Agricultores envolvidos no cultivo do tabaco estão constantemente expostos a uma grande variedade de químicos. O uso de agrotóxicos em larga escala tem provocado danos à saúde destes trabalhadores assim como a manipulação das folhas de fumo úmidas, pois além de substâncias antropogênicas persistentes outros compostos orgânicos com potencial pesticida estão presentes nas folhas do tabaco. A nicotina, através do contato dermal com as folhas do fumo, tem causado um envenenamento agudo nos trabalhadores da lavoura. O conjunto de sintomas desta exposição é conhecido como doença da folha verde. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito genotóxico em fumicultores expostos ocupacionalmente a agroquímicos e nicotina. A instabilidade genômica, a morte celular, a dosagem de colinesterase, cotinina e marcadores de estresse oxidativo bem como o conteúdo de elementos traço foram analisados nas células destes trabalhadores. Para verificar a possível modulação de genes de suscetibilidade com os resultados dos biomarcadores, os polimorfismos dos genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2A6, PON, OGG1, RAD51, XRCC1 e XRCC4 foram avaliados. No primeiro momento, amostras de sangue periférico foram coletadas de 30 indivíduos expostos e de 30 indivíduos não expostos com o intuito de investigar o risco ocupacional em três diferentes períodos da safra de fumo (entresafra, aplicação intensa de pesticidas e na colheita da folha). Neste estudo foi observado aumento significativo de dano ao DNA, avaliado pelo ensaio Cometa, em fumicultores comparados ao grupo não exposto em todos os períodos da safra e, um significante aumento nas frequência de células micronucleadas na entresafra. Correlação entre idade e tempo de exposição em relação aos resultados do ensaio Cometa e do teste de MN não foi encontrado. O dano ao DNA foi maior em homens comparado a mulheres, mas diferença significativa foi observada apenas na entresafra. Não houve diferença na atividade da colinesterase entre os grupos estudados. Elevado nível de cotinina foi observado na colheita da folha de fumo, demonstrando exposição à nicotina. Em um segundo momento, amostras de sangue periférico e de mucosa oral foram coletadas de aproximadamente 111 agricultores em dois períodos da safra (na aplicação intensa de pesticidas e na colheita) e de 56 indivíduos não expostos. Os resultados destes testes demonstraram anomalias nucleares nas células de fumicultores expostas a misturas de substâncias com potencial genotóxico e citotóxico. Diferença nos resultados foi percebida entre os dois momentos da safra de fumo investigados. Modulação no dano ao DNA e na morte celular em células da mucosa oral foi observada nos genes PON1 e CYP2A6. Diferença entre gênero e tempo de exposição não foi encontrada nos diferentes parâmetros analisados. Houve correlação entre idade e os resultados obtidos no teste de MN em linfócitos no grupo não exposto e no momento da aplicação de pesticidas. Em relação ao uso do equipamento de proteção individual, diferença na frequência de MN no momento da aplicação de pesticidas foi observada. Dos nove marcadores de suscetibilidade estudados, somente GSTM1 nulo e CYP2A6*9, demonstraram associação com os resultados obtidos pelo teste de MN em linfócitos. Diferença na atividade da colinesterase e nos níveis de cotinina não foi observada em relação aos diferentes genótipos de PON1 e de CYP2A6, respectivamente. Aumento de cromo, magnésio, alumínio, cloro, zinco e potássio foram percebidos no momento da aplicação de pesticidas em relação ao grupo não exposto e à colheita. Maior atividade da superóxido dismutase no grupo exposto em relação ao grupo não exposto foi observada. Atividade da catalase e a medida de TBARS apresentaram aumento significativo na colheita da folha de fumo em relação ao grupo não exposto e ao momento da aplicação de pesticidas. Finalmente, esta investigação sugere níveis maiores de dano ao DNA avaliados pelo ensaio Cometa e pelo teste de MN em linfócito e em mucosa oral, nos diferentes momentos da safra do fumo (aplicação de pesticides e colheita), chamando a atenção o significativo aumento de dano ao DNA no momento da entresafra. Modulação dos genes de metabolismo foi observada, onde GSTM1 nulo e PON1 Gln/Gln tiveram maiores níveis de dano ao DNA, em linfócitos e em células da mucosa oral respectivamente, no momento da aplicação de pesticidas e CYP2A6*1/*1 e CYP2A6*9/- tiveram maiores níveis de dano ao DNA (em linfócitos) e de morte celular (em células da mucosa oral) na colheita. Não houve influência dos genes envolvidos no reparo em relação aos diferentes biomarcadores no grupo exposto. Os resultados indicam que exposição crônica a pesticidas, tanto químicos sintéticos como natural, pode ativar o sistema de enzimas antioxidantes. Por fim, nosso estudo chama a atenção à necessidade de formação profissional e informação sobre práticas seguras no uso de pesticidas e, além disso, na fumicultura, na manipulação das folhas fumo. / Agricultural workers engaged in tobacco cultivation are constantly exposed to large amounts of pesticides as well as to the nicotine present in raw tobacco leaves. Pesticides have been considered potential chemical mutagens. Studies have assumed that nicotine absorbed through the skin results in the characteristic green tobacco sickness (GTS), an occupational illness reported by tobacco workers. This study sought to determine genotoxic effects in farm workers occupationally exposed to agrochemicals and nicotine. The genomic instability, cell death as well as cholinesterase and cotinine levels in the blood of tobacco farmers were investigated. In order to verify relation of genetic susceptibility with biomarkers results, GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2A6, PON, OGG1, RAD51, XRCC1 and XRCC4 genes polymorphisms was evaluated. Determination of oxidative stress markers and trace elements content was accomplished. In the first moment, peripheral blood samples were collected from 30 agricultural workers and 30 non-exposed subjects to investigate occupational exposure in three different crop times (off-season, during pesticides application and leaf harvest). In this study a significant increase in DNA damage, assessed by Comet assay, was observed in tobacco farmers compared to the nonexposed group, for all different crop times, and a significant increase in micronucleated cells was detected in the off-season group. No correlation was found between age and exposure time in relation to biomarker tests. The DNA damage was greater in males than in females, but with a significant difference only in off-season group. No difference, in cholinesterase activity, was seen among the group of farmers and non-exposed group. Increased level of cotinine was observed in leaf harvest group. In the second moment, peripheral blood and buccal cells samples were collected about from 111 agricultural workers, at two different crop times (during pesticides application and leaf harvest), and 56 non-exposed individuals. Results showed nuclear anomalies in the blood and buccal cells in tobacco farmers exposed to mixture of the substances with genotoxic and cytotoxic potential. Difference in blood and buccal micronucleus cytome assay results was found among two different times in the tobacco crop. Effects of PON1 and CYP2A6 genetic polymorphisms on the modulation of DNA damage induced by pesticides and cell death were observed in buccal micronucleus cytome (BMNcyt) assay. No statistically significant difference was found between genders and exposure time for all parameters analyzed. No difference was observed in hematocrit values between the groups. Correlation was observed in age and cytokinesis-blocked micronuclei (CBMN) assay results in nonexposed and pesticide application group. In relation to personal protective equipment (PPE) use, increased MN frequency in pesticide application was observed. From the nine markers of individual susceptibility studied in the CBMN assay, only GSTM1 null and CYP2A6*9, showed significant associations with results in farmers cells. Increase in cotinine level was observed in leaf harvest, when compared to non-exposed group. Cholinesterase (BChe) level was similar in the farmer and non-exposed group. No significant effect on the BChe activity and cotinine level was observed in exposed group with reference to different PON1 and CYP2A6 genotypes, respectively. In pesticide application was found increase in chromiun, magnesium, aluminum, chloride, zinc and potassium, when compared to non-exposed and leaf harvest group. Superoxide dismutase (SOD) activity presented a significant increase in exposed groups (pesticide application and leaf harvest) in relation to non-exposed group, and pesticide application presented higher values than leaf harvest group. The catalase (CAT) activity and TBARS presented a significant increase in leaf harvest than non-exposed group and pesticide application. Finally, this investigation suggests that DNA damage increases, analyzed by Comet, CBMN and BMNcyt assays, at different tobacco crop stages (pesticides application and tobacco leaf harvest), calling attention to the significant increase in the DNA damage during the off-season. Effect of individual genotype of the metabolism genes on the level of different biomarkers evaluated in exposed group demonstrated an influence on increase in damage of GSTM1 null (blood cells) and PON1 Gln/Gln (buccal cells) on pesticides application group, and a influence of CYP2A6*1/*1 (blood cells) and CYP2A6*9/- (buccal cells) on tobacco leaf harvest group. Individual genotype of the DNA repair genes of exposed groups did not show influence on the different biomarkers in this study. In pesticide application was found increase of trace elements content. The results also indicated that chronic exposure to pesticides, synthetic and natural, can influence antioxidant enzymes activity. Our study drives the attention once more to the need for occupational training on safe working practices and safe work environment for farm workers. Developing countries should use such data to establish safety occupational rules during the use of pesticides and mainly during tobacco leaf harvest.

