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Caracterização do polimorfismo e associação dos genes da kappa-caseína e da beta-lactoglobulina com a produção de leite em bovinos da raça Girolando

ARAÚJO, Ítala Iara Medeiros de 6 February 2013 (has links)
Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-04-20T16:36:59Z No. of bitstreams: 1 Itala Iara Medeiros de Araujo.pdf: 682787 bytes, checksum: fc0270c78b2defb1d6aa93cc96d0ae10 (MD5) Made available in DSpace on 2017-04-20T16:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Itala Iara Medeiros de Araujo.pdf: 682787 bytes, checksum: fc0270c78b2defb1d6aa93cc96d0ae10 (MD5) Previous issue date: 2013-02-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Candidate genes of the kappa-casein (CSN3) and beta-lactoglobulin (LGB) are involved in the composition, processing and quality of milk and are linked to production characteristics. This study aimed to evaluate the allele and genotype frequencies of kappa-casein gene (CSN3) and beta-lactoglobulin (LGB) and associate them with milk production of cattle participants Progeny Test Breed Girolando through analysis of variables milk yield in 305 days (P305) and predicted transmitting ability (PTA) for milk. For the study of polymorphisms were genotyped sires 138 and 729 cows (n = 867) for CSN3 and 737 and 131 bulls and cows (n = 868) to LGB. For the association analysis were evaluated 127 bulls and 536 cows (n = 663) and 127 for CSN3 bulls and 536 cows (n = 663) for LGB. The differentiation of allele A / B genes studied was obtained by PCR-RFLP. Allele frequencies, genotype and calculating the probability of Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) were established through the program Popgen versão1.32 and tested by χ ² test at a significance level of 1%. The association study was performed by regression analysis using the GLM procedure of SAS 9.1. The allele and genotype frequencies for the gene CSN3 were, respectively, 0.7324 (AA), 0.2468 (AB) 0.0208 (BB) and 0.8558 (A) 0.1442 (B) and the LGB were, respectively, 0.2604 (AA), 0.4827 (AB) 0.2569 (BB) and 0.5017 (A) 0.4983 (B). The population is in HWE for both genes. No association was found between genes evaluated and analyzed variables. Os genes candidatos da kappa-caseína (CSN3) e da beta-lactoglobulina (LGB) estão envolvidos na composição, processamento e qualidade do leite e estão ligados às características de produção. Objetivou-se avaliar as frequências alélicas e genotípicas do gene da kappa-caseína (CSN3) e da beta-lactoglobulina (LGB) e associá-las à produção de leite de bovinos participantes do Teste de Progênie da Raça Girolando, por meio de análise das variáveis de produção de leite em até 305 dias (P305) e de capacidade prevista de transmissão (PTA) de leite. Para o estudo do polimorfismo, foram genotipados 138 touros e 729 vacas (n = 867) para o CSN3 e 131 touros e 737 vacas (n = 868) para LGB. Para a análise de associação foram avaliados 127 touros e 536 vacas (n = 663) para CSN3 e 127 touros e 536 vacas (n = 663), para LGB. A diferenciação dos alelos A/B dos genes estudados foi obtida por meio da técnica de PCR-RFLP. As frequências alélicas, genotípicas e o cálculo da probabilidade de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foram estabelecidos por meio do programa Popgen versão1.32 e testado pelo teste χ² ao nível de significância de 1%. O estudo de associação foi realizado por meio de análise de regressão utilizando o procedimento GLM do SAS 9.1. As frequências genotípicas e alélicas para o gene CSN3 foram, respectivamente, 0,7324 (AA); 0,2468 (AB); 0,0208 (BB) e 0,8558 (A); 0,1442 (B) e para o LGB foram, respectivamente, 0,2604 (AA); 0,4827 (AB); 0,2569 (BB) e 0,5017 (A); 0,4983 (B). A população encontra-se em EHW para ambos os genes. Não foi detectada associação entre os genes avaliados e as variáveis analisadas.
