length Polymorphism and Multilocus Sequence Typing. As expected, C. albicans was the most predominant species (44%), followed by C. glabrata (19%), C. tropicalis (19%), C. parapsilosis (14%) and C. orthopsilosis (4%). In general, the strains did not show resistance to the tested antifungals. However, all C. glabrata and one C. parapsilosis isolates exhibited dose-dependent susceptibility to fluconazole, three C. glabrata isolates exhibited dose-dependent susceptibility to caspofungin, one C. albicans isolate was susceptible dose-dependent to voriconazole and one C. albicans isolate was resistant to fluconazole and voriconazole. Candida albicans strains were the main virulence attributes producer. C. glabrata isolates showed less genetic variability than the others studied species. The candidemia incidence was 1.52 per 1,000 admissions, and the mortality rate was 52%. The main risk factors were antibiotic therapy (86%), followed by urinary catheterization (68%), central venous access (60%), surgical procedures (54%), parenteral nutrition (42%) and neutropenia (14%). The most common underlying diseases were solid cancer (28%), diabetes (23%), gastrointestinal disease (20%) and liver disease (15%). Finally, the results are useful to bring a better comprehension of candidemia in the studied hospital and can help in the identification of efficient empirical treatment strategies

Temperamento em bovinos é definido como a reação dos animais em resposta ao contato com o ser humano, geralmente atribuído ao medo ocasionado no manejo. Animais agitados são mais difíceis de manejar nas fazendas. Estudos na literatura mostram que características de temperamento influenciam o desempenho produtivo dos rebanhos, devido à sua correlação com outras características dentre elas, ganho de peso diário, taxa de prenhez, qualidade e rendimento de carcaça. Todavia, estudos visando o melhor entendimento dos mecanismos biológicos, e da arquitetura genética destas características são escassos. Com a evolução das tecnologias de genotipagem em alta densidade com marcadores de polimorfismo único (SNP), observou-se um aumento de pesquisas nas áreas de seleção genômica (GS) e associação genômica (GWAS). Entretanto, devido ao alto custo que a genotipagem em larga escala apresenta, torna-se inviável a genotipagem para todos os animais candidatos à seleção. Porém, existe a possibilidade de utilizar painéis de baixa densidade de SNP e inferir estes genótipos desconhecidos para painéis de alta densidade. Neste contexto foram desenvolvidos dois estudos. No primeiro, o objetivo foi identificar regiões cromossômicas associadas com características de temperamento em animais da raça Nelore. As características avaliadas foram: velocidade de saída (VS) e mediana do escore composto (EC_mediana), em que 599 e 575 animais foram utilizados, respectivamente. Todos os animais foram genotipados com Illumina BovineHD BeadChip (800K), e para o GWAS dois modelos estatísticos foram aplicados. O primeiro modelo utilizado foi genômico de única etapa (ssGBLUP), em que os efeitos dos SNP são derivados da predição dos valores genéticos genômicos dos animais. O segundo modelo foi linear misto, similar ao modelo anterior, porém várias análises, SNP por SNP (regressão simples) foram realizadas. Nos dois modelos foram incluídos os efeitos de grupo de contemporâneo como fixo, idade do animal como covariável e efeito poligênico do animal e ambiente permanente como aleatórios. Os componentes de variância foram estimados pelo método de máxima verossimilhança restrita. Os coeficientes de herdabilidade apresentaram baixa magnitude com estimativas de 0,02 e 0,05 para VS e EC_mediana, respectivamente. Diferentes regiões cromossômicas foram associados com as características estudadas nesta população, de acordo com os modelos utilizados, contribuindo para o entendimento da arquitetura genética dessas características. No segundo, o objetivo foi avaliar a acurácia de imputação também nesta população, usando dois painéis de baixa densidade (3K e 6K) e um de média densidade (50K) imputados para o painel de alta densidade (800K). Os animais genotipados com 800K foram divididos em população de validação e população de referência. Na população de validação, os animais tiveram seus genótipos mascarados para os chips Illumina 3K, 6K e 50K. A imputação de 3K, 6K e 50K para 800K foi realizada utilizando os softwares de imputação fastPHASE e Beagle. O software fastPHASE apresentou maiores valores de acurácia de imputação em comparação ao Beagle. O painéis 6K e 50K apresentaram maiores valores de acurácia. / Temperament in cattle is generally defined as the reaction of an animal in response to contact with human, usually attributed to the fear. Animals agitated are harder to manage in farms. Studies in the literature reported that temperamental traits