Alterações genéticas nos genes RET, RAS e BRAF resultam na ativação constitutiva da sinalização MAPK e estão presentes em aproximadamente 70% dos carcinomas papilífero de tiroide, a forma mais prevalente de câncer de tiroide. Múltiplas vias de sinalização podem atuar em conjunto com a via MAPK na oncogênese tiroidiana. Nesse estudo, testamos a hipótese que a via MAPK regula a sinalização Notch e que o crosstalk entre as vias de sinalizações são importantes na regulação da diferenciação e proliferação celular no câncer de tiroide. A ativação condicional dos oncogenes RET/PTC3 e BRAFT1799A em linhagem de célula folicular normal de tiroide aumentou a atividade da via de sinalização Notch. Por outro lado, o bloqueio farmacológico da sinalização MAPK reduziu a sinalização Notch na linhagem celular TPC-1 derivada de carcinoma papilífero de tiroide. Glândulas tiroide de animais transgênicos expressando BRAFT1799A e amostras de carcinoma papilífero de tiroide apresentaram elevados níveis de NOTCH1. A superexpressão de NOTCH1 em célula folicular normal de tiroide aumentou a expressão proteica de NIS. A inibição farmacológica e por RNA de interferência da sinalização Notch apresentou um efeito anti-proliferativo em linhagem de CPT. Além disso, a combinação do inibidor farmacológico de Notch e MAPK diminuiu a proliferação de células de carcinoma papilífero de tiroide. Esses dados sugerem um importante papel da sinalização Notch na oncogênese do carcinoma papilífero de tiroide induzida pela sinalização MAPK e que a via Notch pode ser uma potencial terapia adjuvante no câncer de tiroide. / Genetic alterations in RET, RAS and BRAF result in constitutive activation of the MAPK signaling and are present in approximately 70% of papillary thyroid carcinomas, the most prevalent form of thyroid cancer. Multiple signaling pathways can act with MAPK pathway in thyroid oncogenesis. In this study, we tested the hypothesis that MAPK pathway control Notch signaling and that the crosstalk between these pathways plays an important role in thyroid cancer cell differentiation and proliferation. The conditional activation of RET/PTC3 and BRAFT1799A enhanced Notch signaling pathway in normal follicular thyroid cell. By contrast, pharmacological inhibition of MAPK reduced Notch signaling in TPC-1 cell line derived from papillary thyroid carcinoma. Transgenic mice expressing BRAFT1799A restrict in thyroid gland and human papillary thyroid carcinoma samples showed higher Notch1 expression. NOTCH1 overexpression in normal thyroid follicular cell increased NIS protein expression. Pharmacological inhibition and RNA interference of Notch signaling showed an anti-proliferative effect in papillary thyroid carcinoma cells. Furthermore, the combination of MAPK and Notch signaling inhibitors reduced papillary thyroid carcinoma proliferation. These data suggest an important role of Notch signaling in papillary thyroid carcinoma induced by MAPK-related oncogenes and that Notch signaling pathway could be a potential adjuvant therapy in thyroid cancer.

Introdução. O hormônio tireoidiano na sua forma ativa (T3) possui um importante papel no crescimento, desenvolvimento e no metabolismo dos organismos complexos. A iodotironina desiodase tipo 2 (D2) é uma selenoenzima responsável pela ativação do T3. O polimorfismo de troca única (SNP) Tre92Ala (rs225014) no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações; porém, estudos funcionais ex vivo indicaram que esse polimorfismo não seria o fator causal para o desenvolvimento de resistência à insulina. Objetivos. Identificar outras alterações no gene da D2 que pudessem contribuir para o desenvolvimento de resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2) na presença ou não do polimorfismo rs225014 (Tre92Ala). Material e Métodos. A busca por SNPs que pudessem estar associadas com resistência à insulina foi realizada através do sequenciamento automático do gene DIO2 em 12 pacientes com DM2 apresentando diferentes graus de resistência à insulina e 2 indivíduos não-diabéticos. Variantes potencialmente informativas foram estudadas em 1077 pacientes com DM2 e 516 indivíduos nãodiabéticos. Além disso, foi verificado se os SNPs informativos encontravam-se em desequilíbrio