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Isolamento e caracterização genética de Toxoplasma gondii de gatos ferais no Arquipélago de Fernando de Noronha, Pernambuco, Brasil

MELO, Renata Pimentel Bandeira de 18 February 2016 (has links)
Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-15T16:11:55Z No. of bitstreams: 1 Renata Pimentel Bandeira de Melo.pdf: 793664 bytes, checksum: 79341c83c86e5ba3b6f51a28991d5e93 (MD5) Made available in DSpace on 2016-06-15T16:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Pimentel Bandeira de Melo.pdf: 793664 bytes, checksum: 79341c83c86e5ba3b6f51a28991d5e93 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 Toxoplasma gondii is an obligate intracellular coccidian, tissue cyst forming, which causes toxoplasmosis, zoonotic disease of great impact in public health. T. gondii is able to infect most of warm-blooded animals, including humans. Felids are recognized as the only definitive hosts and are important in toxoplasmosis epidemiology, shedding oocysts in feces, contaminating environment. The purpose of this study was to isolate and genotyping T. gondii in feral cats (Felis catus) from the Fernando de Noronha Archipelago, Pernambuco state, Brazil. During one year sick feral cats were caught by Archipelago Animal Vigilance Center. After chemical restraint (ketamine 10% and xylazine 1%) blood samples of 31 feral cats from different locations on the island were collected. These weak animals posteriorly died and fragments of brain, heart, lung, diaphragm, and liver were collected. Blood samples were intended to serology by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) for IgG antibody detection and tissue fragments were submitted to mouse bioassay for T. gondii isolation. Anti-T.gondii antibodies were detected in 18/31 (58%) felines. Tissues from seven animals were submitted to bioassay, obtaining two T. gondii isolates non-pathogenic for mouse. Genotyping was performed by PCR-RFLP using 10 molecular markers (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 e Apico), identifying an atypical strain of T. gondii (ToxoDB #146). This is the first report of this genotype in feral cats worldwide. The results obtained contribute to molecular epidemiology studies of this pathogen and show/demonstrate T. gondii infection in feline population of the Archipelago. Control measures based on health education should be reinforced to prevent the cat infection and to reduce infection sources for definitive and intermediate hosts, especially to human population of this island. Toxoplasma gondii é um coccídeo intracelular obrigatório formador de cistos teciduais, responsável pela toxoplasmose, zoonose de grande impacto na saúde pública. É capaz de infectar a maioria dos animais homeotérmicos, incluindo humanos. Os felídeos são os únicos hospedeiros definitivos, apresentando grande importância na epidemiologia da toxoplasmose pela capacidade de eliminar oocistos nas fezes, contaminando o ambiente. Este estudo teve como objetivo isolar e genotipar T. gondii em gatos ferais (Felis catus) do Arquipélago de Fernando de Noronha, Estado de Pernambuco, Brasil. Durante o período de um ano, gatos ferais fracos foram capturados pelo Centro de Vigilância Animal do Arquipélago. Após contenção química (quetamina 10% e xilazina 1%) foram coletadas amostras de sangue de 31 felinos ferais de diferentes localidades da Ilha. Esses animais doentes, posteriormente, vieram a óbito e fragmentos de encéfalo, coração, pulmão, diafragma e fígado foram coletados. As amostras de sangue foram destinadas à sorologia por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para pesquisa de anticorpos (IgG) anti-T.gondii e os fragmentos de tecido deos felinos positivos na RIFI foram submetidos ao bioensaio em camundongos para isolamento do protozoário. Anticorpos anti-Toxoplasma gondii foram detectados em 18/31 (58%) felinos. Sete animais tiveram seus tecidos submetidos ao bioensaio, obtendo-se dois isolados de T. gondii não patogênicos para camundongos. A genotipagem foi realizada por meio da PCR-RFLP multilocus, utilizando 10 marcadores genéticos (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 e Apico). Uma cepa atípica de T. gondii (ToxoDB #146) foi identificada, sendo este o primeiro relato deste genótipo em gatos ferais no mundo. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para o estudo da epidemiologia molecular deste agente e permitem concluir que a infecção por T. gondii ocorre na população de felinos do Arquipélago. Medidas de controle baseadas na educação sanitária devem ser reforçadas para prevenir a infecção dos felinos e reduzir as fontes de infecção para outros hospedeiros intermediários, sobretudo para a população humana desta Ilha.
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Meta-analysis of QTL for Fusarium head blight resistance in Chinese wheat landraces using genotyping by sequencing

Cai, Jin 2016 (has links)
Doctor of Philosophy Department of Agronomy Guihua Bai Guorong Zhang Fusarium head blight (FHB) is a devastating fungal disease in wheat, reducing not only grain yield but also quality. The pathogen produces the mycotoxin deoxynivalenol (DON) that induces severe toxicological problems in human and animals. Using host resistance has been the most efficient way to control the disease. To identify quantitative trait loci (QTLs) for FHB resistance in Chinese landrace Haiyanzhong (HYZ), a recombinant inbred lines (RILs) population derived from a cross between HYZ and Wheaton was developed. The RILs were evaluated for percentage of symptomatic spikelets (PSS) in three greenhouse experiments, and genotyped using simple sequence repeats (SSRs) and single nucleotide polymorphism (SNPs) developed from genotyping-by-sequencing (GBS). Eight QTLs were identified for type II (PSS) resistance on chromosomes 5A, 6B, 7D, 2B (2), 3B, 4B, and 4D, with 5A as the major QTL. Ten SNPs closely linked to 5A, 6B, and 2B QTLs were successfully converted to Kompetitave allelic specific PCR (KASP) assays. To identify common QTLs across different populations, we constructed high-density GBS-SNP maps in an additional four RIL populations derived from the Chinese landraces, Wangshuibai (WSB), Baishanyuehuang (BSYH), Huangfangzhu (HFZ), and Huangchandou (HCD) and conducted meta-analysis of the QTLs for FHB resistance using a consensus map developed from the five populations. We identified six MQTLs on chromosomes 3BS (2), 3A, 3D, 2D, and 4D and 23 tightly linked GBS-SNPs to the MQTLs. These GBS-SNPs were successfully converted to KASPs. The KASPs linked to MQTLs can be used for pyramiding these QTL in breeding programs. To quickly reduce FHB damage in U.S. hard winter wheat (HWW), we transferred Fhb1, a major QTL with stable effects on FHB resistance, from Ning7840 into three adapted HWW cultivars Overland, Jagger, and Overley, by marker-assisted backcross (MAB), and assessed the effect of Fhb1 on FHB resistance in these different backgrounds. The results showed that Fhb1 can significantly lower FHB severity, Fusarium-damaged kernel (FDK), and DON accumulation in the all the three HWW backgrounds. Some of the selected lines showed high levels of FHB resistance, but agronomically similar traits as recurrent parents, can be used as resistant parents to improve HWW FHB resistance.