have been found to influence the productive performance of herds, due to its correlation with other traits such as carcass quality, daily gains, pregnancy rate and feed efficiency. However, almost nothing is known regarding the genetic landscape controlling temperamental animal variation in cattle. With the advances in genotyping technologies for high density genotyping platforms to markers of single nucleotide polymorphisms (SNP), there was an increase in research in the areas of genomic selection (GS) and genome-wide association studies (GWAS). However, genotyping many animals with a high-density marker panel can be expensive and economically unfeasible. An alternative in this context is to use a lower density marker panel on a larger number of animals, and impute the missing genotypes. In this context two studies were developed. In the first study, the objective was to identify chromosomal regions associated with temperament traits in Nellore cattle. The temperamental traits evaluated in this study were: exit velocity (VS) and the median score temperament (EC_mediana) assessed in 599 and 575 animals, respectively. All animals were genotyped with Illumina BeadChip BovineHD (800K), and two GWAS statistical models were applied. The first model used was genomic single step (ssGBLUP) in which the effects of SNP are derived from the genomic prediction values of the animals. The second was linear mixed model, similar to the previous model, but a series of models, one for each SNP (single regression), were performed. In both models were included the effects of contemporary group as fixed, the animal\'s age as a covariate effect and polygenic animal and permanent environment as random effect. Variance components were estimated by restricted maximum likelihood. The heritability coefficients showed low magnitude estimative of 0.02 and 0.05 for VS and EC_mediana, respectively. Different chromosomal regions were associated with the traits studied in this population, according with the models used, and moreover to contribute in the understanding of the genetic architecture of these traits. In the second study, the objective was to evaluate the accuracy of imputation in a same population, using two panels of low-density (3K and 6K) and one medium-density (50K) panel markers imputed up to higher density of 800K. The animals genotyped with 800K markers panel were split into a reference population and validation population. The validation population the animals had markers masked to Illumina chip 3K, 6K e 50K. Imputation from 3K, 6K and 50K up to 770K markers was performed using fastPHASE and Beagle. The software fastPHASE had higher imputation accuracy compared to Beagle. The 6K and 50K panels showed higher accuracy.

Recentemente, estudos de Genome Wide Association (GWA) identificaram uma nova região cromossômica, 18q22, como de susceptibilidade ao Diabetes tipo 1 autoimune (DM1A). Nesta região localiza-se o gene CD226, responsável por codificar uma molécula de adesão leucocitária (CD226) envolvida no processo de adesão celular, diferenciação de células T CD4+ virgens, citotoxicidade induzida por células natural killer (NK) e produção de citocinas. Até o momento, apenas o polimorfismo rs763361 A/G foi relacionado ao diabetes autoimune e pouco é conhecido quanto ao envolvimento de outras variantes do CD226, associadas a outras doenças autoimunes, na patogênese do DM1A. Com o objetivo de definir as variantes polimórficas relacionadas à susceptibilidade ao DM1A, às suas características fenotípicas e outras manifestações de autoimunidade, 532 pacientes diabéticos tipo 1A e 594 controles normais foram envolvidos neste estudo. Inicialmente, em um subgrupo de 106 diabéticos e 102 controles, as regiões codificadoras e flanqueadoras do gene CD226, obtidas do DNA genômico de leucócitos do sangue periférico, foram amplificadas pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase e submetidas à sequenciamento direto. Em uma segunda etapa, os polimorfismos rs763361, rs1788101 e rs727088 foram genotipados pelo ensaio TaqMan nos demais pacientes e controles. Resultados: foram identificadas 12 variantes no gene CD226, sete com frequência acima de 5%. Nenhuma variante nova foi encontrada. A variante rs727088 não estava em equilíbrio de Hardy Weinberg no grupo controle. Os genótipos AA da variante rs763361 e CC do rs727088 foram associados ao risco de DM1A e estavam em desequilíbrio de ligação. O genótipo do haplótipo ACAC, formado pelas variantes de risco, predominou nos pacientes diabéticos. Tanto o genótipo AA do rs763361 como o CC do rs727088 e o genótipo do haplótipo ACAC foram associados com menores valores de peptídeo C em pacientes com até dois anos de duração da doença. Nenhum polimorfismo influiu na presença de autoanticorpos pancreáticos e extra-pancreáticos. Conclusão: O genótipo