Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese monodisperser, multifunktionaler Poly(amidoamine) (PAAs). Die Klasse der PAAs ist besonders interessant für eine Anwendung im Bereich der Biomedizin, da sie meist nicht toxisch ist, eine sehr geringe Immunogenizität zeigt und eine erhöhte Zellmembranpermeabilität besitzt. Allerdings ist der Einsatz linearer PAAs bisher limitiert, da ihre Synthese nur den Zugang von hoch-polydispersen Systemen mit einer streng alternierenden oder statistischen Verteilung von Funktionalitäten erlaubt. Es ist daher von großem Interesse diese Polymerklasse durch die Möglichkeit eines sequenzdefinierten Aufbaus und der Integration von neuen Funktionalitäten zu verbessern. Um dies zu ermöglichen, wurden, vergleichbar mit der etablierten Festphasensynthese von Peptiden, schrittweise funktionale Disäure- und Diamin-Bausteine an ein polymeres Träger-Harz addiert. Der sequenzielle Aufbau ermöglicht die Synthese monodisperser PAAs und die Kontrolle über die Monomersequenz. Die Wahl der Monomer-Bausteine und ihrer Funktionalitäten kann dabei für jede Addition neu getroffen werden und entscheidet so über die Sequenz der Funktionalitäten im Polymerrückgrat. Die verwendete Chemie entspricht dabei der Standardpeptidchemie, so dass mit Hilfe eines Peptidsynthese-Automaten die Synthese vollständig automatisiert werden konnte. Die Verwendung spezieller Trägerharze, die bereits mit einem synthetischen Polymerblock wie PEO oder auch mit einem Peptid vorbeladen waren, erlaubt die direkte Synthese von PEO- und Peptid-PAA Blockcopolymeren. Da die hier dargestellten PAAs später auf ihre Eignung als multivalente Polykationen in der Gentherapie getestet werden sollten, wurden zunächst Bausteine gewählt, die den Einbau verschiedener Aminfunktionalitäten ermöglichen. Die Bausteine müssen dabei so gewählt sein, dass sie kompatibel sind mit der Chemie des Peptidsynthesizers und eine quantitative Addition ohne Neben- oder Abbruchreaktionen garantieren. Darüber hinaus ist der Einbau von Peptidsequenzen und Disulfid-Einheiten in die PAA-Kette möglich, die z. B. für einen selektiven Abbau des Polymers im Organismus genutzt werden können. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die in dieser Arbeit vorgestellten PAA-Systeme großes Potenzial als nicht-virale Vektoren für die Gentransfektion bieten. Sie sind nicht toxisch und zeigen Zellaufnahme-Effizienzen von bis zu 77%. Die Gentransfereffizienz ist im Vergleich zu etablierten Polymer-Vektoren zwar noch sehr gering, aber die bisherigen Versuche zeigen bereits eine mögliche Ursache, nämlich die schlechte Freisetzung des Genmaterials innerhalb der Zelle. Eine Lösung dieses Problems bietet jedoch die weitere Modifizierung der PAA-Systeme durch den Einbau von Sollbruchstellen. Diese Sollbruchstellen ermöglichen einen programmierten Abbau des Polymers innerhalb der Zelle und damit sollte die Freisetzung des Genmaterials vom Träger deutlich erleichtert werden. Mögliche Bruchstellen sind z. B. enzymatisch gezielt spaltbare Peptideinheiten oder Disulfid-Einheiten, wie sie bereits als Bausteine für die PAA-Synthese vorgestellt wurden (vergl. Kapitel 4.4). Da nur innerhalb der Zelle ein reduzierendes elektrochemisches Potential besteht, werden z. B. Disulfid-Einheiten auch nur dort gespalten und bieten außerhalb der Zelle ausreichende Stabilität zum Erhalt der Polyplexstruktur. Neben einer Anwendung in der Gentherapie bieten die hier vorgestellten PAA-Systeme den Vorteil einer systematischen Untersuchung von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen der Polyplexe. Es wurden verschiedene Zusammenhänge zwischen der chemischen Struktur der PAA-Segmente und der Art und Stärke der DNS-Komprimierung aufgezeigt. Die Komprimierungsstärke wiederum zeigte deutlichen Einfluss auf die Internalisierungsrate und damit auch Transfektionseffizienz. Darüber hinaus zeigte sich ein drastischer Einfluss des PEO-Blocks auf die Stabilisierung der Polyplexe sowie deren intrazelluläre Freisetzung bei Zusatz von Chloroquin. Dennoch bleiben aufgrund der Komplexität der Zusammenhänge noch viele Mechanismen der Transfektion unverstanden, und es muss Aufgabe folgender Arbeiten sein, das Potential der hier eingeführten monodispersen PAA-Systeme weiter auszuloten. So wäre z. B. eine Korrelation der Kettenlänge mit den Parametern der Polyplexbildung, der Zellaufnahme und Transfektionseffizienz von großem Interesse. Darüber hinaus bietet der Einbau von Sollbruchstellen wie kurzen Peptidsequenzen oder den hier bereits eingeführten Disulfid-Einheiten neue Möglichkeiten der gezielten Freisetzung und des programmierten Abbaus, die näher untersucht werden müssen. Neben der Anwendung im Bereich der Gentransfektion sind außerdem andere Gebiete für den Einsatz von monodispersen multifunktionalen PAAs denkbar, da diese kontrollierbare und einstellbare Wechselwirkungen ermöglichen. / Recently, linear poly(amidoamine)s (PAAs) have received considerable attention due to their excellent biocompatibility and ease of synthesis.