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Genotypizace kmenů bakterie Klebsiella pneumoniae Genotyping of Klebsiella pneumoniae isolates

Nykrýnová, Markéta 2018 (has links)
This master thesis deals with typing of Klebsiella pneumoniae isolates. The first part of the thesis introduces molecular typing methods. Then bacterial genomes and Klebsiella pneumoniae are characterized. Following part describes data validation, assembly of genomes and proposed algorithm for finding genes with high variability. In last part obtained results are presented and validated on other genomes of Klebsiella pneumoniae.
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Automatická genotypizace bakterií metodou rep-PCR Automatic genotyping of bacteria by rep-PCR

Pelikánová, Veronika 2018 (has links)
This thesis deals with automatic bacteria genotyping by rep-PCR method. Its theoretical part presents various methods of DNA typing, basic information on electrophoresis and modern electrophoretic approaches, including their problems, misleading data distortion. In order to automate typing, there has been introduced a program for phylogenetic sample classification from rep-PCR, also applicable for data from chip capillary electrophoresis. The program consists of three main parts: digitization, bandmatching and clustering apparatus to bacterial type classification. The result of the algorithm is a phylogenetic tree, which indicates the cluster of sapmles according to bacterial type. The program has a graphical user interface for possible use in the Children's Hospital. Finally, the program is tested with data from the Children´s Hospital.
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Prospecção de assinaturas de seleção em regiões de QTL associadas com características reprodutivas em novilhas Nelore Prospection of selection signatures in QTL regions associated to reproductive features in Nelore heifers

Montes Vergara, Donicer Eduardo [UNESP] 24 March 2016 (has links)
Submitted by DONICER EDUARDO MONTES VERGARA null (donicer.montes@unisucre.edu.co) on 2016-04-11T17:24:33Z No. of bitstreams: 1 H.Tese-Donicer- Defensa Definitivo -08-04-2016.pdf: 1794206 bytes, checksum: a97a3f4dcd0f3e1489260272006d51af (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-12T14:43:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 montesvergara_de_dr_jabo.pdf: 1794206 bytes, checksum: a97a3f4dcd0f3e1489260272006d51af (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-12T14:43:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 montesvergara_de_dr_jabo.pdf: 1794206 bytes, checksum: a97a3f4dcd0f3e1489260272006d51af (MD5) Previous issue date: 2016-03-24 Características reprodutivas, como a ocorrência de prenhez precoce, são mais importantes economicamente ao comparar-se com as características de crescimento. Desta forma, o aumento da taxa de fertilidade e emprego de animais geneticamente superiores é determinante no progresso da produtividade nas fazendas comerciais de produção de carne bovina. A seleção modifica as frequências alélicas de uma população ao transmitir as variantes gênicas mais interessantes. Considerando o desequilíbrio de ligação, alguns locos adjacentes às mutações favoráveis são transmitidos ao longo das gerações. Estes são conhecidos como assinaturas de seleção e podem ser identificados com o uso de “chips” de SNP e metodologias estatísticas adequadas. Com o objetivo de identificar assinaturas de seleção recentes em QTL previamente mapeados para características reprodutivas de fêmeas bovinas ligadas à precocidade sexual, foram genotipadas 2.035 fêmeas da raça Nelore (Bos taurus indicus) com o chip “Illumina BovineHD BeadChip”. Posteriormente foi inferida a fase de ligação dos SNPs e a reconstrução dos haplótipos. A detecção de assinaturas de seleção foi realizada por meio da aplicação da metodologia “Relative Extended Haplotype Homozygosity” (REHH). A identificação de genes que contribuem para a importância da característica nestas regiões foi feita com a ferramenta Map Viewer do “National Center for Biotechnology Information”- NCBI e GBrowse carregada com o genoma bovino versão UMD 3.1. Foram detectadas 2.756 regiões núcleo, com tamanho médio 27,6 ± 29,1 Kb, abrangendo 70,1 Mb dos 25 cromossomos estudados. Dos SNPs utilizados, 17.312 participaram da formação das regiões núcleo, com o mínimo de 10 no BTA27 e o máximo de 20 SNPs nos cromossomos 1, 3-7, 9-15,18-21, e 23-24. Foram identificadas 40 assinaturas de seleção recentes com diferentes níveis de significância e 56 genes A maioria dos genes localizados nas regiões de assinaturas de seleção tem relação com os processos biológicos de metabolismo mitocondrial, desenvolvimento pós-embrionário, regulação da taxa de ovulação e fertilidade, resposta imune, metabolismo de triglicerídeo, proliferação celular e neurônios receptores olfativos. A investigação de mecanismos regulatórios da expressão dos genes associados aos processos biológicos descritos pode oferecer conhecimentos sobre os mecanismos moleculares que afetam a característica ocorrências de prenhez