O diseleneto de difenila, objeto de estudo desse trabalho é um composto orgânico simples e estável, utilizado como reagente eletrofílico em indústrias de síntese química, com interessantes atividades farmacológicas e vários efeitos tóxicos. O objetivo desse estudo é aumentar o conhecimento a respeito dos efeitos do DPDS em células de mamíferos em cultura, com intuito de investigar novos efeitos farmacológicos e entender os mecanismos envolvidos em sua toxicidade. A abordagem experimental foi realizada em fibroblastos de pulmão de hamster chinês em cultura e em órgãos e tecidos de camundongos, avaliando-se o estado redox celular, citotoxicidade, genotoxicidade e potencial mutagênico. Esse trabalho avaliou os efeitos citotóxicos, pró-oxidantes, genotóxicos e mutagênicos dessa molécula em células V79 (fibroblastos de pulmão de hamster chinês). A citotoxicidade em células V79 foi avaliada por quatro ensaios metabólicos diferentes e observou-se efeito tóxico somente em concentrações acima de 50 μM, em maneira dose e tempo dependente. O ensaio de redução do MTT sugeriu a possível geração de espécies reativas de oxigênio. O tratamento das células por 3h em doses citotóxicas de DPDS aumentou o nível de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e aumentou a sensibilidade ao tratamento com mutágenos oxidativos, indicando um efeito pró-oxidante. Esses efeitos devem-se a redução dos níveis intracelulares de glutationa reduzida sem aumento de taxa de formação de glutationa oxidada, ou seja, a depleção de GSH ocorre por formação de adutos, reforçando os resultados prévios. Utilizando-se o ensaio cometa em condições alcalinas, verificou-se que o tratamento com diseleneto de difenila em altas concentrações é capaz de induzir quebras de cadeias de DNA. O teste de micronúcleos mostra que as lesões geradas pelo composto organoselenado em doses citotóxicas em células V79 não são eficientemente reparadas e fixam-se como quebras cromossômicas. Considerando-se também a proteção conferida pela N-acetilcisteína, um precursor da biosíntese de glutationa, em termos de depleção do tripeptídeo, é compreensível entender o seu potencial protetor observado contra as lesões ao DNA e mutagênese induzida pelo diseleneto de difenila. No ensaio de sobrevivência clonogênica, em concentrações no intervalo 1.62- 12.5 μM, DPDS não foi citotóxico, enquanto em concentrações a partir de 25 μM, essa molécula significativamente reduziu a sobrevivência das células V79. Nesse sentido, investigou-se o efeito antioxidante do DPDS nas concentrações não-citotóxicas em células V79. O potencial antioxidante do diseleneto nas concentrações empregadas aumentou a sobrevivência e bloqueou a genotoxicidade e mutagenecidade de metilmetanosulfonato e radiação ultravioleta de 254 nm, dois mutágenos capazes de causar danos oxidativos à molécula de DNA. Além disso, o tratamento não não impediu os danos ao DNA induzidos por 8-metoxipsoraleno fotoativado, o qual não induz lesões oxidativas. O pré-tratamento das células V79 com a molécula organoselenada em concentrações inferiores a 12,5 μM foi capaz de reduzir os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após exposição ao peróxido de hidrogênio, MMS e radiação UVC em maneira dose-resposta e aumentou a atividade da glutationa peroxidase das células V79.Dessa maneira, os resultados mostram claramente que DPDS, em baixas concentrações, apresenta propriedades antimutagênicas, as quais devem-se, provavelmente, a sua capacidade antioxidante. Os efeitos genotóxicos do DPDS em diversos órgãos (cérebro, rins, fígado, baço, testículos e bexiga urinária) e tecidos (medula óssea, linfócitos) de camundongos, usando o ensaio cometa in vivo, foi usado para determinar o limiar de dose no qual a molécula exerce efeitos benéficos ou tóxicos em animais. DPDS induziu danos ao DNA em cérebro, fígado, rins e testículos em modo dose-resposta, no espectro de dose 75-200 μmol/Kg em dose única por via intraperitonial, sendo os maiores níveis observados no cérebro. Nossas análises demonstraram uma alta correlação com a redução dos níveis de GSH e um aumento na peroxidação lipídica e dano ao DNA. Dessa forma, esse estudo estabeleceu uma relação entre os efeitospró-oxidantes e genotóxicos para o DPDS em camundongos. DPDS não foi genotóxico e não induziu peroxidação lipídica em nenhum dos órgãos avaliados em doses menores que 50 μmol/kg. O pré-tratamento com N-acetilcisteína foi capaz de impedir os efeitos genotóxicos sistêmicos do composto. Em resumo, cérebro, fígado, rins e testículos são órgãos potenciais para a genotoxicidade sistêmica do DPDS, sendo o cérebro o principal órgão-alvo. Em razão das propriedades genotóxicas observadas, investigou-se o efeito do tratamento com DPDS na manutenção da integridade estrutural do DNA em células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7, usando o ensaio cometa alcalino. O efeito genotóxico do DPDS em células MCF-7 foi idêntico àquele verificado em células V79, indicando que os mecanismos operantes na produção das quebras da fita de DNA são semelhantes e possivelmente baseados no efeito pró-oxidante por depleção de glutationa reduzida. Reforçando essa proposição, o pré-tratamento da linhagem MCF- 7 nos mesmos moldes realizados em V79 também potencializou as lesões ao DNA induzidaspelo peróxido de hidrogênio. Esses achados sugerem que os efeitos genotóxicos do DPDS podem ser investigados para o uso na terapia antiproliferativa. / Diphenyl diselenide (DPDS) is an organoselenium compound with interesting pharmacological activities and various toxic effects. As it is an electrophilic reagent, it is used in the synthesis of a variety of pharmacologically active OS compounds. This study aimed at deepening our knowledge on the effects of DPDS on mammalian cultured cells in order to investigate new pharmacological possibilities for its application and the mechanisms underlying its toxicity. These assays were performed in mammalian cultured cells, using a permanent cell line derived of Chinese hamster lung fibroblasts- V79 cells- and mice organs and tissues, focusing on effects of DPDS on cell redox status, cytotoxicity, genotoxicity, and mutagenicity. This work evaluated the cytotoxic, pro-oxidant, genotoxic, and mutagenic properties of this molecule in V79 Chinese lung fibroblast cells. When cells were treated with increasing concentrations of DPDS, its cytotoxic activity, as determined using four cell viability endpoints, occurs in doses up to 50 μM. The MTT reduction was stimulated, which may indicate reactive oxygen species (ROS) generation. Accordingly, the treatment of cells for 3hr with cytotoxic doses of DPDS increased TBARS levels, and sensitized cells to oxidative challenge, indicating a pro-oxidant effect. The measurement of total, reduced, and oxidized glutathione showed that DPDS can lead to lower intracellular glutathione depletion, with no increase in the oxidation rate in a dose- and time-dependent manner. At the higher doses, DPDS generates DNA strand breaks, as observed using the comet assay. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. In addition, the pre-incubation with Nacetylcysteine, this restored GSH to normal levels, annulled DPDS pro-oxidant and genotoxic effects. These findings show that DPDS-induced oxidative stress and toxicity are closely related to intracellular level of reduced glutathione. In the clonal survival assay, at concentrations ranging from 1.62-12.5μM, DPDS was not cytotoxic, while at concentrations up to 25μM, it significantly decreased the survival of V79 cells. In this respect, the treatment with this organoselenium compound at non-cytotoxic dose range increased cell survival after challenge with hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate, and UVC radiation, but did not protect against 8- methoxypsoralen plus UVA-induced cytotoxicity. Moreover, the treatment prevented induced DNA damage, as verified in the comet assay. The mutagenic effect of these genotoxins, as measured by the micronucleus test, similarly attenuated or prevented cytotoxicity and DNA damage. Treatment with DPDS also decreased lipid peroxidation levels after exposure to hydrogen peroxide MMS, and UVC radiation, and increased glutathione peroxidase activity in the extracts. In this manner, the results clearly demonstrate that DPDS at low concentrations presents antimutagenic properties, which are most probably due to its antioxidant properties. The genotoxic effects of DPDS in multiple organs (brain, kidney, liver, spleen, testes and urinary bladder) and tissues (bone marrow, lymphocytes) of mice using in vivo comet assay, was used to determine the threshold of dose at which it has beneficial or toxic effects in animals. DPDS induced DNA damage in brain, liver, kidney and testes in a dose response manner, in a broad dose range at 75-200 μmol/Kg with the brain showing the highest level of damage. Overall, our analysis demonstrated a high correlation among decreased levels of GSH content and an increase in lipid peroxidation and DNA damage. This finding establishes an interrelationship between pro-oxidant and genotoxic effects. In addition, DPDS was not genotoxic and did not increase lipid peroxidation levels in any organs at doses < 50 μmol/kg. Finally, pre-treatment with N-acetyl-cysteine completely prevented DPDSinduced oxidative damage by the maintenance of cellular GSH levels, reinforcing the positive relationship of DPDS-induced GSH depletion and DNA damage. In summary,DPDS induces systemic genotoxicity in mammals as it causes DNA damage in vital organs like brain, liver, kidney and testes. In view of its genotoxic properties, we investigated whether DPDS might be inducing DNA damage in MCF7 cells, a mammary adenocarcinoma cell line, using the in vitro alkaline comet assay. DPDS did not generate significant DNA damage in a dose response manner but the pre-treatment with DPDS potentiates the DNA damage induced by hydrogen peroxide, reinforcing a clear pro-oxidant ability. This finding supports the genotoxic effects of DPDS in mammalian tumor cells and suggests its potential in antiproliferative therapy.

O objetivo desse trabalho é avaliar o efeito fotoprotetor de três espécies de plantas da Antártica - Deschampsia antarctica Desv. , Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. E Polytrichum juniperinum Hedw. Investigou-se a ação do extrato metanólico de cada espécie contra os danos induzidos ao DNA, utilizando a linhagem celular de fibroblasto de pulmão de hamster chinês (células V79) e no molusco Cantareus aspersus utilizando o ensaio cometa em animais alimentados com esses vegetais. O perfil mutagênico e antimutagênco destes extratos também foi avaliado através de linhagens haplóides da levedura Saccharomyces cerevisiae. As concentrações empregadas desses extratos não foram citotóxicas nem mutagênicas em S.cerevisiae. Além disso, o tratamento com todos os extratos melhorou a sobrevivência e diminuiu a taxa de mutagênese induzida por UVC nesse modelo biológico. Os tratamentos empregados diminuíram significativamente os danos ao DNA induzidos pela UVC em células V79, como verificado pelo ensaio cometa. Esses extratos também reduziram a peroxidação lípidica induzida por UVC, mostrando uma clara propriedade antioxidante. Os resultados do ensaio cometa modificado, em células V79, empregando a Endonuclease V, demonstraram uma diminuição na formação de dímeros de ciclobutano piridina após a pré - incubação com estes extratos. O emprego das endonucleases FPG e ENDO III indica um efeito protetor destes extratos contra as lesões oxidativas geradas pelo UVC. Em linhagens de levedura deficientes em fotoliase, o tratamento com os extratos mostrou-se muito menos eficiente na proteção contra os danos citotóxicos da radiação UVC, sugerindo que esta via de reparação do DNA é estimulada por substâncias dos extratos. Em C.aspersus, o tratamento com os vegetais na alimentação dos moluscos, foi capaz de proteger contra os danos induzidos por UVC nas células da hemolinfa. Em conclusão, os extratos de D. antarctica, C. quitensis e P. juniperinum parecem possuir propriedades fotoprotetivas, o que pode ser atribuído a moléculas como flavonóides e carotenóides agindo como moléculas absorventes de UV, antioxidantes e estimulando processos de reparação do DNA. / This study aimed at deepening the knowledge on the photoprotective effects of three Antarctic plant species – Deschampsia antarctica Desv., Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., and Polytrichum juniperinum Hedw. We investigated the protective effect against UV-induced DNA damage in a permanent lung fibroblast cell line derived from Chinese hamsters (V79 cells), and in the snail Cantareus aspersus, using the comet assay. The protective, mutagenic, and antimutagenic profile of these extracts also was evaluated using haploid strains of Saccharomyces cerevisiae. At the concentration range employed, the extracts were not cytotoxic or mutagenic to S.cerevisiae. In addition, the treatment with these extracts enhanced survival, and decreased induced reverse, frameshift, and forward mutations in a dose-response manner in all UV-C doses employed a. In addition, they did not generate DNA strand breaks in V79 cells, and the treatment significantly decreased DNA damage induced by UVC. These extracts significantly decreased UVC-induced lipid peroxidation in V79 cells, showing a clear antioxidant property. Moreover, results of comet assay cells, employing Fpg, EndoIII, and Endo V endonuclease in these cells, demonstrated significant reduction of UVC-induced DNA damage, oxidative damage, and production of cyclobutane pyrimidine dimers after preincubation with these extracts. The treatment with all tested extracts were much less efficient against UVC-induced cytotoxicity in the yeast strain defective in photolyase as compared to the wild type strain, suggesting that this DNA repair pathway is stimulated by substances present in the extracts. In C. aspersus, the treatment was able to protect against UVC-induced damage. In conclusion, D. antarctica, C. quitensis, and P. juniperinum extracts present photoprotective properties, which can be attributed to molecules, such as flavonoids and carotenoids, which act as UV-sorbing molecules and as antioxidants, as well as stimulate DNA-repair processes.