de ligação e se a estrutura predita do mRNA estaria alterada nas variantes selvagens e polimórficas da D2. Resultados. Durante a varredura no gene DIO2 foram identificados 5 polimorfismos candidatos: rs199598135, rs12885300, rs225014, rs225015 e rs225017. Entre estes, verificou-se que a frequência do genótipo TT do rs225017 era mais elevada naqueles pacientes com índices de HOMA-IR mais altos do que naqueles com índices de HOMA-IR baixo. A partir desses dados, foi realizado um estudo de associação entre a presença desse polimorfismo e o desenvolvimento de resistência à insulina e desenvolvimento de DM2. Pacientes com DM2 que eram 10 homozigotos para o alelo polimórfico (T/T) apresentaram um nível mais elevado de insulina plasmática em jejum (15,7 vs. 10,6; P=0.005) e índices de HOMA-IR (5,20 vs. 3,50; P=0,005) quando comparados com pacientes portadores do alelo A. O genótipo TT foi associado com aumento dos níveis de insulina e índice de HOMA-IR de forma independente e em combinação com o genótipo Ala92Ala (rs225014) (P=0,001 e P=0,010; respectivamente). No estudo de caso-controle, não foi verificada uma associação entre a presença do genótipo TT (rs225017) e o desenvolvimento de DM2 (OR ajustada = 1,15, IC 95% 0,86 – 1,55, P=0,354). No entanto, a presença combinada deste genótipo com o genótipo Ala92Ala (rs225014) foi associada a um maior risco de desenvolvimento de DM2 (OR ajustada = 1,70, IC 95% 1,11-2,61; P=0,015) do que somente na presença do genótipo Ala92Ala (OR ajustada = 1,59, IC 95% 1,10 – 2,31; P=0,010). Estudos adicionais demonstraram que os polimorfismos rs225017 e rs225014 estão em um forte desequilíbrio de ligação. A análise da estrutura secundária predita do mRNA da DIO2 sugere uma interação entre os polimorfismos rs225017 e rs225014. Conclusões. Pacientes com DM2 homozigotos para o genótipo T/T do polimorfismo rs225017 apresentaram níveis mais severos de resistência à insulina. Essa associação foi mais acentuada na presença do polimorfismo rs225014, sugerindo uma interação entre estes polimorfismos na modulação da resistência à insulina.

Classicamente o testículo tem sido descrito com um órgão não-responsivo aos hormônios tireoidianos. Entretanto, nos últimos anos, diversos estudos têm demonstrado que os hormônios tireoidianos desempenham um papel crítico para o desenvolvimento e função testicular. Trabalhos realizados pelo nosso grupo identificaram a presença da desiodase tipo 2 (D2), enzima envolvida na conversão do T4 no hormônio ativo T3, no testículo de camundongos adultos e sua regulação pelo status tireoidiano. No entanto, a localização da D2 nos diferentes tipos celulares nesse órgão não foi estabelecida. O presente trabalho avaliou a expressão e atividade da D2 nas frações germinativa e somática do testículo, bem como sua atividade nos demais órgãos do aparelho reprodutor de ratos adultos. Para os ensaios de Real Time-PCR e determinação de atividade enzimática, os testículos de ratos controles e hipotireoideos (tratados com metimazol 0,03% por 4 semanas) foram removidos e imediatamente tratados enzimaticamente para isolamento de frações somática e germinativa. Os demais tecidos foram removidos e congelados para posterior utilização. Para os ensaios de hibridização in situ, os animais foram preparados, e os testículos, removidos e analisados. Os sinais de hibridização in situ, confirmados pela determinação dos níveis de mRNA da D2 através da técnica de Real Time-PCR, demonstraram a presença de transcritos da D2 em níveis significativamente maiores nas células germinativas quando comparado às células somáticas (P=0,001). A atividade enzimática da D2 nessas células foi de 0,23 ± 0,003 fmol/min.mg prot. As células tubulares somáticas, bem como as células intersticiais, foram virtualmente negativas para a presença da D2. Nos demais tecidos avaliados, a atividade da D2 foi detectada apenas na próstata (0,03 fmol/min.mg prot). A indução do hipotireoidismo aumentou significativamente a atividade da D2 na fração germinativa (p=0,03), e também na próstata (p=0,007). Este trabalho demonstra, pela primeira vez, a expressão da D2 nas células germinativas do testículo adulto, sugerindo um efeito do hormônio tireoidiano sobre o processo de espermatogênese.

