Submitted by Matheus Alves Bulhoes (matheus.bulhoes@ufpe.br) on 2015-05-12T16:17:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Eraldo Fonseca _Dissertação.pdf: 4420289 bytes, checksum: efc8668ce0cb4bec61ffe7ceb51ac2c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T16:17:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Eraldo Fonseca _Dissertação.pdf: 4420289 bytes, checksum: efc8668ce0cb4bec61ffe7ceb51ac2c9 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / FACEPE / O sistema nervoso entérico (SNE) é a inervação intrínseca do trato gastrointestinal, envolvida no controle autonômico das suas atividades motoras e secretórias. Evidências recentes indicam que a glia do SNE participa ativamente na manutenção da homeostase intestinal, mas pouco se sabe sobre a sua função em quadros de desnutrição. Neste trabalho, avaliamos se a desnutrição provocada por reduzida ingestão de leite materno é capaz de comprometer a organização estrutural do SNE, balanço redox, reserva antioxidante e a condição antiinflamatória do cólon, principalmente associadas à função da glia. Ratos wistar foram criados em diferentes tamanhos de ninhada, com 6 (N6, ninhada normal) ou 15 filhotes (N15, grande ninhada), constituindo o grupo nutrido e o desnutrido, respectivamente, que foram analisados no dia do desmame (25º dia pós-natal). Os animais machos foram pesados semanalmente até o dia do experimento. Sob anestesia profunda, foi obtido o comprimento nasoanal e retirado o cólon distal para análise. Uma parte do material foi utilizada para obtenção de homogenados, os quais foram processados para análise dos níveis de lipoperoxidação, TNFα, IL-1β, IL-10, produção de óxido nítrico (NO), GSH e GSSG e atividade das enzimas superóxido dismutase total (tSOD) e catalase (CAT). Outra parte do material foi utilizada para análises morfométricas do cólon e para obtenção de preparações longitudinais do plexo mioentérico, onde a distribuição de neurônios e glia foram avaliadas por imunohistoquímica. Os resultados, expressos em média ± desvio padrão, mostraram diminuição de peso nos animais desnutridos (N6; 50,70 ± 9,77 e N15; 30,13 ± 2,87g), bem como no comprimento nasoanal (N6; 13,41 ± 0,44 e NN15; 11,00 ± 0,42 cm). A espessura do cólon (N6; 1,27 ± 0,09 e N15; 1,09 ± 0,08 cm), da parede total (N6; 1010,05 ± 114,70 e NN15; 905,75 ± 169,77 μm) e da tunica muscularis (N6; 84,00 ± 22,30 e N15; 74,02 ± 22,38 μm) também foram afetadas. Do ponto de vista qualitativo, o plexo mioentérico do grupo desnutrido não apresentou alterações na sua estrutura, no entanto, um menor tamanho no corpo celular dos neurônios, foi detectado (N6; mediana 310,85; min 77,96; max 987,37 e NN15 mediana 291,74; min 114,68; max 993,41 μm2). Maiores níveis de lipoperoxidação (N6; 1,079 ± 0,10 e NN15; 2,51 ± 0,22 nmol MDA/mg proteína) óxido nítrico (N6; 3,04 ± 0,63 e N15; 4,85 ± 1,8 μM/mg proteína) e da atividade da CAT (N6; 0,027 ± 0,010 e N15; 0,049 ± 0,024 U/mg de proteína) foram detectadas no grupo desnutrido, assim como os níveis de TNFα (N6 1,26 ± 0,26 e N15; 1,57 ± 0,24 pg/mg de proteína) e IL-1β (N6 0,88 ± 0,15 e N15; 1,17 ± 0,13 pg/mg de proteína). Em relação aos níveis de IL-10 (N6 44,54 ± 13,09 e N15; 51,22 ± 8,15 pg/mg de proteína) e GSH (N6 60,89 ± 21,26 e N15; 53,34 ± 26,19 μM/mg de proteína) não observamos diferença entre os grupos, embora os níveis de tSOD (N6 0,088 ± 0,023 e N15; 0,056 ± 0,018 U/mg de proteína) e GSSG se apresentaram diminuídos no grupo experimental (N6 27,48 ± 4,59 e N15; 14,41 ± 4,12 μM/mg de proteína). Os resultados sugerem que reduzido aporte de nutrientes durante a lactação reduz alguns dos mecanismos de proteção relacionados com a reserva anti-oxidante e anti-inflamatória, o que poderá aumentar a vulnerabilidade do cólon a insultos externos.