A resistência ao cloreto estanoso (SnCl2) nas células eucarióticas de levedura Saccharomyces cerevisiae é um produto de vários processos metabólicos. O mutante rad52 , deficiente no mecanismo de reparação recombinacional, incapaz de reparar quebras simples e duplas no DNA, foi o mais sensível ao íon metálico Sn²+. A resistência relativa dos mutantes rad e rad4 , deficientes na reparação por excisão de nucleotídeos (NER), mostrou-se significativamente elevada, indicando a participação dessa via na reparação dos danos causados pelo SnCl2. Uma série de mutantes defectivos na via de reparação por excisão de bases (BER), combinada com mutantes defectivos em NER, foi utilizada para determinar indiretamente o tipo de lesão causada pelo SnCl2 ao DNA. A DNA N-glicosilase (Ntg2p) mostrou-se, por sua vez, indispensável à reparação das lesões ao DNA induzidas pelo íon metálico Sn²+. A ausência do fator de transcrição Yap1, responsável pela resposta ao estresse oxidativo em leveduras, ocasionou o aumento da sensibilidade ao íon metálico Sn²+. Além disso, a sensibilidade dos mutantes sod1 e sod2 revelou a importância das enzimas antioxidantes Sod1p e Sod2p na resposta aos danos gerados pelo íon metálico Sn²+. A sensibilidade mais elevada ao SnCl2 foi observada quando as células estavam na fase exponencial de crescimento (fase LOG), o que sugere que há dois sistemas independentes (um mediado pela repressão/desrepressão catabólica, e outro, pela ativação da transcrição de genes envolvidos nas vias de defesa contra espécies reativas de oxigênio (EROs)), que atuam em conjunto e contribuem para a resistência aos danos causados pelo íon metálico Sn²+. Para determinar a concentração do íon metálico Sn²+ captada nas células da levedura S. cerevisiae e correlacioná-la com a toxicidade desse íon metálico, foi determinado o conteúdo de metal intracelular pelo método de Emissão de Raios-X Induzida por Partículas Carregadas, ou Particle Induced XRay Emission (PIXE), desenvolvendo-se um protocolo para as análises. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem diplóide XS2316 captou 60% da quantidade total do íon metálico Sn²+, captada pela linhagem haplóide XV184-14c. Isso indica que a linhagem haplóide capta maior quantidade do íon metálico Sn²+ do que a linhagem diplóide, o que pode explicar a citotoxicidade diferenciada de ambas as linhagens quando tratadas com SnCl2. Por fim, utilizando-se a mesma metodologia, foi realizada uma análise multielementar para avaliar se havia uma interação entre o íon metálico Sn²+ e outros elementos químicos essenciais para a célula. De acordo com as análises por PIXE, após tratamento com SnCl2, a linhagem haplóide XV185-14c apresentou um decréscimo significativo nas quantidades de Mg, Zn, S e Fe, e, por outro lado, um aumento na quantidade de P. Para verificar como o íon metálico Sn²+ é captado, distribuído e destoxificado, foram associadas técnicas moleculares, incluindo ensaios de citotoxicidade e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a metodologia do PIXE. Os ensaios de sobrevivência mostraram que Fet4 e Zrt2, ambas proteínas de transporte de baixa afinidade do ferro e zinco, respectivamente, podem internalizar o íon metálico Sn²+. Por sua vez, qRT-PCR mostrou um aumento da expressão gênica de CCH1 e MID1, os quais codificam as proteínas Cch1 e Mid1, envolvidas no transporte de Ca²+ na membrana plasmática, sugerindo que essas duas proteínas também podem estar envolvidas na captação do íon metálico Sn²+. Os resultados indicaram que, uma vez dentro da célula, o íon metálico Sn²+ pode ser armazenado no vacúolo através da ação da proteína P-type ATPase Pmc1 e quelado no citoplasma pela metalotioneína Crs5. Alternativamente, o íon metálico Sn²+ pode gerar EROs, em especial o ânion superóxido (O2 -), o qual pode ser dismutado pela proteína Sod1, formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (.OH). Consequentemente, as EROs podem induzir a transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, como SOD1, YAP1 e APN1. Para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na genotoxicidade do íon metálico Sn²+, foi avaliada a indução de quebras causadas pelo SnCl2 na presença de formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (ENDO III), bem como a interferência desse íon na reparação das lesões induzidas pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) em células de pulmão de hamster chinês (V79) pelo ensaio cometa. Os resultados mostraram que, em concentrações tóxicas, o íon metálico Sn²+ induziu somente uma limitada elevação nos sítios sensíveis de FPG e ENDO III, sugerindo que o íon metálico Sn²+ preferencialmente não induz lesões oxidativas nas bases nitrogenadas. Embora a concentração de 50 μM de SnCl2 não tenha produzido um aumento significativo na quantidade de danos ao DNA, ela foi capaz de inibir a reparação dos danos provocados pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) durante o período de pós-tratamento de 24h. Os resultados demonstraram o efeito genotóxico e comutagênico do SnCl2 em células V79. O efeito inibitório do íon metálico Sn²+ na reparação dos danos induzidos pelo MMS no DNA sugeriu que esse metal também pode interferir em sistemas de reparação do DNA, que contribuem para o aumento de mutações pela alteração do equilíbrio entre o processo de reparação livre de erro e o sujeito a erro. / Resistance to stannous chloride (SnCl2) of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a product of several metabolic pathways of this unicellular eukaryote. The recombination deficient rad52 mutant, unable to repair DNA single and double strand breaks was the most sensitive. The relative resistance of mutant strains rad2 e rad, deficient in nucleotide excision repair (NER), was rather high, indicating a minor but significant contribution to repair of Sn²+ -induced DNA lesions by this repair pathway. A series of mutants defective in different base excision repair (BER) pathway, combined with NER were used to indirectly determine the type of SnCl2-produced DNA lesion. The Ntg2p DNA N-glycosylase seems to be indispensable for repair of Sn²+ -induced DNA lesions. Lack of transcription factor Yap1p, responsible for the oxidative stress response in yeast, led to increase in Sn²+ -sensitivity. In addition, sensitivity of the superoxide dismutase mutants sod1 and sod2 revealed the importance of these anti-oxidative defence enzymes against Sn²+ -imposed DNA damage. The highest SnCl2 -sensitivity, however, was observed in glucose-repressed pre-diauxic shift exponentially growing cells (LOG cells). It has been suggested that two independently acting anti-ROS protective systems (one mediated by glucose repression/de-repression, the other via ROS-inducible transcription activators) are working together, and that both contribute to Sn²+ -resistance. To determine the concentration of Sn²+ ions cells of the S. cerevisiae and to correlate their quantity with the toxicity, the intracellular metal content of yeast cells was determined by Particle Induced X-ray emission (PIXE). A thick target protocol was developed for PIXE analysis. The PIXE analysis suggested that diploid (XS2316) cells absorbed about 60% of the total amount of Sn²+ absorbed by the haploid (XV185-14c) yeast cells. This indicates that Sn²+ absorption is better in haploid yeast cells and agrees well with published toxicity results. Finally, we performed a screening in order to know the putative interactions between Sn²+ and other essential elements. According to PIXE analysis, the results for XV185-14c yeast cells indicate a significant loss of intracellular elements such as Mg, Zn, S, Fe and an increase of P levels after 1 h exposure to 25 mM SnCl2 in STAT phase. In order to verify how Sn²+ is uptaken, distributed and detoxified, we associated molecular techniques including survival assay and quantitative real time PCR (qRT-PCR) with PIXE. The survival assay showed that Fet4p and Zrt2p both low-affinity iron and zinc transporters, respectively, may internalize Sn²+. By its turn, qRT-PCR showed an increased in CCH1 and MID1 gene expression, which encode for the cytoplasmic transmembrane Ca²+ transporters Cch1p and Mid1p, suggesting that both proteins may also take up Sn²+. Our data also indicated that once inside the cell, Sn²+ may be taken up from the cytosol by a P-type ATPase to the vacuole (Pmc1p) or may be chelated by Crs5p metallothionein in the cytosol. Alternatively, Sn²+ may generate reactive oxygen species (ROS), especially O2 - which can be dismutate to form H2O2 and the highly reactive OH. In consequence, ROS can induce cellular injury and stress-generated activation of many genes, e.g., SOD1, YAP1, and APN1. In order to clarify the molecular mechanisms of Sn²+ genotoxicity, we evaluated the induction of strand breaks, FPG and ENDO III sensitive sites, and the interference with the repair of MMS-caused DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblasts exposed to stannous chloride by comet assay. Our results demonstrated that Sn²+ induced only a limited elevation in FPG and ENDO III sensitive sites in toxic concentrations. This suggests that stannous ion does not preferentially induce base modifications that are the substrate of FPG and ENDO III enzymes in V79 cells. Although 50 µM SnCl2 concentration did not increase significantly the DNA migration by itself in comet assay, it was capable to inhibit the repair of MMSinduced DNA damage during the pos-treatment period of 24h. Our results demonstrate the genotoxic and comutagenic effects of stannous chloride in V79 cells. The inhibitory effect of Sn²+ on repair of MMS-induced DNA damage suggests that this metal can also interfere in DNA repair systems thus contributing to increased mutation by shifting the balance from error-free to error-prone repair processes.