[1] PAAs are multifunctional polymers, which often exhibit low inherent immunogenicity and reduced cyto- as well as hemotoxicity in contrast to established, cationic polymers such as poly(ethylene imines) (PEI) or poly(L-lysines) (PLL).[2] This makes PAAs highly suitable for biomedical and pharmacological applications in the fields of drug and gene delivery.[1,2] However, the full potential of these polymers cannot be accessed since the synthesis proceeds via an uncontrolled polyaddition reaction leading to ill-defined products with Mw/Mn ≥ 2. This does not only make rational design of polymer properties and the precise positioning of functionalities along the polymer backbone difficult, furthermore product registration becomes complicated because legislation requires increasingly more defined products. Here we present a novel synthesis route towards multifunctional, sequence-defined polyamides.[3] A fully automated, solid-phase polymer synthesis was developed and utilized to obtain linear PAA segments. These exhibit no molecular weight or chemical distributions due to their monodispersity (Mw/Mn = 1) and their controlled monomer sequence. The compatibility of the PAA-synthesis with the standard Fmoc/tBu solid-phase supported peptide synthesis has been preserved, making this route a versatile approach to peptide-PAA (Pep-PAA) and poly(ethylene oxide)-PAA (PEO-PAA) conjugates. Several Pep-PAA and PEO-PAA conjugates were synthesized, exhibiting PAA segments with different cationic functionalities. These conjugates were analyzed concerning their cytotoxicity showing very promising results. Additionally their potential to complex plasmid-DNA and to form so-called polyplexes for non-viral gene delivery was tested. A strong relationship between the monomer sequence and the polyplex structure was observed, depending on the balance and total amount of tertiary, secondary and primary amine functionalities within the PAA-segment. Moreover the monomer sequence has a strong influence on the biological properties such as the cell-internalization of polyplexes as well as the transfection activity. This clear correlation between the chemical assembly and the resulting biological properties may help to further the understanding of the mechanisms of gene delivery by polymeric carriers and hence to promote the rational design of better suited systems. Even if the transfection activity for the PAA-polpylexes might still be not comparable to the established “gold standard” PEI, their low level of toxicity and the possibility to improve the system by adjusting the monomer sequence shows great potential as carrier systems in drug or gene delivery.

Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Bis heute gibt es keine ursächliche Therapie für die Herzinsuffizienz, die die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von unterschiedlichen kardialen Erkrankungen bildet. Auch die Gentherapie hat in der Kardiologie, anders als in anderen Bereichen, noch keinen großen Fortschritt erzielen können. Das Kalziumsensorprotein S100A1 stellt aber einen vielversprechenden Kandidaten für die kardiale Gentherapie dar, da es als zentraler Regulator der Herzfunktion und des Kalziumsignalwegs innerhalb der Kardiomyozyten identifiziert werden konnte. Ziele der Untersuchungen: Diese translationale Studie sollte dazu beitragen, dem Ziel einer kardialen Gentherapie der kardialen Dysfunktion einen Schritt näher zu kommen. Zum einen sollte hierzu ein auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) basierender Vektor (rAAV) des Serotyps 5 in Verbindung mit einem kardiospezifischen Promotor (CMVenh/0,26 kb-MLC) auf seine Anwendbarkeit und Sicherheit für die kardiale Gentherapie untersucht werden. Durch eine umfangreiche Testung auf präexistierende neutralisierende Serumfaktoren (NSF) sollte zudem untersucht werden, ob das Schwein generell ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte präklinische Studien darstellt. Zum anderen sollte in einem endpunktbasierten Studiendesign der Effekt der hS100A1-Gentherapie nach Myokardinfarkt (MI) im humanrelevanten Großtiermodell weiter charakterisiert werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 83 juvenile Schweine aus einem kommerziellen Herkunftsbetrieb verwendet. Vor Versuchsbeginn wurde das Serum von 40 Tieren mittels eines auf Durchflusszytometrie basierenden Zellreporter-Assays auf präexistierende NSF gegen AAV5 untersucht. Für die Hauptstudie wurde bei 8 Tieren eine 2 stündige perkutane Okklusion des Ramus circumflexus der linken Koronararterie (LCX) durchgeführt und so ein ischämischer Myokardinfarkt mit anschließender Reperfusion und resultierender kardialer Dysfunktion induziert. Nach 2 Wochen wurden Infarktgröße und Herzfunktion mittels Kardio-Magnetresonanztomographie (MRT) evaluiert. Die Tiere wurden in die Therapiegruppe (AAV5-hS100A1, 5 Tiere) oder Kontrollgruppe (AAV5-hRluc, 3 Tiere) aufgeteilt. Der Gentransfer (1x1013 virale Genomkopien (vgc)/Tier)) erfolgte per retrograder koronarvenöser Infusion. 