There is increasing evidence that inflammatory processes play a pivotal role in the pathophysiology of ischaemic brain injury. Cerebrovascular endothelial cells that form the blood-brain barrier are critical for maintaining brain homeostasis, however, during cerebral ischaemia they contribute to the post-ischaemic inflammatory responses. It is not yet fully understood how different cerebral cells interact during this inflammatory response. This study aimed to test the hypothesis that oxygen-glucose deprivation (OGD) induces the inflammatory activation of the cerebrovascular endothelium and glial cells in vitro and that intercommunication between these cells regulate their responses to OGD. Primary murine brain endothelial cells (MBECs) monocultures, murine mixed-glial monocultures and MBEC-glial co-cultures were exposed to OGD for up to 24 hours (h), then reperfused cultures were returned to normoxia for a further 24 hours. MBECs and glia remained viable over a 24 h OGD exposure and during reperfusion. OGD induced a time-dependent increase in MBEC glucose transporter 1 (GLUT-1) expression but a time-dependent decline in expression and secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). A significant increase in keratinocyte-derived chemokine (KC) secretion by MBEC monocultures was observed during reperfusion after prolonged exposure (18-24 h) to OGD whereas, KC secretion by co-cultured MBECs was increased during reperfusion after short exposure (4 h) to OGD. Co-cultured MBECs displayed a significant increase in intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in response to a short or prolonged exposure to OGD with 24 h of reperfusion. Neither OGD nor reperfusion had any effect on permeability of the MBEC monolayer. OGD induced a time-dependent increase in nuclear stabilisation of hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-1α) in glial cells which correlated to vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion during OGD and subsequent reperfusion. Nuclear stabilisation of the nuclear factor kappa B (NFκB)p65 subunit by glial cells was dependent upon the duration of OGD. Reperfusion induced a significant increase in KC secretion by co-cultured glial cells after short exposure to OGD. Inflammatory activation of co-cultured MBECs and glia after 4 or 24 h OGD caused a significant increase in neutrophil transendothelial migration which correlated with MBEC expression of ICAM-1 and VCAM-1. A combination of these cell adhesion molecules with neutrophil integrins and soluble glial-derived mediators contributed to neutrophil transendothelial migration. These studies provide evidence that combined hypoxia and glucose withdrawal induces the activation of MBECs and glial cells in vitro. Cross-talk between these two cell types may further regulate their activation. As a result of this inflammatory activation, soluble MBEC and glial-derived mediators may contribute to neutrophil transendothelial migration through the regulation of MBEC cell adhesion molecule expression.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22040号 / 医博第4525号 / 新制||医||1038(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 高橋 淳, 教授 伊佐 正, 教授 渡邉 大 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Recent postmortem studies have demonstrated deficits in glia in major depressive disorder, including reductions in the astrocyte specific interfilament glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the prefrontal cortex and cerebellum of depressed patients. Astrocytes serve important roles in influencing neuronal activity in the CNS, one of which is to remove neurotransmitters from the extracellular space. The present study investigated the levels of GFAP in the locus coeruleus (LC) of human subjects. The LC is the principal source of norepinephrine in the brain and neurochemical pathology of the LC has been demonstrated in major depressive disorder (MDD) and suicide. Tissue punches of the LC were obtained from postmortem brains collected from subjects with MDD who died by suicide and psychiatrically normal control subjects (n=9 per group). The age of the subjects ranged from 17 to 65 years (control 37±4 y; MDD 39±5 y) and postmortem intervals ranged from 17 to 44 h (control 20±1 h; MDD 25±3 h). GFAP-immunoreactivity (ir) was measured by quantitative Western blotting. Alpha-tubulin-ir was used to control for protein loading and transfer. Amounts of GFAP-ir were highly variable within both control and MDD subjects, ranging 15-fold across control subjects and 24-fold across MDD subjects. There was a modest trend for lower GFAP-ir in the LC from MDD subjects relative to control subjects, but this difference was not significantly different. In control subjects, there was no significant correlation of GFAP-ir levels with age. In contrast, GFAP-ir levels were positively correlated with age in MDD subjects. In younger MDD subjects (<40 y), GFAP-ir was consistently lower as compared to matched control subjects. Amounts of GFAP-ir did not correlate with postmortem intervals. These findings are consistent with a previous report demonstrating age effects on GFAP in frontal cortex in depressed but not control subjects. Glia deficits reported in frontal cortex and cerebellum from depressed subjects may also occur in the brainstem, and these deficits may contribute to disruption of monoamine chemistry in depression. Given the variability of GFAP levels in the LC between subjects, other markers of glia should be pursued to evaluate the potential role of glia in brainstem pathology associated with MDD.