AA da variante rs763361 do gene CD226 predispõe ao diabetes autoimune na nossa população, assim como a menores valores de Peptídeo C, contribuindo para a maior agressividade da doença. Dados da variante rs727088 devem ser analisados com cautela devido à falta de equilíbrio de Hardy Weinberg no grupo dos controles / Recently, Genome Wide Association (GWA) studies identified a new locus, 18q22, as a canditate to Type 1 A, or immune mediated diabetes (T1AD) susceptibility. This locus harbors the CD226 gene, responsible for encoding the leukocyte adhesion molecule (CD226) involved in cell adhesion, differentiation of naïve CD4+T cells, cytotoxicity induced by natural killer (NK) cells and cytokine production. Although just one single nucleotide polymorphism (SNP) rs763361 A/G had been related to T1AD, little is known about the involvement of new variants of CD226, implicated in other autoimmune disorders, in the pathogenesis of T1AD. In order to identify polymorphic variants related to T1AD susceptibility and their influences in phenotypic characteristics and other manifestations of autoimmunity, 532 type 1A diabetic patients and 594 health controls were enrolled in this study. Initially, in a subset of 106 diabetics and 102 controls, coding and flanking regions of CD226 gene obtained from genomic DNA extraction were amplified by polymerase chain reaction technique and subjected to direct sequencing. In a second step, the polymorphisms rs763361, rs727088 and rs1788101 were genotyped by TaqMan assay in the remaining patients and controls. Results: 12 variants in CD226 gene, seven of them with frequency above 5 % where identified. We did not found new variants. The variant rs727088 was not in Hardy Weinberg equilibrium in the control group. The genotypes AA (OR=1.45; p=0.005) and CC (OR=1.41; p=0.01) related to rs763361 and rs727088 variants respectively, were associated with risk of T1AD. Both predominated in female (p<0.01). Further, these variants were in linkage disequilibrium. The genotype haplotype ACAC formed by the risk variants was more frequent in patients with diabetes (30.5% x 25.6%; OR=1.42; p=0.014). The AA genotype of rs763361, the CC genotype and ACAC genotype haplotype were associated with lower levels of C-peptide in patients with no more than two years of disease course. The presence of pancreatic and extra-pancreatic autoantibodies was not associated with CD226 SNPs. Conclusion: The AA genotype of rs763361 variant of the gene CD226 predisposes to autoimmune diabetes in our population, as well as to lower levels of C-peptide, contributing to the aggressiveness of the disease. It predominated in female. Data of rs727088 variant should be analyzed with caution due to the lack of Hardy Weinberg equilibrium in the control group

Nesta dissertação, foi proposto o desenvolvimento de uma metodologia molecular por PCR em tempo real (qPCR) utilizando pool de DNA para a detecção de alelos que codificam antígenos importantes do sistema de grupo sanguíneo Diego. Esta ferramenta molecular será útil uma vez que são escassos os reagentes sorológicos para detecção desses antígenos e, quando existem, não permitem uma investigação em larga escala devido à pouca confiabilidade e alto custo. O sistema Diego (DI) possui 22 antígenos, sendo o antígeno Diª mais importante na prática transfusional. Eles são carreados pela proteína da Banda 3 que é proteína mais abundante na s hemácias, com 106 cópias. O antígeno possui uma maior prevalência, em indígenas americanos e asiáticos (6%-52%), já que é considerado um marcador antropológico de ancestrais mongóis; no entanto, a incidência desse antígeno tem aumentado dentre outras populações, como em caucasianos e afrodescendentes, e detectado em doadores de sangue, o que pode resultar em aloimunização de pacientes e dificultando o seu manejo terapêutico. Em contrapartida, a frequência do antígeno Dib em todas as populações é extremamente alta (>99,99%) e encontrar o raro fenótipo Di (a+b-) é ainda mais laborioso do que a busca pelo antígeno Diª. Sabe-se ainda muito pouco sobre a frequência dos antígenos Wrª e Wrb nas diferentes populações, mas estimase que a prevalência seja de 0,01% e >99,99% respectivamente. Foram utilizadas 410 amostras de doadores de sangue e 230 amostras de pacientes para genotipagem em qPCR utilizando pool de DNA para detecção dos alelos DI*01, DI*02, DI*02.03 e DI*02.04. A amplificação individualizada foi realizada quando a reação com pool demonstrou a amplificação de um dos alelos de interesse, DI*01 ou DI*02.03. Procedeu-se também com a clonagem dos alelos após à amplificação com as amostras controle, porém, ocorreu somente a clonagem dos alelos DI*02 e DI*02.03. Os fragmentos clonados apresentaram amplificação excelente e serão utilizados como controle positivo em testes moleculares futuros. Não foi possível