12 Wochen nach Gentransfer wurde eine erneute Kardio-MRT Untersuchung durchgeführt. Zur Überprüfung der pharmakologischen Sicherheit wurden während des Versuchs serielle Blut und Elektrokardiogramm (EKG) Untersuchungen durchgeführt. Am Versuchsende wurden die Tiere schmerzfrei getötet und ihre Organe für weitere molekularbiologische Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Verteilung und Transkriptionseffizienz der vgc wurde aus den Gewebeproben DNA und RNA isoliert und anschließend eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine Next-Generation Sequenzierung der myokardialen RNA, die mit einer gewichteten Gen Co-Expressionsanalyse (WGCNA) und anschließender Anreicherungsanalyse untersucht wurde. Zur Reduktion der Tierzahl wurde die Studie Endpunkt orientiert durchgeführt: sobald die beiden Gruppen signifikant unterschiedliche Ergebnisse in den Endpunkten (EF und Infarktausweitung) erzielten, wurde die Studie beendet. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen eine niedrige anti-AAV5-Seroprävalenz in der Hausschweinpopulation. Die AAV5-hS100A1-Gentherapie führte nach 12 Wochen zu einer signifikanten Verringerung der Infarktausweitung und zu einer signifikant höheren EF im Vergleich zur Kontrollgruppe (ungepaarter zweiseitiger Student t-Test, p < 0,05). Die EKG- und Blutuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf Toxizität. Die Transkriptomanalyse der Myokardproben lieferte mit der EF und Infarktausweitung signifikant und stark negativ korrelierende pathophysiologisch relevante Signalwege. Dabei scheint u.a. eine antiinflammatorische Wirkung von AAV5-hS100A1 von großer Bedeutung zu sein. Erstmals konnte auch eine Interaktion zwischen S100A1 und der kardioprotektiven Retinsäure gezeigt werden. In einer aufgrund der hohen Mortalität während der MI-Induktion eingeschobene Versuchsreihe mit 72 Tieren konnte durch den Wechsel des Narkosegases von Isofluran auf Sevofluran die Mortalität signifikant gesenkt werden (einseitiger Fisher’s exact test, p < 0,05). Schlussfolgerungen: Das Schwein stellt ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte Versuchsvorhaben dar. Das zu testende Konstrukt AAV5-hS100A1 mit CMVenh/0,26 kb-MLC Promotor zeigte bei einer hohen pharmakologischen Sicherheit eine robuste und weitestgehend kardiospezifische Expression des Transgens 12 Wochen nach Gentransfer. Es verfügt somit über ein großes therapeutisches Potenzial. Die Studie konnte dazu beigetragen, neue Signalwege zu identifizieren, die für den Wirkmechanismus von S100A1 relevant sein könnten. Durch die Änderung des Narkosegases konnte die Mortalität bei der MI-Induktion gesenkt werden. In zukünftigen MI-Studien sollte daher die Aufrechterhaltung der Inhalationsanästhesie bevorzugt mittels Sevofluran erfolgen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung / Introduction: Cardiovascular diseases are the prevailing cause of death worldwide. To date, there is no causal therapy for heart failure, which represents the common endpoint of a large number of different cardiac diseases. Even the promising gene therapy approach has not yet been able to achieve relevant progress in this field. Identified as a central regulator of cardiac activity and calcium signaling in cardiomyocytes, the calcium-sensor protein S100A1 represents a highly suitable candidate for cardiac gene therapy. Objective: The overall goal of this translational study is to advance the field of gene therapy for cardiac dysfunction. On the one hand, the on adeno-associated viruses (AAVs) based vector (rAAV) of serotype 5 was tested in combination with a cardiac-specific promotor (cmvenh/0,26 kb-mlc) for its applicability and safety for cardiac gene therapy. Beforehand, extensive testing for preexisting neutralizing serum factors (nsf) was performed to decipher whether the pig is a suitable model for AAV5-based preclinical studies. On the other hand, the effect of the hS100A1 gene therapy after myocardial infarction (MI) was further characterized in a clinically relevant large animal model with an endpoint-based study design. Animals, materials