precoce, na raça Nelore. Some reproductive traits such as early pregnancy are more profitable than those related to growth. Increasing fertility rate and using genetically superior animals are crucial in productivity of meat commercial farms. Artificial selection modifies allele frequencies of a cattle population by transmitting the most significant gene variants. Considering linkage disequilibrium, some loci adjacent to favorable mutations are transmitted across generations. Known as signatures of selection, such locations can be identified by the SNP chips, and appropriate statistical methods. To determine recent selection signature in quantitative trait loci (QTL) previously mapped for reproductive cow features linked to sexual precocity, 2,035 Nelore (Bos taurus indicus) females were genotyped by Illumina Bovine chip. After, inferring the connection phase of SNPs allowed haplotype reconstruction. Selection signatures were detected by Relative Extended Haplotype Homozygosity (REHH) method. Genes supposedly important were recognized by Map Viewer from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and also through a loaded GBrowse with bovine genome UMD, version 3.1. A total of 2,756 core regions were detected, with an average size of 27.6 ± 29.1 Kb, covering 70.1 Mb of 25 chromosomes. 17,312 SNPs are involved in the formation of core regions with at least 10 on BTA27, and a maximum of 20 SNPs on 1, 3-7, 9-15, 18-21, and 23-24 chromosomes. We identify 40 possible recent selection signatures, with different levels of significance, and 56 positional candidate genes. Most of genes located in selection signature regions are related to biological processes of mitochondrial metabolism, post-embryonic development, ovulation rate regulation and fertility, immune response, triglyceride metabolism, cell proliferation, and olfactory receptor neurons. The investigation of regulatory mechanisms of gene expression associated with biological processes described can provide knowledge on the molecular mechanisms affecting characteristic of early pregnancy occurrences in Nellore.
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Aplicação da PCR em Tempo Real Para Detecção, Tipificaçãoe Carga Viral de Papilomavírus Bovino

ALBUQUERQUE, Breno Moacir Farias de 2012 (has links)
Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T18:47:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-BrenoAlbuquerque.pdf: 1989114 bytes, checksum: 513b1650c4c44605e3bda0afef185321 (MD5) Made available in DSpace on 2017-04-06T18:47:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-BrenoAlbuquerque.pdf: 1989114 bytes, checksum: 513b1650c4c44605e3bda0afef185321 (MD5) Previous issue date: 2012 O Papilomavírus bovino(BPV) é o agente etiológico da papilomatosebovina. Esta apresenta lesões que normalmente são benignas e tendem a regredir, porém podem progredir a uma neoplasia. Muitas metodologias utilizadas para detecção de BPV se mostram inespecíficas e apresentam reações cruzadas com outros organismos relacionados. No entanto, a reação quantitativa em tempo real emcadeia da polimerase (qPCR) é uma ferramenta de destaque na detecção, tipificação e quantificação de nucleotídeos e vem sendo utilizada na clínica para avaliar carga viral. O objetivo do trabalho foi desenvolver um novo protocolo de detecção, tipificação e quantificação de BPV através daqPCR. Foram desenhados cinco pares de primers, que possuem como alvo uma região conservada do genoma viral (gene L1) de diferentes BPVs. A seletividade dos primers foi testada in vitroe DNA extraído de células MDBK não infectadas foram utilizados como controle negativo. A técnica de qPCR permitiu detectar, tipificar e quantificar material viral dos BPVs 1, 2, 4, 5 e 6. O limiar relativo da detecção foi de 4fg de DNA,emtorno de 30-40 cópias de DNA/μL. Dos cinco pares de primers produzidos, quatro apresentaram mesmo perfil térmico durante a qPCR (qPCRBPV2, 4, 5 e 6), permitindo em um único procedimento detectar e tipificar os quatro tipos virais. A distinção das amostrasfoi realizada através da análise de meltingque permitiu tipificá-las. Através da metodologia desenvolvida foi observado que em lesões cutâneas de bovinos infectados com BPV a carga viral não se mostrou inferior a 1000 cópias/μL, enquanto que a técnica permite quantificar até um limiar de 40 copias de DNA/μl. Este trabalho possui relevância para validação de qPCR como diagnóstico da papilomatose bovina e particular importância quando aplicado em estudos da infecção pelo BPV e no monitoramento por veterinários da eficácia das futuras vacinas. Bovine papillomavirus (BPVs) is the etiologic agent of bovine papilomatose which is characterized by hyper proliferative lesions. Papillomas in cattle are typically benignandoften regress, but occasionally lesions can persist and progress to malignant neoplasia.The majority of current techniques for identification of BPV is unspecific andpossessescross-reactivity with closely related organisms.The Real-time quantitative polymerase chain reaction assay (qPCR) has become an exceptional tool