COSTA, R. Avaliação dos possíveis efeitos citogenéticos, hematológicos e bioquímicos de profissionais ocupacionalmente expostos a quimioterápicos em Teresina – PI. 2014. 124 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-20T13:42:43Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_rcosta.pdf: 2106050 bytes, checksum: 73a72c7263189d4f061df201d03f3134 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-20T13:42:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_rcosta.pdf: 2106050 bytes, checksum: 73a72c7263189d4f061df201d03f3134 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T13:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_rcosta.pdf: 2106050 bytes, checksum: 73a72c7263189d4f061df201d03f3134 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / Chemotherapy are cytotoxic substances used to cause cellular damage that is not only selective for tumor cells, affecting every cell in the body, resulting in adverse effects, including causing occupational hazards. This study evaluated the genotoxic and mutagenic effects in 22 professionals who handle and administer these drugs in oncology services in the city of Teresina (PI) by micronucleus test in buccal mucosa, chromosomal aberrations in peripheral blood lymphocytes and laboratory evaluation. Applied a questionnaire recommended by the International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC, and collected up the biological material for analysis. The control group consisted of 22 administrative workers. The exposed population had an average age of 35.2 years and working time of 6.0 years, smoking time of 1.1 years, alcoholism time of 3.7 years, the use of prescription drugs and 2,7anos all wear PPE. The results showed a significant increase in genotoxicity level in workers who are exposed to a significant micronucleus induction in comparison with the control group (2.27 versus 0.68) and (0.15 versus 0.36); P <0.05. Found up nuclear changes in the group of subjects exposed showing a induction in nuclear abnormalities such as karyorrhexis (689.18 to 484.13) and frequency cariorrex (34.29 against 25.32). The frequency karyorrhexis was significant (P <0.05). For chromosomal aberrations test were analyzed in all metaphases 1171 and the main structural types of AC were observed rings, acentric rings, dicentric chromosomes and tricêntricos, the latter two being the most common. The average structural aberrations Chromosomal in exposed subjects was (2.000 ± 0.4699) and unexposed subjects was (1.178 ± 0.3770). In our study we found that the exposed group showed decreased values of total protein (7.50 ± 1.00) to (7.58 ± 0.70) compared to the control group, as well as albumin (3.74 ± 0, 46) in the exposed group versus (4.30 ± 0.38) in the control group. On hematological analysis it was observed that some workers in the exposed group had mild thrombocytopenia (14%) and lymphocytosis (32%). The parameters of genotoxicity and mutagenicity indicated a genetic instability in exposed workers, before that, it is necessary occupational biomonitoring of these professionals. / Os quimioterápicos são substâncias citotóxicas utilizadas para causar um dano celular que não é seletivo apenas para as células tumorais, afetando todas as células do organismo, resultando em efeitos adversos, ocasionando inclusive riscos ocupacionais. O presente estudo avaliou os efeitos genotóxicos e mutagênicos em 22 profissionais que manipulam e administram essas drogas nos serviços de oncologia do município de Teresina (PI) pelo teste de micronúcleos em mucosa bucal, aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue periférico e avaliação laboratorial. Aplicou-se um questionário recomendado pela International Comission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC, e coletou-se o material biológico para as análises. O grupo controle foi formado por 22 trabalhadores administrativos. A população exposta apresentou uma média de idade de 35,2 anos, e tempo de trabalho de 6,0 anos, tempo de tabagismo de 1,1 anos, tempo de etilismo de 3,7 anos, uso de medicamentos prescritos 2,7anos e todos usam EPIs. Os resultados mostraram um aumento significante nos níveis de genotoxicidade em trabalhadores que estão expostos com uma indução significante de Micronúcleo quando comparado com o controle (2,27 contra 0,68) e (0,15 contra 0,36); P <0,05. Constataram-se alterações nucleares no grupo de sujeitos expostos mostrando uma indução nas anormalidades nucleares como cariorrexe (689,18 contra 484,13) e freqüência de cariorrex (34,29 contra 25,32). A frequência de cariorrexe foi significativa, (P<0,05). Para o teste de Aberrações cromossômicas foram analisadas ao todo 1171 metáfases e os principais tipos de AC estruturais observadas foram anéis, anéis acêntricos, cromossomos dicêntricos e tricêntricos, sendo estes dois últimos os mais frequentes. A média de Aberrações Cromossômicas estruturais nos indivíduos expostos foi de (2,000 ± 0,4699) e nos indivíduos não expostos foi de (1,178 ± 0,3770). Em nosso estudo verificamos que o grupo exposto apresentou valores de proteínas totais diminuídos (7,50 ± 1,00) contra (7,58 ± 0,70) em relação ao grupo controle, assim como para albumina (3,74 ± 0,46) no grupo exposto contra (4,30 ± 0,38) do grupo controle. Na análise hematológica pôde-se verificar que no grupo exposto alguns trabalhadores apresentaram discreta plaquetopenia (14%) e linfocitose (32%). Os parâmetros de genotoxicidade e mutagenicidade indicaram uma instabilidade genética nos trabalhadores expostos, diante disso, faz-se necessário o biomonitoramento ocupacional dessesprofissionais.