and methods: A total of 83 juvenile farm pigs were used. Before starting the experiment, we analyzed serum from 40 animals for preexisting nsf against AAV5 using a flow cytometry-based cell reporter assay. For the main study, we used 8 animals in which we induced an ischemic myocardial infarction with subsequent reperfusion by occluding percutaneously the ramus circumflexus of the left coronary artery (LCX) for 2 hours to generate cardiac dysfunction. After 2 weeks, we evaluated infarct size and cardiac function with cardiac magnetic resonance imaging (MRI). Animals were divided into the treatment group (AAV5-hS100A1, 5 animals) and the control group (AAV5-hRluc, 3 animals). We applied gene transfer (1x1013 viral genome copies (vgc)/animal) using retrograde coronary venous infusion. We repeated the cardiac MRI 12 weeks after gene transfer. Serial blood and electrocardiogram (ECG) tests were performed during the experiment to verify pharmacological safety. At the end of the study, the animals were euthanized and their organs were collected for further molecular analyses. To investigate the distribution and transcriptional efficiency of the vectors, we isolated DNA and RNA from the tissue samples and performed real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In addition, a next-generation sequencing of myocardial RNA was conducted and analyzed with weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and subsequent enrichment analysis. To reduce the number of animals, the study was end point oriented: When reaching significant differences in the primary end points (ejection fraction (EF) and infarct extension), the study was terminated. Results: The results demonstrate a low anti-AAV5 seroprevalence in the farm pig population. After 12 weeks, the AAV5-hS100A1 gene therapy resulted in a significant reduction of infarct extension and a significantly higher EF compared to the control group (unpaired two-sided Student t-Test, p < 0.05). ECG and blood tests did not show any indications of toxicity. The transcriptome analysis of the myocardial samples provided a significant negative correlation between relevant pathological signaling pathways and EF/infarct extension, thus giving clues to underlying mechanisms. Among these, an anti-inflammatory effect of AAV5-hS100A1 appears to be of major importance. For the first time, we could also demonstrate an interaction between S100A1 and the cardioprotective retinoic acid. Due to the high mortality during MI-induction, we incorporated a test series with 72 animals. By changing the anesthetic gas from isoflurane to sevoflurane, we could significantly reduce the mortality (one-sided Fisher's exact test, p < 0.05). Conclusions: The pig represents a suitable model for AAV5-based studies. 12 weeks after gene transfer, the construct AAV5-hS100A1 with cmvenh/0.26 kb-mlc promoter showed a robust and mostly cardiospecific expression of the transgene accompanied by high pharmacological safety. Thus, it provides great therapeutical potential. The study contributed to identify novel signaling pathways that may be relevant for S100A1’s therapeutic actions. By changing the anesthetic gas, we could reduce the mortality during infarct induction. Therefore, in future MI studies, sevoflurane should be used preferably to maintain inhalation anesthesia.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung

Auf Adenoviren (Ads) basierende Vektoren wurden als ein gezielter Anti-Krebs-Wirkstoff entwickelt, der erfolgversprechende Resultate in prä-klinischen Studien erzielen konnte. Solche onkolytischen Ads sind zwar in klinischen Studien generell als sicher eingestuft worden, konnten jedoch die therapeutischen Erwartungen nicht erfüllen. In dieser Doktorarbeit konnte, unter Verwendung der Genexpressionsprofile von Ovarialkarzinom-Zellen, der epitheliale Phänotyp als Hindernis für allgemein verwendete onkolytische Ads, die auf den Coxsackie- und Adenovirusrezeptor (CAR) oder CD46 ausgerichtet sind, identifiziert werden. Der Zugang zu den Virus-Rezeptoren war zwingend an Zelldepolarisation und den Verlust der epithelialen Zonulae occludens und adherens gekoppelt, was Merkmale der Epithelial-zu-Mesenchymal-Transition (EMT) darstellt. Bedeutsam ist in diesem Zusammenhang, dass Tumore in situ als auch Xenograft-Tumore zum größten Teil aus Epithelzellen oder epithelial/mesenchymalen (E/M) Hybrid-Zellen bestehen. Diese E/M Hybrid-Zellen sind die einzigen Zellen, welche an Zellkulturbedingungen adaptieren, wo sie durch EMT während weiterem Passagieren in Mesenchymzellen differenzieren. Bemerkenswert ist hierbei die Tatsache, dass nur Mesenchymzellen und E/M Hybrid-Zellen, die sich im EMT-Prozess befanden, sensitiv zu