Resumo não disponível

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Classicamente o testículo tem sido descrito com um órgão não-responsivo aos hormônios tireoidianos. Entretanto, nos últimos anos, diversos estudos têm demonstrado que os hormônios tireoidianos desempenham um papel crítico para o desenvolvimento e função testicular. Trabalhos realizados pelo nosso grupo identificaram a presença da desiodase tipo 2 (D2), enzima envolvida na conversão do T4 no hormônio ativo T3, no testículo de camundongos adultos e sua regulação pelo status tireoidiano. No entanto, a localização da D2 nos diferentes tipos celulares nesse órgão não foi estabelecida. O presente trabalho avaliou a expressão e atividade da D2 nas frações germinativa e somática do testículo, bem como sua atividade nos demais órgãos do aparelho reprodutor de ratos adultos. Para os ensaios de Real Time-PCR e determinação de atividade enzimática, os testículos de ratos controles e hipotireoideos (tratados com metimazol 0,03% por 4 semanas) foram removidos e imediatamente tratados enzimaticamente para isolamento de frações somática e germinativa. Os demais tecidos foram removidos e congelados para posterior utilização. Para os ensaios de hibridização in situ, os animais foram preparados, e os testículos, removidos e analisados. Os sinais de hibridização in situ, confirmados pela determinação dos níveis de mRNA da D2 através da técnica de Real Time-PCR, demonstraram a presença de transcritos da D2 em níveis significativamente maiores nas células germinativas quando comparado às células somáticas (P=0,001). A atividade enzimática da D2 nessas células foi de 0,23 ± 0,003 fmol/min.mg prot. As células tubulares somáticas, bem como as células intersticiais, foram virtualmente negativas para a presença da D2. Nos demais tecidos avaliados, a atividade da D2 foi detectada apenas na próstata (0,03 fmol/min.mg prot). A indução do hipotireoidismo aumentou significativamente a atividade da D2 na fração germinativa (p=0,03), e também na próstata (p=0,007). Este trabalho demonstra, pela primeira vez, a expressão da D2 nas células germinativas do testículo adulto, sugerindo um efeito do hormônio tireoidiano sobre o processo de espermatogênese.

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Introdução. O hormônio tireoidiano na sua forma ativa (T3) possui um importante papel no crescimento, desenvolvimento e no metabolismo dos organismos complexos. A iodotironina desiodase tipo 2 (D2) é uma selenoenzima responsável pela ativação do T3. O polimorfismo de troca única (SNP) Tre92Ala (rs225014) no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações; porém, estudos funcionais ex vivo indicaram que esse polimorfismo não seria o fator causal para o desenvolvimento de resistência à insulina. Objetivos. Identificar outras alterações no gene da D2 que pudessem contribuir para o desenvolvimento de resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2) na presença ou não do polimorfismo rs225014 (Tre92Ala). Material e Métodos. A busca por SNPs que pudessem estar associadas com resistência à insulina foi realizada através do sequenciamento automático do gene DIO2 em 12 pacientes com DM2 apresentando diferentes graus de resistência à insulina e 2 indivíduos não-diabéticos. Variantes potencialmente informativas foram estudadas em 1077 pacientes com DM2 e 516 indivíduos nãodiabéticos. Além disso, foi verificado se os SNPs informativos encontravam-se em desequilíbrio de ligação e se a estrutura predita do mRNA estaria alterada nas variantes selvagens e polimórficas da D2. Resultados. Durante a varredura no gene DIO2 foram identificados 5 polimorfismos candidatos: rs199598135, rs12885300, rs225014, rs225015 e rs225017. Entre estes, verificou-se que a frequência do genótipo TT do rs225017 era mais elevada naqueles pacientes com índices de HOMA-IR mais altos do que naqueles com índices de HOMA-IR baixo. A partir desses dados, foi realizado um estudo de associação entre a presença desse polimorfismo e o desenvolvimento de resistência à insulina e desenvolvimento de DM2. Pacientes com DM2 que eram 10 homozigotos para o alelo polimórfico (T/T) apresentaram um nível mais elevado de insulina plasmática em jejum (15,7 vs. 10,6; P=0.005) e índices de HOMA-IR (5,20 vs. 3,50; P=0,005) quando comparados com pacientes portadores do alelo A. O genótipo TT foi associado com aumento dos níveis de insulina e índice de HOMA-IR de forma independente e em combinação com o genótipo Ala92Ala (rs225014) (P=0,001 e P=0,010; respectivamente). No estudo de caso-controle, não foi verificada uma associação entre a presença do genótipo TT (rs225017) e o desenvolvimento de DM2 (OR ajustada = 1,15, IC 95% 0,86 – 1,55, P=0,354). No entanto, a presença combinada deste genótipo com o genótipo Ala92Ala (rs225014) foi associada a um maior risco de desenvolvimento de DM2 (OR ajustada = 1,70, IC 95% 1,11-2,61; P=0,015) do que somente na presença do genótipo Ala92Ala (OR ajustada = 1,59, IC 95% 1,10 – 2,31; P=0,010). Estudos adicionais demonstraram que os polimorfismos rs225017 e rs225014 estão em um forte desequilíbrio de ligação. A análise da estrutura secundária predita do mRNA da DIO2 sugere uma interação entre os polimorfismos rs225017 e rs225014. Conclusões. Pacientes com DM2 homozigotos para o genótipo T/T do polimorfismo rs225017 apresentaram níveis mais severos de resistência à insulina. Essa associação foi mais acentuada na presença do polimorfismo rs225014, sugerindo uma interação entre estes polimorfismos na modulação da resistência à insulina.