for detection and quantification of oligonucleotides and has been utilized increasingly on viral load evaluation.Aiming to develop a new protocol for fast detection, typification and quantification of BPV in qPCR, we designed five pairs of Oligonucleotides for BPV1, 2, 4, 5 and 6 focusing on L1 gene. The qPCR primers sets were testedin vitroandMadin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)DNA was also used as negative control.The Real-time qPCR assay provided an accurate detection and quantification for the BPVs 1, 2, 4, 5 and 6. The relative detection limit for the assays was 4fg or 30 to 40genome equivalents. Four primers pairs (qPCRBPV2, 4, 5 and 6) had the same annealing temperature and their products showed differences on meltingpoints analyses. Through the meltingpoint analysis, samples can be identified and discriminated as a screening and then samples can be run for viral load. In our study we tested the viral load in bovine cutaneous skin warts and observed infections with 1000 copies/μl at least. However, this assay could reach levels of 40copies/μL. In conclusion, this methodology has an important impact on the validation of qPCR as a BPV diagnosis. Its relevance is proved when applied to BPV infection studies and the monitoring of the efficacy of future BPV vaccinesby veterinarians.
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Comparação genotípica e fenotípica de diferentes isolados clínicos de colonização e candidemia por Candida rugosa Genotypic and phenotypic comparisons among different clinical isolates of colonization and candidemia by Candida rugosa

Terçarioli, Gisela Ramos [UNIFESP] 29 July 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:26Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00231.pdf: 1784115 bytes, checksum: 4dcd9596246858abd2e260995c2c0ab4 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Introdução: Candida rugosa é um patógeno emergente que merece destaque pela sua maior ocorrência em países da América Latina. Esta levedura tem o potencial de colonizar e causar infecções de corrente sanguínea no homem, bem como de apresentar resistência a diversos antifúngicos, principalmente aos azólicos. Objetivos: comparar caracteres fenotípicos, como atributos de virulência e sensibilidade antifúngica, além de realizar identificação e tipagem molecular de isolados clínicos de C. rugosa obtidos de pacientes que desenvolveram candidemia, com cepas isoladas de pacientes que foram somente colonizados por esta espécie, sem desfecho de candidemia na internação. Também foi de nosso interesse avaliar tais diferenças entre as cepas provenientes de pacientes internados ao longo de dois períodos avaliados: 1995/96 e 2001/02. Material e Métodos: As cepas foram caracterizadas fenotipicamente quanto a fatores de virulência, incluindo a produção de enzimas extracelulares (proteinase, fosfolipase e lipase) e a formação de biofilme. Foram realizados teste de susceptibilidade a cinco antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo, sendo eles: anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e anidulafungina. Para confirmação de espécie e avaliação de variabilidade genotípica, foram utilizadas as técnicas moleculares de RAPD, microssatélite e sequenciamento da região ITS (rRNA). Resultados: Observou-se grande variabilidade nos resultados referentes à produção de enzimas hidrolíticas. A população foi classificada, no geral, como baixa produtora de proteinase, não produtora de fosfolipase e baixa e média produtora de biofilme. A produção de lipase foi o único fator de virulência expresso de maneira considerável pelos isolados clínicos, destacando-se a alta produção desta enzima por cepas isoladas de sangue, sugerindo a importância da mesma no estabelecimento de infecção por C. rugosa. Com relação à sensibilidade aos antifúngicos, os isolados mostraram-se sensíveis a todas as drogas, exceto ao fluconazol. A avaliação dos resultados obtidos por 3 diferentes métodos moleculares demonstrou alto relacionamento filogenético entre os isolados clínicos, exceto pela cepa de referência a qual foi sempre posicionada em diferente cluster. A análise genotípica revelou similaridade de 90,5% entre todos os isolados, e de 87% para a cepa de referência ATCC1051 pela técnica de RAPD, e uma similaridade de 92% entre os isolados clínicos e de 86,5% para a cepa controle pelo método de microssatélite. O seqüenciamento da região ITS identificou todos os isolados como sendo C. rugosa, apresentando uma identidade que variou de 89% a 93% para os isolados clínicos, e 99% para a cepa de referência ATCC10571. Conclusões: Não foi possível estabelecer uma correlação direta entre a expressão de todos os fatores fenotípicos avaliados e o desfecho clínico dos pacientes, embora haja evidências importantes da atividade de lipase influenciando candidemia por C. rugosa. Sugere-se que houve uma disseminação clonal dos isolados de C. rugosa no ambiente hospitalar avaliado ao longo de vários anos. Adicionalmente, as diferenças genéticas encontradas entre os isolados clínicos e a cepa de referência