a clonagem do DI*01 pelo problema da zigozidade da amostra controle. Houve 100% de concordância entre o resultado da genotipagem e as informações de fenotipagem das amostras controle. O alelo DI*01 ocorreu em 0,6% dos doadores de sangue e 1,7% em afrodescendentes, que corresponde a uma frequência genotípica DI*01/DI*02 de 1,2% e 1,3% respectivamente. Procedeu-se com as análises estatísticas comparativas entre o resultado desta pesquisa e de outras na população brasileira sobre os diferentes genótipos para entender se havia uma diferença estatística considerável. Ainda que a frequência para o genótipo DI*01/DI*02 seja mais baixa em doadores e mais alta em afrodescendentes do que o publicado em outros trabalhos brasileiros, a análise dos dados demonstrou que não havia diferença estatística com a maioria deles. A incidência aumentada do alelo DI*01 na população afrodescendente demonstra o aspecto da miscigenação. Conclui-se que a metodologia proposta funciona e tem aplicabilidade imediata em doadores de sangue e na busca de fenótipos raros. A incidência do alelo para Diª em doadores de sangue está abaixo do que um estudo anterior detectou em Ribeirão Preto (COZAC, 2004), que pode ser explicado pelas diferenças no censo populacional entre os estudos e pela coleta de amostra de universitários (62%). Não foram encontrados os genótipos DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 e DI*02.03/DI*02.04 nas populações estudadas. / This work proposed the development of a molecular methodology by Real Time-PCR (qPCR) using DNA pool for the detection of alleles that encode important antigens of the Diego blood group system. This molecular tool will be useful since the serological reagents for the detection of these antigens are scarce and, when they exist, do not allow a large scale investigation due to the low reliability and high cost. The Diego (DI) system has 22 antigens, the Diª antigen is the most important in transfusion practice. They are carried by the Band 3 protein which is the most abundant protein on the erythroid surface, about 106 copies. The antigen has a higher prevalence in american indians and asians (6%-52%), since it is considered an anthropological marker of Mongolian ancestors; however, the incidence of this antigen has increased among other populations, such as in caucasians and afrodescendants, and detected in blood donors, which may result in alloimmunization of patients and make difficult their therapeutic management. In contrast, the frequency of Dib antigen in all populations is extremely high (>99.99%) and finding the rare phenotype Di (a+b-) is even more laborious than the search for Diª antigen. The frequency of Wrª and Wrb antigens in different populations is not well-known, but it is estimated that the prevalence is 0.01% and >99.99% respectively. 410 blood donor samples and 230 patient samples were used for genotyping in qPCR using DNA pool to detect the alleles DI*01, DI*01, DI*02.03 and DI*02.04. The single amplification was performed when the pool reaction demonstrated the amplification of one of the alleles of interest, DI*01 or DI*02.03. The alleles were also cloned after the control samples amplification. Only the cloning of the DI*02 and DI*02.03 alleles occurred, they presented excellent amplification and will be used as positive controls in future molecular tests, it was not possible to clone DI*01 by the control sample zygosity though. There was 100% agreement between the genotyping results and the phenotype information of the control samples. The DI*01 allele occurred in 0,6% of the blood donors and 1,7% in afrodescendants, which corresponds to a genotypic frequency DI*01/DI*02 of 1,2% and 1,3% in respectively. The comparative statistical analyzes between this research results and others in the Brazilian population on the different genotypes was performed to understand if there was a considerable statistical difference. Although the frequency of the genotype DI*01/DI*02 is lower in donors and higher in afrodescendants than that published in other Brazilian studies, data analysis showed that there was no statistical difference with most of them. The increased incidence of the DI*01 allele in the afrodescendant population demonstrates the aspect of miscegenation. It is concluded in this work that the proposed methodology works and has immediate applicability in the screening of blood donors and search for rare phenotypes. The incidence of the allele encoding Di ª antigen in blood donors is below than previously detected in Ribeirão Preto (COZAC, 2004), which can be explained by the differences in the population census between the studies and by the sample collection of university students (62%). The genotypes DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 and DI*02.03/DI*02.04 were not found in the populations studied.