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Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird. / Multiple sclerosis (MS) is one of the most common neurological diseases, leading to motor, sensory and vegetative impairment. Frequently, the disease begins as a relapsing remitting form, which is followed by a progressive stage. Nevertheless about 15% of the patients suffer under a primary progressive multiple sclerosis, which starts with the progressive stage. Until now the pathophysiology is not completely understood. For a long time, multiple sclerosis was thought to be an autoimmune disease, but in the last years the question arose if the underlying cause, especially in the progressive forms (PMS), could be a cytodegenerative component, followed by secondary inflammation. A possible candidate here could be point mutations in the PLP 1 gene, which are usually associated with leukodystrophic disorders. There were two case reports about patients carrying distinct point mutations in this gene, leading to the clinical phenotype of multiple sclerosis. This thesis examines 18- and in part 12-month-old mice, carrying these point mutations or having a Plp 1 null mutation. Here myelin alterations and axonal damage in immunohistochemical stainings could be shown, as well as in the optical coherence tomography and electron microscopy. Furthermore, the occurrence of neuroinflammation comprising recruitment of microglia/macrophages and CD8 positive T-cells could be demonstrated. Also, typical clinical symptoms in the Rotarod test were found. Interestingly, there was less neural damage found in heterozygous females than in homozygous mutant mice, while the extent of inflammation was the same. This could indicate a targeted immune-mediated injury of oligodendrocytes leading to neuronal damage. In summary, this thesis shows that a point mutation of a gene coding for a myelin protein of oligodendrocytes can lead to secondary neuroinflammation and a neurological phenotype comparable to PMS. In addition, the generated mouse models are an example for genetic diseases of the CNS, in which the clinical outcome could be driven by inflammation and not only by the primary gene mutation.

Das Gehirn ist das zentrale Organ der Informationsaufnahme, -verarbeitung und -speicherung des menschlichen Körpers. Im Gehirn arbeiten verschiedene Typen von Zellen synergistisch zusammen. Neurone leiten elektrische Impulse in Form von Aktionspotentialen, welche die Grundlage für fast alle Signalverarbeitungsprozesse des Gehirns sind. Ihre Funktion wird durch verschiedene Typen von Gliazellen komplementiert (Kandel et al. 2000). Astrozyten sind aufgrund ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften und ihrer Interaktion mit Neuronen von entscheidender Bedeutung für die Homöostase sowie die physiologische Funktion des Gehirns. Mikrogliazellen sind die Immunzellen des Gehirns. Beiden Typen von Gliazellen ist gemein, dass sie sehr sensitiv auf pathologische Zustände im Gehirn reagieren. Die dadurch ausgelöste Reaktion wird als Gliose bezeichnet und ist durch morphologische und funktionelle Veränderungen der Zellen gekennzeichnet. Diese Gliose kann sowohl eine neuroprotektive, also auch eine schädigende Wirkung für das Gehirn entfalten (Burda und Sofroniew 2014). Als Mikrocephalie wird ein signifikant reduzierter Kopfumfang und damit eine Reduktion des Gehirnvolumens bezeichnet, die oft durch eine Störung der Hirnentwicklung ausgelöst wird. Dieser pathologische Zustand geht oft mit neurologischen und seltenen Erkrankungen einher, deren Ursachen vielfältig sind (Jamuar und Walsh 2015). Sowohl genetische Defekte als auch erworbene Formen (z.B. Mikrocephalie ausgelöst durch eine Infektion der Schwangeren mit dem Zika-Virus oder dem Rötelnvirus) sind beschrieben (Li et al. 2016; Ostrander und Bale 2019). Als eine genetische Ursache der Microzephalie wurden Mutationen im Gen der Asparaginsynthetase (ASNS) identifiziert (Ruzzo et al. 2013). - Jedoch ist der zur Ausbildung einer Mikrocephalie und dem primär neurologischen Krankheitsbild führende Pathomechanismus ungeklärt. Die ASNS ist ein im Gehirn in Neuronen exprimiertes Enzym des Aminosäurestoffwechsels und katalysiert die Synthese von Asparagin aus Aspartat, wobei Glutamin oder NH3 als Donor des Ammoniaks fungiert (Zhang et al. 2014; Zhang et al. 2016). Aufgrund der an der ASNS-Reaktion beteiligten Moleküle liegt eine Assoziation zum Glutamat-Glutamin-Zyklus nahe, welcher zur Regulation und Bereitstellung des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat beiträgt. Während der Glutamat-Glutamin-Zyklus bereits lange etabliert ist (Bak et al. 2006), ist unklar, wie das in den Neuronen entstehende NH3 gebunden und in Astrozyten zurücktransportiert wird. Die vorliegende Arbeit adressiert daher die Hypothese einer gehirnspezifischen Funktion der ASNS im Hinblick auf die Beteiligung am Glutamat-Glutamin-Zyklus zur Detoxifikation des in Neuronen gebildeten, neurotoxischen Ammoniaks. Für die Untersuchung dieser Pathomechanismen erfolgte die Etablierung eines Mausmodells, in dem das ASNS-Gen spezifisch in Neuronen mittels der Cre/loxP Technik deletiert wurde. Die Cre-Rekombinase wird dabei unter der Kontrolle des Nex-Promotors exprimiert (Goebbels et al. 2006), sodass eine Rekombination spezifisch in Projektionsneuronen, v.a. im Cortex und Hippocampus, stattfindet. Die Tiere mit dem neuronalen ASNS-Knockout weisen eine Mikrocephalie auf. Die Ziele der vorliegenden Arbeit sind 1) die Charakterisierung dieser neu generierten, konditionalen Knockout-Mauslinie hinsichtlich des Nachweises des ASNS-Knockouts auf Proteinebene; sowie 2) die Analyse der Auswirkungen der neuronalen Deletion des ASNS-Gens auf Astrozyten und Mikrogliazellen. Zum Nachweis des Verlustes des ASNS-Proteins in vivo wurden immunhisto-chemische Färbungen auf Hirnschnitten 5, 28 und 90 Tage alter Tiere mit anti-ASNS-Antikörper angefertigt. Neben Tieren mit ASNS-Knockout wurden drei genotypisch verschiedene Kontrollen (Wildtyp, Cre-Kontrolle, ASNS loxP-Kontrolle) sowie Tiere mit heterozygoter Deletion des ASNS-Gens in die Auswertung einbezogen. Im mikroskopischen Bild und in der Quantifizierung zeigte sich sowohl im Cortex als auch im Hippocampus zu allen drei Alterszeitpunkten eine deutlich geringere Protein¬expression im ASNS-Knockout im Vergleich zu den Kontrollen. Die neuronen¬spezifische Deletion des ASNS-Gens führt somit zu einem Verlust des Proteins in vivo. Hingegen wurde im Kleinhirn wie erwartet keine Reduktion der ASNS-Expression festgestellt, da in der verwendeten Nex-Cre Mauslinie die Cre-DNA-Rekombinase nicht im Kleinhirn exprimiert wird. Mittels quantitativer PCR sowie Western Blot Analysen konnte dieses Ergebnis durch die Arbeitsgruppe bestätigt werden. Viele neurodegenerative Erkrankungen sind mit dem Auftreten einer reaktiven Gliose assoziiert (Phatnani und Maniatis 2015; Perry et al. 2010). Zur Identifizierung morphologischer Veränderungen von Astrozyten und Mikrogliazellen wurden immun¬histo¬chemische Färbungen mit anti-GFAP bzw. anti-Iba1-Antikörper auf Hirnschnitten 5, 28 und 90 Tage alter Mäuse angefertigt. Die Quantifizierung erfolgte mittels fünf verschiedener