viraler Onkolyse waren. In Versuchen, die festgestellte Resistenz zu überwinden, wurde herausgefunden, dass bisher nur wenig erforschte Adenovirus-Serotypen (Ad3, Ad7, Ad11 und Ad14), welche einen anderen Rezeptor als CAR oder CD46 auf Zellen benutzen, besser geeignet sind, um polarisierte Epithelzellgewebe zu infizieren. Diese Ads induzierten EMT-ähnliche Prozesse in Ovarialkarzinom-Kulturen mit epithelialem Phänotyp, was zu deren effizienter Onkolyse führte. Die vorliegende Arbeit trägt somit zur Aufklärung der Diskrepanz zwischen der Virustherapie-Effizienz in vivo und in vitro bei und bietet Anhaltspunkte für die Konstruktion von zukünftigen onkolytischen Ads. / Vectors based on adenoviruses have been designed as targeted anti-cancer therapeutics that showed promising results in pre-clinical applications. In clinical trials, these oncolytic adenoviruses have generally been proved safe in patients, but have fallen short of their expected therapeutic value. In this thesis the susceptibility of primary ovarian cancer cells to oncolytic adenoviruses was studied in order to identify cellular mechanisms that confer resistance to virotherapy. Using gene expression profiling of cancer cells either resistant or susceptible to viral oncolysis, it was discovered that the epithelial phenotype of ovarian cancer represents a barrier to infection by commonly used oncolytic adenoviruses targeted to coxsackie- and adenovirus receptor (CAR) or CD46. Accessibility to viral receptors was critically linked to depolarization and the loss of tight and adherens junctions, both hallmarks of epithelial-mesenchymal transition (EMT). Importantly, tumors in situ as well as xenograft tumors derived from primary ovarian cancer cells mostly contained epithelial cells and cells that are in an epithelial/mesenchymal (E/M) hybrid stage. These E/M cells are the only xenograft-derived cells that can be cultured and with passaging undergo EMT to differentiate into mesenchymal cells. Notably, only mesenchymal cells and E/M cells in the process of EMT were susceptible to viral oncolysis. In attempts to overcome the observed resistance, it was found that thus far little explored adenovirus serotypes (Ad3, Ad7, Ad11, and Ad14), which use cellular receptor(s) other than CAR and CD46, have superior oncolytic abilities on polarized epithelial tissue. This study therefore contributes to the clarification of observed discrepancies between virotherapy performances in vitro and in vivo and gives a rationale for the construction of future oncolytic adenoviruses.

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Gene therapy is a promising treatment option for cancer. Ideally, a therapeutic gene is delivered specifically into tumor cells sparing the neighboring normal cells. For this purpose gene delivery vectors are designed that can recognize structures, which are exclusively expressed on tumor cells (i.e. the tumor-associated antigens -TAA-). Retroviral vectors are commonly used for gene therapy by modifying the envelope protein responsible for the recognition of the target cell. The Vesicular Stomatitis Virus G protein (VSV-G) is a well-liked choice for pseudotyping the retroviral vectors since it confers on the viral particle stability to allow concentration to high titers necessary for the clinical applications. However, the main drawback of VSV-G, the ubiquitously expressed receptor and thus the broad target range, hinders the use of this protein for targeted gene therapy. In this thesis, we aimed to modify the VSV-G for targeted gene therapy against Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) -expressing tumors. Therefore we followed two approaches. The first approach comprised of the fusion of a single-chain antibody fragment against PSCA to the N-terminus of VSV-G. In the second approach the VSV-G was modified by insertion of a small epitope. We could demonstrate that two positions in the N-terminal region of VSV-G protein permit insertion of a ten amino acid long epitope. These mutant VSV-G proteins were successfully assembled into retroviral particles. We demonstrated that the mutant retroviral particles can be used for targeting to PSCA-positive cells using nanobeads. The nanobeads were chemically coupled to antibodies against the epitope in the VSV-G protein and PSCA on the tumor cell. These bispecific nanobeads allowed the recruitment of mutant retroviral particles to the PSCApositive cells. Our results point out the potential of these mutant retroviral particles in targeted gene delivery. Further studies will be necessary to assess the efficiency of in vivo targeted gene therapy using these mutant retroviral particles.

Habil.-Schr. Univ. Frankfurt (Main), 2007.