Acca sellowiana, known as feijoa or pineapple guava, is a Myrtaceae fruit tree species native to Uruguay and Brazil. The species stand out for its highly aromatic fruits, with nutraceutical and therapeutic value. Despite its agronomically promising valuable, genetics studies on this species are limited. Linkage genetic maps are valuable tools for genetic and genomic studies, and can be employed in breeding programs to support the development of molecular breeding strategies. The lack of a high number of polymorphic markers is one of the main limitation to development saturated genetic maps. Recently, novel genotyping methods based on next generation sequencing technology allow to detect and genotype thousands of markers in mapping populations. This represents a rapid and cost-effective strategy, remarkably useful for minor species with limited genomic resources. In this study, we constructed a high-density integrated genetic linkage map of A. sellowiana using two populations, H5 (\'TCO × BR\' , n = 160) and H6 (\'TCO × DP\', n = 184), which have the same female parent. Genotyping by sequencing (GBS) approach was used to simultaneously discover and genotype single nucleotide polymorphism (SNP) markers in both populations. Two strategies were carried out to identify SNP markers: a reference pipeline using the reference genome of the closely-related species Eucalyptus grandis, and a de-novo pipeline that do not require a reference genome. After quantitative genotype calling, 5,350 and 4,227 high quality SNP markers were selected for mapping in H5 and H6 populations, respectively. The two resulting maps of populations H5 and H6 comprised 1,236 and 1,302 markers distributed over the expected 11 linkage groups. The H5 and H6 maps spanned a map length of 1,593 cM and 1,572 cM, with an average inter-marker distance of 1:29 cM and 1:21 cM, respectively. A high degree of collinearity was observed between the two maps. In addition, a large proportion of markers were common to both maps and were used to construct the composite genetic linkage map. A novel approach to estimate recombination of two connected populations is described, where the meiosis information of all individuals is captured in a single estimator using a multipoint maximum likelihood estimation. The composite map consisted of 641 SNPs markers with a total map length of 1011 cM. This composite map represent the best consensus ordering of markers, a valuable reference framework for future studies in A. sellowiana. The large number of SNPs identified allowed us to construct high-density genetic maps, molecular tools which represent a relevant contribution for future genetic research and breeding efforts in A. sellowiana. / Acca sellowiana, conhecida como feijoa, pineapple guava ou goiabeira-serrana, é uma árvore frutífera nativa do Uruguai e do Brasil, pertencente a família Myrtaceae. A espécie destaca-se por suas frutas altamente aromáticas, com reconhecido valor nutracêutico e terapêutico. Apesar do promissor valor agronômico, os estudos genéticos nesta espécie são limitados. Os mapas genéticos são valiosas ferramentas em tais estudos, sendo empregados no desenvolvimento de estratégias de melhoramento molecular nos programas de melhoramento. No entanto, a falta de um elevado número de marcadores polimórficos nas populações de mapeamento é uma das principais limitações no desenvolvimento de mapas genéticos saturados. Recentemente, novos métodos de genotipagem baseados em tecnologia de sequenciamento de nova geração permitem identificar e genotipar milhares de marcadores em populações de mapeamento. Esta rápida e eficiente estratégia é muito útil para culturas pouco estudadas, com recursos genômicos limitados. Neste estudo, foram construídos mapas genéticos saturados em A. sellowiana. Foram usadas duas populações de mapeamento, H5 (\'TCO × BR\', n = 160) e H6 (\'TCO × DP\', n = 184), conectadas geneticamente pelo mesmo genitor feminino. A estratégia de genotipagem por sequenciamento (genotyping by sequencing; GBS) foi usada para simultaneamente identificar e genotipar marcadores de polimorfismos de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism; SNP) em ambas populações. No processo de detecção de SNPs, duas estratégias foram