ATCC10571, juntamente com algumas diferenças fenotípicas observadas exclusivamente nesta cepa, tais como alta produção de biofilme, macromorfologia acentuadamente rugosa e baixa atividade de lipase, indicam a possibilidade de heterogeneidade do táxon C. rugosa. Introduction: Candida rugosa is an emergent pathogen recognized by its higher occurrence in Latin American countries. This yeast has the ability to colonize and cause human bloodstream infections as well as to show resistance to several antifungal drugs, specifically to azoles. Objectives: To compare phenotypic properties such as virulence attributes and antifungal susceptibility, as well as to perform molecular identification and typing of C. rugosa clinical isolates obtained from patients who were either colonized or developed candidemia due to this species during the hospitalization period. We were also interested in evaluating such differences among strains isolated across two different periods: 1995/96 and 2001/02. Material and Methods: The strains were phenotypically characterized according to virulence factors, including the production of extra cellular enzymes (protease, phospholipase and lipase) and biofilm formation. We performed susceptibility testing to 5 antifungal drugs by using broth microdilution: amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and anidulafungin. To confirm identification to the species level and evaluate genetic variability, we have employed RAPD, microsatelite and rDNA ITS region sequencing. Results: Phenotypic properties varied considerably among the isolates, specifically regarding to hydrolytic enzymes production. Most of the isolates were low proteinase producers. The strains were phospholipase negative and showed a not very expressive biofilm formation in general. Nevertheless, lipase production was the only virulence factor considerably expressed by the clinical isolates, specifically by blood strains, suggesting the importance of this attribute in C. rugosa infection. The strains were sensitive to all the antifungal drugs tested, except fluconazole. The clinical isolates were highly related as determined by 3 different methods. However the control strain ATCC10571 was considered genotipically very different Our isolates were 90.5% similar among them and 87% similar to C. rugosa control strain as determined by RAPD, and 92% similar among them and 86,5% similar to ATCC10571, as determined by microsatelite. All the isolates were identified as C. rugosa by ITS region sequencing. The percentage of similarity ranged from 89% to 93% for the clinical isolates, and 99% to C. rugosa ATCC10571. Conclusions: It was not possible to establish a direct relationship between the expression of all virulence properties and patients clinical outcomes. However there is mounting evidence that lipase activity influences candidemia due to C. rugosa. It is possible that clonal dissemination in the hospital environment have occurred throughout several years. In addition, the genetic differences found between our isolates C. rugosa control strain ATCC10571, together with the phenotypic differences observed, such as higher biofilm formation and rough colony morphology, as well as low lipase activity for this control strain, suggest the genetic heterogeneity among the taxon C. rugosa. TEDE BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Espécies de Cryptococcus obtidas de isolados clínicos e ambientais da cidade de Campinas, SP : genotipagem e avaliação da suscetibilidade "in vitro" frente a agentes antifúngicos isolados e em diferentes combinações Cryptococcus species obtained from clinical and environmental isolates from the city of Campinas, SP : genotyping and assessment of in vitro susceptibility of antifungal agents alone and in different combinations

Reichert Lima, Franqueline, 1985- 2014 (has links)
Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Made available in DSpace on 2018-08-25T21:59:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReichertLima_Franqueline_M.pdf: 2034183 bytes, checksum: 203b846210e23f42a824280eb3cadda2 (MD5) Previous issue date: 2014 Resumo: O gênero Cryptococcus engloba duas espécies consideradas patogênicas: C.neoformans e C.gattii. Apesar dos avanços na área médica, a criptococose permanece uma das infecções fúngicas sistêmicas mais importantes no Brasil. Anfotericina B (AMB) associada a flucitosina (5FC) é a terapia de indução indicada porém, no Brasil, 5FC não está disponível e o tratamento segue somente com AMB ou em associação com fluconazol (FCL). Este trabalho avaliou a ocorrência de espécies e os genótipos de isolados clínicos de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP em um período de 5 anos; isolados ambientais coletados na cidade de Campinas-SP e o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos sozinhos contra isolados clínicos e ambientais e o efeito de combinações de antifúngicos frente a isolados clínicos de Cryptococcus spp.. A identificação de espécies e genótipos foi realizada por testes bioquímicos, Restriction Fragment Length Polymorphism