Gene therapy is a promising treatment option for cancer. Ideally, a therapeutic gene is delivered specifically into tumor cells sparing the neighboring normal cells. For this purpose gene delivery vectors are designed that can recognize structures, which are exclusively expressed on tumor cells (i.e. the tumor-associated antigens -TAA-). Retroviral vectors are commonly used for gene therapy by modifying the envelope protein responsible for the recognition of the target cell. The Vesicular Stomatitis Virus G protein (VSV-G) is a well-liked choice for pseudotyping the retroviral vectors since it confers on the viral particle stability to allow concentration to high titers necessary for the clinical applications. However, the main drawback of VSV-G, the ubiquitously expressed receptor and thus the broad target range, hinders the use of this protein for targeted gene therapy. In this thesis, we aimed to modify the VSV-G for targeted gene therapy against Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) -expressing tumors. Therefore we followed two approaches. The first approach comprised of the fusion of a single-chain antibody fragment against PSCA to the N-terminus of VSV-G. In the second approach the VSV-G was modified by insertion of a small epitope. We could demonstrate that two positions in the N-terminal region of VSV-G protein permit insertion of a ten amino acid long epitope. These mutant VSV-G proteins were successfully assembled into retroviral particles. We demonstrated that the mutant retroviral particles can be used for targeting to PSCA-positive cells using nanobeads. The nanobeads were chemically coupled to antibodies against the epitope in the VSV-G protein and PSCA on the tumor cell. These bispecific nanobeads allowed the recruitment of mutant retroviral particles to the PSCApositive cells. Our results point out the potential of these mutant retroviral particles in targeted gene delivery. Further studies will be necessary to assess the efficiency of in vivo targeted gene therapy using these mutant retroviral particles.

Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Bis heute gibt es keine ursächliche Therapie für die Herzinsuffizienz, die die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von unterschiedlichen kardialen Erkrankungen bildet. Auch die Gentherapie hat in der Kardiologie, anders als in anderen Bereichen, noch keinen großen Fortschritt erzielen können. Das Kalziumsensorprotein S100A1 stellt aber einen vielversprechenden Kandidaten für die kardiale Gentherapie dar, da es als zentraler Regulator der Herzfunktion und des Kalziumsignalwegs innerhalb der Kardiomyozyten identifiziert werden konnte. Ziele der Untersuchungen: Diese translationale Studie sollte dazu beitragen, dem Ziel einer kardialen Gentherapie der kardialen Dysfunktion einen Schritt näher zu kommen. Zum einen sollte hierzu ein auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) basierender Vektor (rAAV) des Serotyps 5 in Verbindung mit einem kardiospezifischen Promotor (CMVenh/0,26 kb-MLC) auf seine Anwendbarkeit und Sicherheit für die kardiale Gentherapie untersucht werden. Durch eine umfangreiche Testung auf präexistierende neutralisierende Serumfaktoren (NSF) sollte zudem untersucht werden, ob das Schwein generell ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte präklinische Studien darstellt. Zum anderen sollte in einem endpunktbasierten Studiendesign der Effekt der hS100A1-Gentherapie nach Myokardinfarkt (MI) im humanrelevanten Großtiermodell weiter charakterisiert werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 83 juvenile Schweine aus einem kommerziellen Herkunftsbetrieb verwendet. Vor Versuchsbeginn wurde das Serum von 40 Tieren mittels eines auf Durchflusszytometrie basierenden Zellreporter-Assays auf präexistierende NSF gegen AAV5 untersucht. Für die Hauptstudie wurde bei 8 Tieren eine 2 stündige perkutane Okklusion des Ramus circumflexus der linken Koronararterie (LCX) durchgeführt und so ein ischämischer Myokardinfarkt mit anschließender Reperfusion und resultierender kardialer Dysfunktion induziert. Nach 2 Wochen wurden Infarktgröße und Herzfunktion mittels Kardio-Magnetresonanztomographie (MRT) evaluiert. Die Tiere wurden in die Therapiegruppe (AAV5-hS100A1, 5 Tiere) oder Kontrollgruppe (AAV5-hRluc, 3 Tiere) aufgeteilt. Der Gentransfer (1x1013 virale Genomkopien (vgc)/Tier)) erfolgte per retrograder koronarvenöser Infusion. 12 Wochen nach Gentransfer wurde eine erneute Kardio-MRT Untersuchung durchgeführt. Zur Überprüfung der pharmakologischen Sicherheit wurden während des Versuchs serielle Blut und Elektrokardiogramm (EKG) Untersuchungen durchgeführt. Am Versuchsende wurden die Tiere schmerzfrei getötet und ihre Organe für weitere molekularbiologische Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Verteilung und Transkriptionseffizienz der vgc wurde aus den Gewebeproben DNA und RNA isoliert und anschließend eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine Next-Generation Sequenzierung der myokardialen RNA, die mit einer gewichteten Gen Co-Expressionsanalyse (WGCNA) und anschließender Anreicherungsanalyse untersucht wurde. Zur Reduktion der Tierzahl wurde die Studie Endpunkt orientiert durchgeführt: sobald die beiden Gruppen signifikant unterschiedliche Ergebnisse in den Endpunkten (EF und Infarktausweitung) erzielten, wurde die Studie beendet. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen eine niedrige anti-AAV5-Seroprävalenz in der Hausschweinpopulation. Die AAV5-hS100A1-Gentherapie führte nach 12 Wochen zu einer signifikanten Verringerung der Infarktausweitung und zu einer signifikant höheren EF im Vergleich zur Kontrollgruppe (ungepaarter zweiseitiger Student t-Test, p < 0,05). Die EKG- und Blutuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf Toxizität. Die Transkriptomanalyse der Myokardproben lieferte mit der EF und Infarktausweitung signifikant und stark negativ korrelierende pathophysiologisch relevante Signalwege. Dabei scheint u.a. eine antiinflammatorische Wirkung von AAV5-hS100A1 von großer Bedeutung zu sein. Erstmals konnte auch eine Interaktion zwischen S100A1 und der kardioprotektiven Retinsäure gezeigt werden. In einer aufgrund der hohen Mortalität während der MI-Induktion eingeschobene Versuchsreihe mit 72 Tieren konnte durch den Wechsel des Narkosegases von Isofluran auf Sevofluran die Mortalität signifikant gesenkt werden (einseitiger Fisher’s exact test, p < 0,05). Schlussfolgerungen: Das Schwein stellt ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte Versuchsvorhaben dar. Das zu testende Konstrukt AAV5-hS100A1 mit CMVenh/0,26 kb-MLC Promotor zeigte bei einer hohen pharmakologischen Sicherheit eine robuste und weitestgehend kardiospezifische Expression des Transgens 12 Wochen nach Gentransfer. Es verfügt somit über ein großes therapeutisches Potenzial. Die Studie konnte dazu beigetragen, neue Signalwege zu identifizieren, die für den Wirkmechanismus von S100A1 relevant sein könnten. Durch die Änderung des Narkosegases konnte die Mortalität bei der MI-Induktion gesenkt werden. In zukünftigen MI-Studien sollte daher die Aufrechterhaltung der Inhalationsanästhesie bevorzugt mittels Sevofluran erfolgen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung / Introduction: Cardiovascular diseases are the prevailing cause of death worldwide. To date, there is no causal therapy for heart failure, which represents the common endpoint of a large number of different cardiac diseases. Even the promising gene therapy approach has not yet been able to achieve relevant progress in this field. Identified as a central regulator of cardiac activity and calcium signaling in cardiomyocytes, the calcium-sensor protein S100A1 represents a highly suitable candidate for cardiac gene therapy. Objective: The overall goal of this translational study is to advance the field of gene therapy for cardiac dysfunction. On the one hand, the on adeno-associated viruses (AAVs) based vector (rAAV) of serotype 5 was tested in combination with a cardiac-specific promotor (cmvenh/0,26 kb-mlc) for its applicability and safety for cardiac gene therapy. Beforehand, extensive testing for preexisting neutralizing serum factors (nsf) was performed to decipher whether the pig is a suitable model for AAV5-based preclinical studies. On the other hand, the effect of the hS100A1 gene therapy after myocardial infarction (MI) was further characterized in a clinically relevant large animal model with an endpoint-based study design. Animals, materials and methods: A total of 83 juvenile farm pigs were used. Before starting the experiment, we analyzed serum from 40 animals for preexisting nsf against AAV5 using a flow cytometry-based cell reporter assay. For the main study, we used 8 animals in which we induced an ischemic myocardial infarction with subsequent reperfusion by occluding percutaneously the ramus circumflexus of the left coronary artery (LCX) for 2 hours to generate cardiac dysfunction. After 2 weeks, we evaluated infarct size and cardiac function with cardiac magnetic resonance imaging (MRI). Animals were divided into the treatment group (AAV5-hS100A1, 5 animals) and the control group (AAV5-hRluc, 3 animals). We applied gene transfer (1x1013 viral genome copies (vgc)/animal) using retrograde coronary venous infusion. We repeated the cardiac MRI 12 weeks after gene transfer. Serial blood and electrocardiogram (ECG) tests were performed during the experiment to verify pharmacological safety. At the end of the study, the animals were euthanized and their organs were collected for further molecular analyses. To investigate the distribution and transcriptional efficiency of the vectors, we isolated DNA and RNA from the tissue samples and performed real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In addition, a next-generation sequencing of myocardial RNA was conducted and analyzed with weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and subsequent enrichment analysis. To reduce the number of animals, the study was end