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Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nesta tese de mestrado, apresentamos, de acordo com as recomendações da comissão especial do programa de Pós-Graduação em Endocrinologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), um trabalho em forma de manuscrito que será submetido à revista Clinical Endocrinology. Identificamos genes cuja expressão estava diminuída nas bibliotecas de carcinoma folicular de tiróide (FTC): TPO, TFF3, NR4A1 e IYD. O NR4A1 foi selecionado para uma análise mais profunda, por apresentar expressão potencialmente tecido-específica. Passamos então à validação do padrão diferencial de expressão em tecidos neoplásicos e não-neoplásicos, pela técnica de PCR em tempo real, assim como a realização de experimentos em linhagens celulares, com o uso de lítio. Estes são os focos desta tese e estão descritos no manuscrito “Downregulation of NR4A1 in follicular thyroid carcinoma cell line is restored after lithium treatment”, tendo como objetivos: 1) Validar a expressão de NR4A1 nos tecidos benignos e malignos da tiróide. 2) Avaliar a correlação dos genes CCND1 e FOSB com a expressão de NR4A1. 3) Verificar a expressão dos genes NR4A1, CCDN1 e FOSB nas linhagens de carcinoma tiroidiano disponíveis no laboratório, com objetivo de indetificar um modelo semelhante a expressão observada nos tecidos. 4) Verificar se a expressão dos genes NR4A1, FOSB e CCDN1 poderia ser restabelecida quando tratadas com lítio.. / Introduction: The identification of follicular thyroid adenoma-associated transcripts will lead to a better understanding of the events involved in pathogenesis and progression of follicular tumors. Using Serial Analysis of Gene Expression, we identified five genes that are absent in a malignant follicular thyroid carcinoma (FTC) library, but expressed in follicular adenoma (FTA) and normal thyroid libraries. Methods: NR4A1, one of the five genes, was validated in a set of 27 normal thyroid tissues, 10 FTAs and 14 FTCs and three thyroid carcinoma cell lines by real time PCR. NR4A1 can be transiently increased by a variety of stimuli, including lithium, which is used as adjuvant therapy of thyroid carcinoma with 131I. We tested if lithium could restore NR4A1 expression. The expression of other genes potentially involved in the same signaling pathway was tested. To this end, lithium was used at different concentration (10mM or 20mM) and time (2h and 24 h) and the level of expression was tested by quantitative PCR. We next tested if Lithium could affect cell growth and apoptosis. Results: We observed that NR4A1 expression was under-expressed in most of the FTCs investigated, compared to expression in normal thyroid tissues and FTAs. We also found a positive correlation between NR4A1 and FOSB gene expression. Lithium induced NR4A1 and FOSB expression, reduced CCDN1 expression, inhibited cell growth and triggered apoptosis in a FTC cell line. Conclusions: NR4A1 is under-expressed in most of FTCs. The loss of expression of both NR4A1 and the Wnt pathway gene FOSB was correlated with malignancy. This is consistent with the hypothesis that its loss of expression is part of the transformation process of FTCs, either as a direct or indirect consequence of Wnt pathway alterations. Lithium restores NR4A1 expression, induces apoptosis and reduces cell growth. These findings may explain a possible molecular mechanism of lithium’s therapeutic action. / FAPESP: 05/60330-8 / BV UNIFESP: Teses e dissertações