Auswertungsmethoden. Es konnten keine morphologischen Veränderungen der Astrozyten in Mäusen mit ASNS-Knockout festgestellt werden. Die Mikrogliazellen wiesen im Vergleich von ASNS-Knockout zu den Kontrollen ebenfalls keine morphologischen Veränderungen auf, jedoch konnten subtile Veränderungen der Anordnung der Zellen im Gewebeverband festgestellt werden: Quantitative Analysen zeigten leichte Veränderungen des territorialen Verhaltens der Mikrogliazellen bei Mäusen mit ASNS-Knockout, welche sich im Verlauf der Entwicklung normalisieren und bei Tieren im Alter von 90 Tagen nicht mehr detektierbar waren. Dies kann als eine transiente Entwicklungsverzögerung ausgelöst durch den neuronalen ASNS-Knockout interpretiert werden. Die Zusammenschau dieser Ergebnisse deutet darauf hin, dass im Gehirn der Mäuse mit neuronenspezifischer Deletion des ASNS-Gens keine massiven neuronalen Degenerationsprozesse ablaufen, da in diesem Fall eine Astrogliose und Mikrogliose zu erwarten wären (Burda und Sofroniew 2014). Es ergeben sich keine Anhaltspunkte für einen durch Veränderungen der Astrozyten und Mikrogliazellen ausgelösten Phänotyp, welches die Hypothese einer neuronalen, primär metabolischen Funktion der ASNS als Ursache der Mikrocephalie unterstützt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die konditionale, neuronenspezifische Deletion des ASNS-Gens im Tiermodell erfolgreich induziert werden konnte. Der Ausschluss einer Astrogliose und das Vorhandensein nur sehr subtiler Veränderungen der Mikrogliazellen bei Tieren mit ASNS-Knockout sprechen gegen eine durch starke Neurodegeneration bedingte Mikrocephalie und unterstützen die postulierte primär metabolische Funktion des Enzyms ASNS. Die Etablierung des ASNS-Knockout-Mausmodells bildet die Basis für weitere Experimente zur Klärung des Pathomechanismus, durch welchen die Mikrocephalie bei Patienten mit Defekten im ASNS-Gen ausgelöst wird.

Increased survival of presynaptic-like neuronal profiles was found in cell cultures of rat cerebellum when the non-neuronal cell numbers were reduced with an antimitotic drug. In both treated and untreated cell cultures, neurites grew onto the polylysine-coated surface of sepharose beads and formed a swelling. The neuronal swelling contained an accumulation of synaptic vesicles and a membrane density at the site of contact with the bead and was called an apparent presynaptic element. The apparent presynaptic elements in untreated cultures increased in number from the time the beads were added to the culture to 7 days incubation and then showed a decrease to one half the 7-day value at 14 days incubation. A 75% reduction in cell division of non-neuronal cells was seen in cultures exposed to a 5 × 10-6 M cytosine arabinoside (Ara-C) for 2 days. Adding polylysine-coated beads to cultures treated with Ara-C showed at 14 days incubation a 7-fold increase in the number of apparent presynaptic elements as compared to untreated cultures. Additional experiments examined the numbers of neurites on the beads and found only small differences between treated and untreated cultures. A decrease, however, was shown in the number of glial fibrillary acidic protein staining astrocytes on the surface of the beads in treated cultures. The reduction of astrocytes by Ara-C appeared to enhance the survival of apparent presynaptic elements but did not enhance the growth of neurites. These results suggest that proliferating non-neuronal cells at a site of injury in the central nervous system may inhibit the formation of synaptic contacts and the growth of neurites through the site of injury.