do gene URA5 (URA5-RFLP) e sequenciamento da região Internal Transcribed Spacer (ITS) do DNA ribossomal. Testes de suscetibilidade para AMB, 5FC, FCL, voriconazol (VRC), itraconazol (ITC) e terbinafina (TRB) isolados foram realizados conforme CLSI M27-A3 (2008). Os testes com antifúngicos combinados (AMB+5FC; AMB+FCL; AMB+TRB; FCL+TRB), foram realizados pelo método do "tabuleiro de xadrez" para determinação do Coeficiente de Inibição Fracional (CIF) para avaliar o tipo de interação entre as substâncias (sinergismo, indiferença ou antagonismo). Dentre 75 isolados clínicos reativados, foram identificados 66 C.neoformans e 9 C.gattii. Todos C.gattii pertenceram ao genótipo VGII enquanto que 62 isolados de C.neoformans ao genótipo VNI e apenas 4 ao genótipo VNII. Foram obtidos 92 isolados ambientais de Cryptococcus, pertencentes às espécies C.neoformans (genótipo VNI), C.laurentii, C.albidus, C.flavescens e Cryptococcus spp.. Os valores dos intervalos de CIM para C.neoformans clínicos foram AMB: ? 0,125-1 µg/mL; 5FC: ? 0,125-2 µg/mL; FCL: 0,25-8 µg/mL; VRC: ? 0,015-0,125 µg/mL; ITC: 0,03-0,25 µg/mL e TRB: 0,125-2 µg/mL. Intervalos de CIM para C.gattii variaram de 0,25-1 µg/mL para AMB; 0,5-4 µg/mL para 5FC; 2-16 µg/mL para FCL; 0,06-0,25µg/mL para VRC; 0,06-0,5 µg/mL para ITC e 0,5-4 µg/mL para TRB. Foram observados elevados valores de CIM para os antifúngicos 5FC e FCL frente aos isolados ambientais de C.albidus e C.laurentii. O genótipo VNI de C.neoformans clínico mostrou 75,80% de interação sinérgica para AMB+5FC; 79,03% para AMB+FCL; 77,42% para AMB+TRB e 95,16% para FCL+TRB. O genótipo VNII apresentou 100% de sinergismo em todas as combinações. C.gattii (VGII) apresentou 88,9% de sinergismo nas combinações AMB+5FC e AMB+FCL; 100% para AMB+TRB e FCL+TRB. Não foi observado efeito antagônico nas combinações de antifúngicos. Foi observado bom desempenho nas combinações realizadas, especialmente naquelas envolvendo a TRB para ambas as espécies C.neoformans e C.gattii. O genótipo VNI foi o predominante entre os genótipos que afetam os pacientes com criptococose na região de Campinas. Em infecções de difícil tratamento ou que não respondem aos antifúngicos convencionais, a combinação de diferentes antifúngicos como AMB+TRB ou FCL+TRB podem vir a ser uma alternativa em países onde 5FC não está disponível, como no Brasil. Mais estudos são necessários para avaliar o papel dos genótipos na sensibilidade aos antifúngicos, assim como estudos de combinações de antifúngicos in vitro e in vivo para que novas estratégias possam ser empregadas no tratamento da criptococose Abstract: Cryptococcus genus comprises two species considered pathogenic: C.neoformans and C.gattii. Despite advances in the medical field, cryptococcosis remains one of the most important systemic fungal infections in Brazil. Amphotericin B (AMB) associated with flucytosine (5FC) induction therapy is indicated but, in Brazil, 5FC is not available and treatment follows only with AMB or in combination with fluconazole (FCL). This study evaluated the prevalence of species and molecular subtypes of clinical isolates from patients treated at the Hospital of UNICAMP in a period of 5 years; environmental isolates collected in Campinas ¿ SP and in vitro antifungal susceptibility profile of antifungal agents alone against clinical and enviromental isolates of Cryptococcus spp. and the effect of combinations of antifungal agents against clinical isolates of Cryptococcus spp.. The species identification and subtyping was performed by biochemical tests, Restriction Fragment Length Polymorphism of URA5 gene (RFLP - URA5) and sequencing of the Internal Transcribed Spacer region (ITS) of ribosomal DNA. Susceptibility tests for AMB, 5FC, FCL, voriconazole (VRC), itraconazole (ITC) and terbinafine (TRB) isolated were performed according to CLSI M27-A3 (2008). Combined antifungals tests (AMB +5FC; AMB+FCL; AMB +TRB, FCL+TRB), were performed by the "Checkerboard" method to determine the Fractional Inhibitory Coefficient index (FIC) to assess the type of interaction between substances (synergism, indifference or antagonism). Among the 75 viable clinical isolates, 66 were identified as C.neoformans and 9 as C.gattii. All C.gattii belonged to subtype VGII while 62 isolates belonged C.neoformans VNI genotype and only 4 VNII. 92 environmental isolates of Cryptococcus were obtained. The species C.neoformans (subtype VNI) C.laurentii, C.albidus, C.flavescens and Cryptococcus spp.were identified. The MIC range values of clinical C.neoformans for AMB were: ? 0.125 -1 µg/mL; 5FC: ? 0.125 to 2 µg/mL; FCL: 0.25-8 µg/mL; VRC: ? 