implementadas: na primeira foi empregado o genoma de referência de especie relacionada Eucalyptus grandis; na segunda, foi empregado uma abordagem de novo, que não requer genoma de referência. Após o processo de genotipagem quantitativo, 5350 e 4227 SNPs de alta qualidade foram selecionados para mapeamento em H5 e H6, respectivamente. Os mapas integrados H5 e H6 compreendem 1236 e 1302 marcadores distribuídos no 11 grupos de ligação esperados. Os mapas genético abrangeram um comprimento total de 1593 cM e 1572 cM, com uma distância média entre marcadores de 1:29 cM e 1:21 cM, nas populações H5 e H6, respectivamente. Um alto nível de colinearidade foi observado entre os dois mapas. Além disso, uma grande proporção de marcadores foram mapeados em ambos mapas e posteriormente usados na construção de um mapa genético integrado, considerando a informação de ambas populações simultaneamente. Foi apresentada uma nova abordagem para estimar as frações de recombinação em duas populações conectadas, onde a informação das meioses de todos os indivíduos é capturado num único estimador, usando uma estimativa de máxima verossimilhança multiponto. O mapa integrado composto contém 641 marcadores SNP com um comprimento total de 1011 cM. Este mapa representa o melhor ordenamento consenso de marcadores, sendo una valiosa referencia para futuros estudos nesta espécie. O grande número de SNPs identificados permitiu-nos a construção de mapas genéticos de alta densidade, ferramentas moleculares que representam uma contribuição relevante para futuras pesquisas genéticas e avanços no melhoramento genético em A. sellowiana.

In this study we used Next-generation sequencing \"NGS\" for DNA and RNA sequencing to search for molecular markers associated with resistance of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) to insecticides and Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) proteins. For this purpose, we selected S. frugiperda resistant strains to insecticides (chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, lufenuron, teflubenzuron and spinosad) belonging to different chemical groups and to the YieldGard VT-PRO&reg; maize expressing Cry1A.105 and Cry2Ab2 proteins. The results of gene expression between resistant and susceptible strains of the neurotoxic insecticides chlorpyrifos and lambda-cyhalothrin demonstrated 935 differentially expressed genes associated with chlorpyrifos resistance and 241 differentially expressed genes associated with lambda-cyhalothrin. Most of these genes was related to high levels of expression in detoxification enzymes, especially the CYP3 and CPY6 families. Regarding to the insecticide teflubenzuron, the inheritance of resistance was characterized as autosomal, incompletely recessive and polygenic. The results of gene expression between resistant and susceptible strains of teflubenzuron indicated 3,519 differentially expressed transcripts, mainly detoxification enzymes from the GSTs, UGTs, P450s, CEs, as well as transport and regulation genes. This gene expression profile was also identified to YieldGard VT-PRO&reg; resistant strain, which also demonstrated changes in the expression levels of other gene groups such as cadherin, aminopeptidases and alkaline phosphatase. Finally, to identify SNP markers associated with resistance of S. frugiperda to insecticides and Bt proteins, we used a genotyping by sequencing (GBS) protocol to all resistant strains and the susceptible strain. A total of 4,276 SNPs was recovered after filtering processes, where 53 polymorphic loci under selection were statistically significant (FDR<=0.047) and none of them was associated with coding regions. However, several of these SNPs were associated with regulatory regions of the genome. Analyses using DAPC resulted in the formation of seven clusters, with the susceptible line being separated from all resistant strains. The resistant strain to chlorpyrifos presented an exclusive cluster separated from the other resistant strains, which were grouped together. The association analyses between susceptible and resistant strains indicated 17 loci associated with all resistant strains, 114 loci associated with resistance to chlorpyrifos, 105 to lambda-cyhalothrin, 84 to lufenuron, 87 to