SANTOS, Thayna Nogueira dos. Avaliação do perfil oxidativo e da genotoxicidade em pacientes submetidos a transplante de células tronco hematopoéticas autólogo. 2014. 90 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-16T15:55:40Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_tnsantos.pdf: 2818445 bytes, checksum: 4f112d60734a0c095c726ffa47afd19d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-16T16:26:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_tnsantos.pdf: 2818445 bytes, checksum: 4f112d60734a0c095c726ffa47afd19d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T16:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_tnsantos.pdf: 2818445 bytes, checksum: 4f112d60734a0c095c726ffa47afd19d (MD5) Previous issue date: 2014 / Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT) is an autologous therapeutic method in which the stem cells are collected from th e individual’s own peripheral blood to restore spinal cord function. This is a prospective longitudinal study aimed to investigate the genotoxicity and oxidative profile in adult patients with multiple myeloma, Hodgkin’s lymphoma and non - Hodgkin's lymphoma undergoing autologous HSCT and in apparently healthy individuals, from January 2013 to December 2013. Samples of heparinized and EDTA blood of 37 patients befor e the conditioning regimen (CR) , were collected 24 hours after CR (D - 1) , 1 day (D +1) , 10 da ys (D +10) and 20 (D +20) days after HSCT and from 30 apparently healthy individuals. Oxidative stress parameters were analyzed: MDA (malondialdehyde), nitric oxide (NO), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) as well a s genotoxicity, given by the Damage Index (DI) to DNA. MDA concentrations were significantly elevated in all groups of patients when compared to the control group at all stages of HSCT. There was statistical difference in nitric oxide concentration s betwee n patients and controls and among patients. The concentration of catalase was significantly reduced at D - 1 when compared to the pre - CR in the groups of patients, having recovered at D +20 in patients with MM and LH and at D+10 in patients with LNH in relat ion to D - 1. The concentration of glutathione peroxidase did not differ significantly in the groups of patients in the control group and between both groups of patients. The concentration of SOD was s ignificantly reduced in the pre - CR in MM patients compare d to the control group. There was a significant reduction for all patients at D - 1. The rate of DNA damage was statistically higher (p<0.05) in the pre - CR in the patient groups c ompared to the control group. D - 1 significantly increased compared to all other times and when analyzed in relation to the control group. Markers of oxidative stress and genotoxicity can be used as early biomarkers of toxicity assisting in the monitoring of patient progression and prognosis. / O Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH) autólogo é um método terapêutico no qual as células progenitoras são coletadas do próprio indivíduo a partir do sangue periférico para restabelecer sua função medular. O estudo é do tipo longitudinal prospectivo com a finalidade de investigar o perfil oxidativo e a genotoxicidade em pacientes adultos submetidos a TCTH autólogo, portadores de Mieloma múltiplo, Linfoma de Hodgkin e não Hodgkin e em indivíduos considerados saudáveis, no período de janeiro de 2013 a dezembro de 2013. Foram coletadas amostras de sangue heparinizado e com EDTA de 37 pacientes, antes do Regime de Condicionamento (RC), 24 horas após o RC (D -1), 1 dia (D +1), 10 dias (D +10) e 20 (D +20) dias após o TCTH e de 30 indivíduos aparentemente saudáveis. Foram analisados os parâmetros de estresse oxidativo: MDA (malonaldeído), óxido nítrico (NO), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD) e a genotoxicidade, dada pelo Índice de Dano (ID) ao DNA. As concentrações de MDA apresentaram-se significativamente elevadas em todos os grupos de pacientes em relação ao grupo controle em todas as etapas do TCTH. Houve diferença estatística na concentração de óxido nítrico entre pacientes e controles e entre os pacientes. A concentração da enzima catalase apresentou-se significativamente diminuída no momento D -1 em relação ao Pré-RC nos grupos de pacientes, sendo recuperada em D +20 nos pacientes com MM e LH, e em D +10 nos pacientes com LNH, em relação a D -1. A concentração da glutationa peroxidase não diferiu significativamente nos grupos de pacientes em relação ao grupo controle e nem entre os grupos de pacientes. A concentração da SOD apresentou-se significativamente reduzida no Pré-RC em pacientes com MM em relação ao grupo controle. Em D -1, houve redução significativa para todos os pacientes. O índice de dano ao DNA foi significativamente maior (p<0,05) no Pré- RC nos grupos de pacientes em relação ao grupo controle. Em D -1 houve aumento significante em relação a todos os outros momentos analisados e em relação ao grupo controle. Os marcadores do estresse oxidativo e de genotoxicidade podem ser utilizados como biomarcadores precoces de toxicidade auxiliando no monitoramento da evolução e no prognóstico do paciente.

ROCHA, Liliane Brito da Silva. Lesão no DNA, alterações cromossômicas e sua correlação com polimorfismos genéticos em pacientes com anemia falciforme tratados com hidroxiuréia. 2014. 95 f. Tese (Doutorado em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos) – Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-22T15:27:04Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_lbsrocha.pdf: 662021 bytes, checksum: 05745d369d8a7a630b63069dbfb35ad4 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-22T15:55:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_lbsrocha.pdf: 662021 bytes, checksum: 05745d369d8a7a630b63069dbfb35ad4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-22T15:55:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_lbsrocha.pdf: 662021 bytes, checksum: 05745d369d8a7a630b63069dbfb35ad4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Introduction: The sickle cell anemia is the result of a point mutation in the β-globin gene, leading to a substitution of glutamic acid by valine at the sixth position of the polypeptide chain. The Hydroxyurea (HU) is the chemotherapeutic agent considered as the main pharmacologic agent capable of preventing the complications and improving the quality of life of sickle cell anemia (SCA) patients. Although HU has been associated with an increased risk of neoplasia in some patients with myeloproliferative disorders and SCA, the mutagenic and carcinogenic potential of HU has not been established. Objective: Investigate the levels of DNA damage in peripheral blood leukocytes and possible chromosomal abnormalities of bone marrow cells and correlate with the therapy with HU and with the genetic polymorphisms in patients with SCA in Fortaleza, Ceara. Methods: We analyzed 41 patients with SCA. In a second step, we selected 10 patients who had the highest levels of DNA damage. The control group was composed of 26 healthy individuals. All patients were adults of both sexes. The presence of HbS and the analysis of the haplotypes of the beta S gene cluster were done by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP); to measure levels of DNA damage was done by comet assay; and the analysis of possible chromosomal abnormalities was done by G banding cytogenetics. The significance level was 0.05 for all tests, and data were presented as mean ± standard error of the mean (SEM). Results: The damage index (DI) in the group of patients with sickle cell anemia treated with hydroxiurea (SCAHU) was significantly higher than in controls (p < 0,001). Gender and age were not associated DNA damage in controls or SCAHU patients. In the group of SCAHU patients, DI was significantly influenced by length of HU treatment (p=0,0039) and BMI (p= 0.001). Patients with length of HU treatment ≥ 20 months and BMI ≤ 20 kg/m2 had a significantly greater DI than those with length of HU treatment < 20 months and BMI > 20 kg/m2. No influence significant of mean dose of HU was observed on DI (p=0,950), however patients who received a mean HU dose ≥ 20,0 mg/kg/day showed a higher DI than those who received < 20.0 mg/kg/day. Futhermore, an association was observed between DI damage and beta-globin gene haplotypes. DI values for the Bantu/Bantu haplotype was greater when compared to the Benin/Benin haplotype; and the Bantu/Benin haplotype had a less DI than Bantu/Bantu haplotype and greater than Benin/Benin haplotype. Any chromosomal abnormality was identified in 10 patients who showed higher levels of DNA damage. Conclusions: The result shows that the DNA damage in SCA is not only associated to treatment with HU, but in addition to genetic polymorphisms. Furthermore, was found that the presence of genotoxicity and favorable genetic polymorphism do not mean the presence of mutagenicity. / Introdução: A anemia falciforme é o resultado de uma mutação pontual (GAGGTG) no códon do gene da globina β, conduzindo a uma substituição de ácido glutâmico por