point oriented: When reaching significant differences in the primary end points (ejection fraction (EF) and infarct extension), the study was terminated. Results: The results demonstrate a low anti-AAV5 seroprevalence in the farm pig population. After 12 weeks, the AAV5-hS100A1 gene therapy resulted in a significant reduction of infarct extension and a significantly higher EF compared to the control group (unpaired two-sided Student t-Test, p < 0.05). ECG and blood tests did not show any indications of toxicity. The transcriptome analysis of the myocardial samples provided a significant negative correlation between relevant pathological signaling pathways and EF/infarct extension, thus giving clues to underlying mechanisms. Among these, an anti-inflammatory effect of AAV5-hS100A1 appears to be of major importance. For the first time, we could also demonstrate an interaction between S100A1 and the cardioprotective retinoic acid. Due to the high mortality during MI-induction, we incorporated a test series with 72 animals. By changing the anesthetic gas from isoflurane to sevoflurane, we could significantly reduce the mortality (one-sided Fisher's exact test, p < 0.05). Conclusions: The pig represents a suitable model for AAV5-based studies. 12 weeks after gene transfer, the construct AAV5-hS100A1 with cmvenh/0.26 kb-mlc promoter showed a robust and mostly cardiospecific expression of the transgene accompanied by high pharmacological safety. Thus, it provides great therapeutical potential. The study contributed to identify novel signaling pathways that may be relevant for S100A1’s therapeutic actions. By changing the anesthetic gas, we could reduce the mortality during infarct induction. Therefore, in future MI studies, sevoflurane should be used preferably to maintain inhalation anesthesia.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung

High transduction rates of viral vectors in gene therapies (GT) and experimental hematopoiesis ensure a high frequency of gene delivery, although multiple integration events can occur in the same cell. Therefore, tracing of integration sites (IS) leads to mis-quantification of the true clonal spectrum and limits safety considerations in GT. Hence, we use correlations between repeated measurements of IS abundances to estimate their mutual similarity and identify clusters of co-occurring IS, for which we assume a clonal origin. We evaluate the performance, robustness and specificity of our methodology using clonal simulations. The reconstruction methods, implemented and provided as an R-package, are further applied to experimental clonal mixes and preclinical models of hematopoietic GT. Our results demonstrate that clonal reconstruction from IS data allows to overcome systematic biases in the clonal quantification as an essential prerequisite for the assessment of safety and long-term efficacy of GT involving integrative vectors.

Als häufige genetisch bedingte neurodegenerative Erkrankung ist die Huntington-Krankheit eine Modellerkrankung – auch für die Gentherapie. Unter den unterschiedlichen Möglichkeiten ist die Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden am weitesten fortgeschritten. Als weitere Optionen auf Ebene der RNA stehen Mikro-RNAs und Modulatoren der RNA-Prozessierung (Spleißen) zur Verfügung, auf DNA-Ebene Zink-Finger-Proteine. Mehrere Produkte befinden sich in der klinischen Prüfung. Diese unterscheiden sich in Applikationsform und systemischer Verfügbarkeit, aber auch in der genauen Wirkung. Ein wichtiger Unterschied könnte darin liegen, ob alle Formen des Huntingtin-Proteins gleichermaßen von der Therapie angesprochen werden, oder ob sich die Therapie präferentiell gegen besonders toxische Formen wie das Exon1-Protein richtet. Die Ergebnisse der kürzlich abgebrochenen GENERATION HD1 Studie waren etwas ernüchternd, am ehesten aufgrund der nebenwirkungsbedingten Liquorzirkulationsstörung. Sie sind daher nur ein Schritt in der Entwicklung zu einer wirksamen Gentherapie gegen die Huntington-Krankheit. / Being one of the most common genetic neurodegenerative disease, Huntington’s disease has been a model disease – also for gene therapy. Among the various options, the development of antisense oligonucleotides is the most advanced. Further options at the RNA level include micro-RNAs and modulators of RNA processing (splicing), at the DNA level zinc finger proteins. Several products are in clinical trials. These differ in their mode of application and in the extent of systemic availability. Another important difference between therapeutic strategies could be whether all forms of the huntingtin protein are targeted in the same extent, or whether a therapy preferentially targets particular toxic forms such as the exon1 protein. The results of the recently terminated GENERATION HD1 trial were somewhat sobering, most likely due to the side effect-related hydrocephalus. Therefore they represent just one step towards the development of an effective gene therapy against Huntington’s disease.