teflubenzuron, 108 to spinosad and 62 to YieldGard VT-PRO&reg; maize. Therefore, we can conclude that the resistance processes associated to insecticides and Bt toxins are due to a large number of molecular modifications at specific sites associated with detoxification and regulation processes. The use of technologies that allow for a systematic and comprehensive analyses of these phenomena, such as new-generation sequencing, large-scale molecular marker search, and functional studies with several insecticide groups should be the new research base to advance the knowledge on adaptive processes driven by the evolution of insect resistance to insecticides and Bt proteins. / Técnicas de sequenciamento de DNA e RNA de próxima geração foram utilizadas para identificar marcadores moleculares associados à resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a inseticidas e proteínas de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt). Para tanto, foram selecionadas linhagens de S. frugiperda resistentes a moléculas inseticidas (chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, lufenuron, teflubenzuron e spinosad) pertencentes a diferentes grupos químicos e ao milho YieldGard VT-PRO&reg; que expressa proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab2. Os resultados de expressão gênica entre as linhagens resistentes e suscetíveis aos inseticidas neurotóxicos chlorpyrifos e lambda-cyhalothrin, indicaram 935 genes associados à resistência a chlorpyrifos e 241 genes a lambda-cyhalothrin que foram diferencialmente expressos. A maior parte desses genes está relacionada a elevados nível de expressão de enzimas de detoxificação, principalmente das famílias CYP3 e CPY6. Com relação ao inseticida teflubenzuron, o padrão de herança da resistência foi caracterizado como resistência autossômica, incompletamente recessiva e poligênica. Os resultados de expressão gênica entre as linhagens resistente e suscetível a teflubenzuron indicou 3.519 transcritos diferencialmente expressos, principalmente de enzimas de detoxificação dos grupos GSTs, UGTs, P450s, CEs, além de genes de transporte e regulação. Esse perfil de expressão gênica também foi identificando na linhagem resistente ao milho YieldGard VT-PRO&reg;, o qual também demonstrou modificações nos níveis de expressão de outros grupos gênicos como caderina, aminopeptidases e alcalino-fosfatase. Por último, com a finalidade de identificarmos marcadores tipo SNP associados à resistência de S. frugiperda a inseticidas e proteínas Bt, o protocolo de genotyping by sequencing (GBS) foi utilizado para todas as linhagens resistentes mencionadas e a linhagem suscetível de referência. Foram recuperados 4.276 SNPs após os processos de filtragem, sendo identificados 53 locos polimórficos sob seleção estatisticamente significantes (FDR<=0,047), sendo que nenhum deles associado a regiões codificantes. No entanto, vários desses SNPs foram associados a regiões reguladoras do genoma. As análises utilizando DAPC resultou na formação de sete grupos, com a separação da linhagem suscetível de todas as linhagens resistentes. A linhagem resistente a chlorpyrifos apresentou um grupo exclusivo separado das demais linhagens resistentes, as quais permaneceram agrupadas. As análises de associação entre as linhagens suscetível e resistentes indicaram 17 locos associados a todas as linhagens resistentes, 114 locos associados à linhagem resistente a chlorpyrifos, 105 a lambda-cyhalothrin, 84 a lufenuron, 87 a teflubenzuron, 108 a spinosad e 62 ao milho YieldGard VT-PRO&reg;. Dessa forma podemos concluir que os processos de resistência associados a inseticidas e toxinas Bt são decorrentes de um grande número de modificações moleculares em sítios específicos associados a detoxificação e processos de regulação. Portanto, a utilização de tecnologias que possibilitem a análise sistêmica e ampla desses fenômenos, como sequenciamento de nova geração, busca de marcadores moleculares em larga escala e estudos funcionais com diversos grupos de inseticidas devem ser a nova base de pesquisa para avançar o conhecimento dos processos adaptativos impulsionados pela evolução da resistência de insetos a inseticidas e proteínas Bt.

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.