valina na sexta posição da cadeia polipeptídica. A Hidroxiuréia (HU) é o quimioterápico considerado como principal agente farmacológico capaz de prevenir as complicações e aumentar a qualidade de vida dos pacientes com anemia falciforme (AF). Embora a HU tenha sido associada com um aumento do risco de neoplasias em alguns pacientes com doenças mieloproliferativas e AF, seu potencial mutagênico e carcinogênico ainda não está bem estabelecido. Objetivo: Investigar os níveis de lesão no DNA em leucócitos de sangue periférico e possíveis alterações cromossômicas em células de medula óssea e correlacioná-los com o tratamento com HU e com os polimorfismos genéticos em pacientes com AF em Fortaleza, Ceará. Metodologia: Foram analisadas amostras de 41 pacientes com AF. Em um segundo momento, foram selecionados os 10 pacientes que apresentaram os maiores níveis de lesão no DNA. O grupo controle foi composto por 26 indivíduos saudáveis. Todos os pacientes eram adultos e de ambos os sexos. A presença de HbS e a análise dos haplótipos do cluster do gene da beta-globina foram realizadas por meio da técnica da reação em cadeia mediada pela polimerase para polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP); a determinação dos níveis de lesão no DNA foi realizada pelo teste do cometa; e a análise de possíveis alterações cromossômicas foi realizada pela técnica de citogenética por bandeamento G. O nível de significância foi de 0,05 para todos os testes, e os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Resultados: O índice de dano (ID) no grupo dos pacientes com anemia falciforme tratados com hidroxiuréia (AFHU) foi significantemente maior do que no grupo controle (p < 0,001). Sexo e idade não foram associados à lesão no DNA nos controles ou pacientes com AFHU. No grupo de pacientes com AFHU, o ID foi significantemente influenciado pelo tempo de tratamento com HU (p=0,0039) e índice de massa corporal (IMC) (p= 0.001). Pacientes com tempo de tratamento ≥ 20 meses e IMC ≤ 20 kg/m2 tiveram um ID significantemente maior do que aqueles com tempo de tratamento < 20 meses e IMC > 20 kg/m2. Nenhuma diferença significante em relação à dose média diária de HU foi observada sobre o ID (p=0,950), contudo pacientes que receberam uma dose de HU ≥ 20,0 mg/kg/dia mostraram um maior ID do que aqueles que receberam < 20.0 mg/kg/dia. Além disso, foi observada uma associação entre ID e haplótipos do gene da beta-globina. Os valores de ID para o haplótipo Bantu/Bantu foram maiores quando comparados ao haplótipo Benin/Benin; e o haplótipo Bantu/Benin teve um menor ID do que o haplótipo Bantu/Bantu e maior do que o haplótipo Benin/Benin. Nenhuma alteração cromossômica foi identificada nos 10 pacientes que apresentaram os maiores níveis lesão no DNA. Conclusões: O resultado mostra que a lesão no DNA na AF não está somente associada ao tratamento com HU, mas também a polimorfismos genéticos. Além disso, foi encontrado que a presença de genotoxicidade e polimorfismo genético favorável não significam a presença de mutagenicidade.

Durante as atividades de mineração de carvão, grandes quantidades de cinzas, metais, óxidos e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) são liberados ao ambiente. As partículas de carvão e cinzas são quimicamente complexas e têm a capacidade de interagir com mecanismos celulares e não celulares que desencadeiam a ativação de macrófagos, células epiteliais e fibroblastos, a liberação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e expressão de citocinas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade in vitro, e fisiologia respiratoria in vivo, da exposição a partículas de carvão e cinzas provenientes de Santa Catarina-Brasil. Foram avaliadas quatro amostras, duas de carvão mineral (COAL11 e COAL16) e duas de cinzas produto da combustão de cada carvão (CFA11 e CFA16). Particularmente, a amostra CFA16 é produto da co-combustão com óleo combustível e óleo diesel. Na avaliação in vitro, COAL11, COAL16 e CFA16 foram mais citotóxicas do que a cinza CFA11 como avaliado no ensaio clonogênico. A exposição das células V79 às partículas de carvão e cinzas induziram lesões primárias no DNA detectadas no ensaio Cometa Alcalino. Partículas de COAL16 e CFA16, em maiores concentrações, foram capazes de induzir danos oxidativos no DNA em células V79, como demonstrado no ensaio Cometa Modificado (FPG e ENDOIII). Nos biomarcadores do ensaio CBMN-Cyt os resultados mostraram que as concentrações mais altas de carvão e cinzas induziram efeitos citotóxicos e instabilidade cromossômica. In vivo, camundongos BALB/c foram analisados 24 h após instilação intratraqueal com partículas de carvão e cinzas. Os camundongos expostos a partículas de carvão apresentaram rigidez pulmonar e obstruções das vias aéreas centrais quando comparado com o grupo controle, nos parâmetros da mecânica pulmonar. Quando expostos às partículas de carvão e cinzas, os animais mostraram recrutamento de células, principalmente as mononucleares, e expressão de citocinas, principalmente TNF-α e IL-1β, quando comparado com o grupo controle. Na histologia, não foram encontradas alterações significativas nos alvéolos, nem formação de fibras elásticas e colágenas. Resultados no ensaio Cometa Alcalino mostraram efeitos genotóxicos significativos em células de sangue periférico nos animais expostos a partículas de carvão e cinzas. As análises dos elementos inorgânicos usando o método PIXE, demostraram translocação extrapulmonar de metais ao fígado, baço e encéfalo. Comparativamente, de todas as amostras avaliadas, a CFA11 apresentou o maior diâmetro no tamanho das partículas como avaliado mediante análise de difração de laser. Os resultados demostraram que o processo de combustão altera a toxicidade das partículas de carvão, e o uso de combustíveis adicionais dentro do processo de queima, como foi o caso da amostra CFA16, muda as caraterísticas das partículas geradas quanto ao tamanho e toxicidade das mesmas. Estes resultados in vitro e in vivo estão relacionados com os compostos contidos na superfície das partículas, tais como óxidos, metais e HAP detectados nas amostras. Este conjunto de dados aportam ao estado do conhecimento sobre os riscos da exposição continua a este tipo de partículas. / During the coal mining activities, large amounts of fly ash, metals, oxides and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are released to the environment. Coal and fly ash particles are chemically complex and are capable of interacting with cellular and non-cellular mechanisms that trigger the release of reactive oxygen species (ROS) and expression of cytokines from activated macrophages, epithelial cells and fibroblasts. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity in vitro, and respiratory physiology in vivo, of exposure to coal and coal fly ash particles from Santa Catarina-Brazil. Four samples were collected, two from coal (COAL11and COAL16) and two from coal fly ash released during combustion (CFA11 and CFA16). Particularly, the CFA16 sample was the product of co-firing with fuel oil and diesel oil. In vitro evaluation, COAL11, COAL16 and CFA16 were more cytotoxic than CFA11sample as assessed in clonogenic assay. The exposure of V79 cells to coal particles and coal fly ash induced primary DNA damage detected in Comet Alkaline test. COAL16 and CFA16 particles, at higher concentrations, were capable of inducing oxidative DNA damage in V79 cells, as demonstrated in the Modified Comet assay (FPG and ENDOIII). Results in the biomarkers CBMN-Cyt test showed that higher concentrations of coal and coal fly ash particles induced cytotoxic effects and chromosomal instability. In vivo, BALB/c mice, were analyzed 24 h after intratracheal instillation with coal and coal fly ash particles. The mice exposed to coal particles showed significant rigidity and obstruction of the central airways when compared with the control group. In addition, the animals showed recruitment of cells, mainly mononuclear cells, and expression of cytokines, particularly TNF-α and IL-1β as compared to the control group. Histologically, there were no significant alterations in the alveoli, or formation of elastic and collagen fibers. Alkaline Comet assay results showed significant genotoxic effects on peripheral blood cells in animals exposed to coal and coal fly ash particles. The analysis of inorganic elements using the PIXE method demonstrated the efficient metal extrapulmonary translocation into the bloodstream to the liver, spleen and brain. When comparing particle size, CFA11showed the largest diameter as assessed by analysis of laser diffraction. The results showed that the combustion process alters the toxicity of coal particles and the use of additional fuel in the firing process, modifies the toxicity and size of the particles, as was the case of the CFA16 sample. These results in vitro and in vivo are associated with the compounds contained in the surface of the particles, such as oxides, metals and PAH detected in these samples. This study contribute to the state of knowledge of the risks of continuous exposure of these particles.

A síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome rara de predisposição a câncer associada a mutações germinativas no gene supressor tumoral TP53. As vias de sinalização da proteína p53 estão envolvidas na regulação da apoptose, das paradas do ciclo celular, da senescência e do reparo de danos no DNA. As mutações em p53 mais comumente encontradas em tumores estão distribuídas ao longo do domínio de ligação ao DNA, incluindo a mutação G245S associada à SLF. No entanto, a mutação mais frequentemente associada à SLF nas regiões Sul e Sudeste do Brasil é a mutação R337H, que afeta o domínio de oligomerização de p53. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar os efeitos em células de p53 mutantes associadas à síndrome de SLF na viabilidade em condições basais e na sobrevivência celular sob estresse genotóxico. Células p53 null da linhagem NCI-H1299 foram transfectadas com vetores para a expressão de p53 wt e das mutantes G245S e R337H, e ensaios celulares foram realizados. A mutante R337H inibiu a formação de colônias e diminuiu a viabilidade celular de forma similar ao observado para células com expressão p53 wt, enquanto G245S demonstrou menor influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação das células. Após submetidas a estresse genotóxico induzido por meio de exposições à radiação UVC, células com expressão de R337H mostraram-se mais sensíveis à morte celular mesmo quando expostas à baixa dose de UVC. Já as células com a expressão de G245S apresentaram aumento nas taxas de apoptose tardia somente quando submetidas a altas doses de radiação de UVC, assim como nas células com expressão de p53 wt. Dessa forma, foram observadas atividades funcionais similares entre R337H e p53 wt quanto à influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação celular, enquanto células com expressão de G245S apresentaram fenótipo celular mais próximo ao p53-null. Todavia, G245S demonstrou atividade próxima a de p53 wt ao conferir proteção às células contra morte induzida pela radiação UVC, e a mutante R337H gerou maior sensibilidade para morte celular em condições de estresse genotóxico. / Li-Fraumeni syndrome (LFS) is a hereditary cancer predisposition disorder associated with germline mutations in the TP53 tumor suppressor gene. The p53 signaling pathways are involved in the regulation of apoptosis, cell cycle arrest, senescence and DNA repair. The p53 mutations found in tumors are commonly distributed along the DNA binding domain, including the G245S mutation associated with LFS. However, the most frequent p53 mutation associated with LFS in Southeast and Southern Brazil is the R337H mutation, which affects the oligomerization domain of p53. Thus, the aim of this study is to analyze the effects of mutant p53 associated with LFS on cell viability at basal conditions and on cell survival in genotoxic stress. Null-p53 NCI-H1299 cell line were transfected with vectors for the expression of wild-type, G245S and R337H p53, and cell assays were performed. The R337H mutant inhibited the colony formation and decreased the cell viability similar to that observed in cells with wt p53 expression, while G245S demonstrated less influence on cell viability. After undergoing genotoxic stress induced by UVC radiation exposures, cells with R337H expression were more sensitive to cell death when exposed to low UVC dose. Cells with G245S expression showed an increase in late apoptosis rates only when subjected to high doses of UVC radiation, as well as cells with wt p53 expression. Thus, similar and functional activities were observed between R337H and wt p53 concerning influence on cell viability and proliferation, with the expression of G245S presented cellular phenotype closer to p53-null. However, G245S demonstrated to confer protection for cell death as seen for wt p53, whereas R337H generated increased of sensitivity to cell death under conditions of genotoxic stress.

A composição química dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia foi analisada. 13 compostos foram descritos pela primeira vez em B. trinervis, 8 deles foram identificados por HRMS-ESI-MS e 5 foram descritos por HPLC. Os compostos identificados por HPLC encontram-se em maior concentração no extrato aquoso da Colômbia em relação ao extrato aquoso de Brasil, adicionalmente, a luteolina foi identificada unicamente no extrato aquoso de Colômbia. Após exposição aos extratos e frações de B. trinervis foram observados efeitos doses dependentes na sobrevivência celular e indução de genotoxicidade avaliados pelo teste MTT, ensaio clonogênico e cometa alcalino respectivamente. As frações acetato de etila de ambos os países apresentaram maior atividade citotóxica e genotóxica quando comparadas com as outras frações, sendo mais evidente na fração acetato de etila de Colômbia. Este efeito pode ser explicado pela capacidade pró-oxidante dos compostos umbeliferona, diterpenos labdano, rutina, ácido elágico, ácido cafeico, ácido rosmarínico e luteolina e seu efeito sinérgico na mistura complexa da fração. A redução dos danos induzidos pelo peroxido de hidrogênio evidenciado pelo cometa alcalino com e sem enzimas de reparo de DNA (FPG e ENDO III) demonstra o efeito antigenotóxico dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia. Os extratos aquosos e as frações acetato de etila de ambos os países evidenciaram efeito protetor contra os danos oxidativos induzidos pelos peroxido de hidrogênio, por capacidade antioxidante. Os efeitos citotóxicos, genotóxicos, antigenotóxicose antioxidantes dos extratos e frações de B. trinervis do Brasil e da Colômbia podem ser explicados pela presença de umbeliferona, diterpenos labdano, rutina, ácido elágico, ácido cafeico, ácido rosmarínico e luteolina. Estes compostos podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes dependendo da concentração. / The chemical composition of extracts and fractions of B. trinervis from Brazil and Colombia was analyzed. Thirteen compounds were described for the first time in B. trinervis using two methods, by HRMS-ESI-MS were identified eight compounds and, by HPLC five compounds. Thirteen compounds were described for the first time in B. trinervis by HRMS-ESI-MS (eight compounds) and HPLC (five compounds). In relation to the compounds identified by HPLC, the aqueous extract of Colombian B. trinervis had highest concentration than the Brazilian counterpart; additionally, Luteolin was identified only in Colombian aqueous extract. Chinese hamster ovary (CHO) cells were treated with extracts and fractions of B. trinervis from Brazil and Colombia. Doses dependent effects in cell survival and induction of genotoxicity were observed in the MTT, cloning ability forming, and alkaline comet assays. Ethyl acetate fractions from both countries had highest cytotoxic and genotoxic activity than the other fractions; the ethyl acetate fraction of Colombian B. trinervis showed highest cytotoxic activity. This effect can be explained by the pro-oxidant capacity of umbelliferone, rutin, ellagic acid, caffeic acid, rosmarinic acid, luteolin, and labdane type diterpens and their synergistic effect on fraction complex mixture.The reduction of DNA damage induced by hydrogen peroxide was evidenced by alkaline comet assay with and without DNA repair enzymes (FPG and ENDO III) evidencing the antigenotoxic effect of extracts and fractions of B. trinervis from both countries. Aqueous extracts and ethyl acetate fractions from both countries showed highest protective effects against oxidative damage induced by hydrogen peroxide due to the antioxidant capacity. Cytotoxic, genotoxic, antigenotoxic and antioxidant effects of extracts and fractions of B. trinervis can be explained by the presence of umbelliferone, labdane type diterpens, rutin, ellagic acid, caffeic acid, rosmarinic acid and Luteolin. These compounds can act as antioxidants or pro-oxidant depending on their concentrations.