0.015 to 0.125 µg/mL; ITC: 0.03 to 0.25 µg/mL and TRB: 0.125 to 2 µg/mL. MIC for C.gattii ranged from 0.25-1 µg/mL for AMB; 0.5-4 µg/mL for 5FC; 2-16 µg/mL for FCL; 0.06 to 0.25 µg/mL for VRC; 0.06 to 0.5 µg/mL for ITC and 0.5-4 µg/mL for TRB. High MIC values were observed for FCL and 5FC against environmental isolates of C.albidus and C.laurentii. The VNI C.neoformans genotype showed 75.80 % of synergistic interaction for AMB+5FC; 79.03 % for AMB + FCL; 77.42 % for AMB + TRB and 95.16 % for FCL+TRB. The VNII genotype showed 100% synergism in all combinations. C.gattii (VGII) showed 88.9 % of synergism in combinations AMB+5 FC and AMB+FCL; 100 % for AMB+TRB and TRB+FCL. No antagonistic effect was observed in all evaluated antifungal combinations. Good performance was observed in all combinations performed, especially those involving TRB for both C.neoformans and C.gattii species. The VNI was the predominant genotype among genotypes affecting patients with cryptococcosis in Campinas region. In difficult to treat infections or unresponsive to conventional antifungal agents, the combination of different antifungals so as AMB+FCL or TRB+TRB may become an alternative in countries where 5FC is not available, as in Brazil. More studies are needed to evaluate the role of genotypes in sensitivity to antifungal agents, as well as antifungal agents combination studies in vitro and in vivo so that new strategies can be employed in the treatment of cryptococcosis Mestrado Ciencias Biomedicas Mestra em Ciências Médicas
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Analise molecular dos genotipos do virus da hepatite B em pacientes do estado de São Paulo, sudeste do Brasil Molecular analysis of the genotypes of hepatitis B virus (HBV) in patients in state of São Paulo, Southeast of Brazil

Tonetto, Priscila Aparecida 2006 (has links)
Orientadores: Fernando Lopes Gonçales Junior, Neiva Sellan Lopes Gonçales Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Made available in DSpace on 2018-08-07T22:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonetto_PriscilaAparecida_M.pdf: 2027435 bytes, checksum: ec4453a66ae541917395dc0f14142ed8 (MD5) Previous issue date: 2006 Resumo: O vírus da hepatite B (VHB) pode ser classificado em oito principais genótipos (A-H), e essa classificação tem uma distribuição geográfica determinada. Os genótipos do VHB podem influenciar na progressão de doença. O objetivo foi determinar os genótipos e os subtipos do VHB e correlacioná-los com as variáveis clínicas epidemiológicas, laboratoriais e histológicas. Foram determinados os genótipos de 139 amostras de soro de pacientes infectados pelo VHB, coletadas em Campinas, no estado de São Paulo, Brasil. O método para genotipagem utilizado foi o seqüenciamento parcial do gene S do VHB. Os primers utilizados foram desenhados a partir de seqüências do gene S, com genótipo determinado, depositadas no GenBank. Todas as seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências depositadas no GenBank para determinação dos genótipos. O genótipo A (55%) do VHB foi o mais predominante na população, seguido pelos genótipos C (3%), D (38%) e F (4%). Entre os pacientes infectados pelos genótipos A e D, observou-se uma provável descendência africana de 18% (14/76) e 11% (6/53), respectivamente. Entre os quatro pacientes infectados pelo genótipo C, dois possuíam descendência asiática e dois eram caucasianos. Todos os pacientes infectados pelo genótipo F eram caucasianos sem ascendência indígena relatada. Aproximadamente 30% dos pacientes eram HBeAg positivo e 70% eram HBeAg negativo. A carga viral do DNA-VHB foi aproximadamente cinco vezes mais alta entre os HBeAg positivo quando comparada aos HBeAg negativo. Os genótipos A e D são os mais prevalentes entre os pacientes, aparentemente em virtude da imigração européia em nossa região Abstract: Hepatitis B virus (HBV) can be classified into eight major genotypes (A-H) that have mainly a geographic distribution. The HBV genotype may influence disease progression. Our objective was to determine the genotypes and the subtypes of HBV and to correlate them with the with variables clinical epidemiologies, laboratories and histological. Hepatitis B virus genotypes were determined in 139 plasma samples collected in Campinas, in the state of São Paulo, Brazil from HBV-infected patients. A method for genotyping hepatitis B virus by partial HBsAg gene sequencing with primers common to all known genotypes was developed. The results of sequencing corresponded to those found in HBV isolates obtained from GenBank, including all of the known HBV genotypes. HBV genotype A was predominant in our sample, appearing in 76 patients (55%), while genotypes C, D and F was found in 4 (3%), 53 (38%) and 6 (4%) of the patients, respectively. Among the patients infected by genotypes A and D, were observed a probably African descendents of the 18.3% (14/76) and 11.3% (6/53), respectively. Among the genotype C infected patients, 2 (50%) were of Asian descendents and 2 were Caucasians. The genotype F infected patients were all Caucasians without told indigenous origin. About 30% of the patients were HBeAg positive and 70% were HBeAg negative. The viral load of HBV-DNA was about 5 times higher among HBeAg positive than in HBeAg-negative patients. Genotypes A and D were the most prevalent among our HBV-infected patients, apparently a consequence of the types of immigration to our region Mestrado Ciencias Basicas Mestre em Ciências Médicas

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