京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第19806号 / 人博第777号 / 新制||人||187(附属図書館) / 27||人博||777(吉田南総合図書館) / 32842 / 京都大学大学院人間・環境学研究科共生人間学専攻 / (主査)教授 林 達也, 教授 森谷 敏夫, 教授 石原 昭彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human and Environmental Studies / Kyoto University / DGAM

The intestinal epithelium is able to adapt to varying blood flow and, thus, oxygen availability. Still, the adaptation fails under pathologic situations. A better understanding of the mechanisms underlying the epithelial adaptation to hypoxia could help to improve the therapeutic approach. We hypothesized that the short-term adaptation to hypoxia is mediated via AMP-activated protein kinase (AMPK) and that it is coupled to the long-term adaptation by a common regulation mechanism, the HIF-hydroxylase enzymes. Further, we hypothesized the transepithelial transport of glucose to be part of this short-term adaptation. We conducted Ussing chamber studies using isolated lagomorph jejunum epithelium and cell culture experiments with CaCo-2 cells. The epithelia and cells were incubated under 100% and 21% O2, respectively, with the panhydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine (DMOG) or under 1% O2. We showed an activation of AMPK under hypoxia and after incubation with DMOG by Western blot. This could be related to functional effects like an impairment of Na+-coupled glucose transport. Inhibitor studies revealed a recruitment of glucose transporter 1 under hypoxia, but not after incubation with DMOG. Summing up, we showed an influence of hydroxylase enzymes on AMPK activity and similarities between hypoxia and the effects of hydroxylase inhibition on functional changes.

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This research developed methods for culturing self-assembling capillaries in an injectable gel as a potential method for vascularizing tissue-on-a-chip models to mimic physiological drug delivery. Additionally, a mathematical model was developed as a tool for understanding nutrient delivery and comparison of potential delivery systems. Organs-on-a-chip provide novel platforms for studying biology and physiology in 3D, allow exploration of tissue engineering on a manageable scale, and serve as models for drug screening and drug-delivery testing. Methods were first developed for co-culture of endothelial cells and fibroblasts (3T3s or HDFs) in 2D, evaluating culture time, seeding density and ratio of HUVECs and fibroblasts, and immunostaining with a HUVEC-specific marker. Cells formed large sheets with no signs of vessel formation in 2D; therefore, the setup was translated to 3D culture to further induce stress and release of angiogenetic factors, using fibrin gel to suspend cells in 3D. After 9 days of culture, HUVECs had extensive network formation with a high degree of complexity in the experimental cell ratios (especially with 5:1 HUVECs:HDFs). Therefore, these parameters can be used as a starting point for further development of vascularized tissue constructs. A mathematical model was also successfully developed to assess the impact of cell concentration, consumption, and mode of nutrient delivery on 3D cellular constructs which can be used to predict the spatial distribution of glucose over time. Although the model shows flow introduced through a device is sufficient to maintain nutrient levels for cell growth, developing perfusable capillaries is still a critical part of creating physiologically representative tissues.

Par l'entremise d'un modèle de souris transgénique exprimant une forme mutée et inactive d'AMPKa2 (KD), cette étude avait comme principal objectif de tester le rôle de l'AMPK dans le transport de glucose stimulé par la contraction musculaire. Un protocole de stimulation électrique a été défini pour assurer une génération de force égale entre l'extenseur digitorum longus (EDL) de souris KD et son contrôle sauvage (SA). Nous avons observé que le transport de glucose est réduit de 70% dans l'EDL de souris KD. Une cible protéique a aussi été identifiée comme étant modulée par l'AMPK lors de la contraction musculaire, soit la p38 MAPK. L'activité de p38 MAPK n'est pas modulée lors de la contraction musculaire chez la souris KD, contrairement à la souris SA. Le niveau d'ARNm de l'hexokinase II (HKII) est diminué chez la souris KD. Il est donc postulé qu'AMPK est un activateur essentiel de la p38 MAPK, ce qui pourrait contribuer à l'augmentation du transport de glucose par la contraction et à la modulation du niveau d'ARNm d'HKII cellulaire. On suggère que p38 MAPK pourrait induire l'ARNm d'HKII par l'entremise de CREB, un facteur reconnu pour être impliqué dans la transcription d'HKII.

The glucose transport protein, GLUT1, is highly expressed in rapidly proliferating cells, including cancer cells, while decreased GLUT1 levels are found in diseases such as GLUT1 deficiency syndrome and Alzheimer’s. There is increased interest in developing GLUT1 inhibitors as novel anticancer therapeutics, and the discovery of compounds that directly stimulate GLUT1 function. This work investigates how small molecules stimulate and/or inhibit GLUT1-mediated glucose transport, either directly or through the AMPK pathway. Using sugar transport assays and docking analyses to explore Ligand–GLUT1 interactions and specificity of binding, we show that: 1) Ligands inhibit GLUT1 by competing with glucose for binding to the exofacial or endofacial sugar binding sites; 2) Subsaturating inhibitor concentrations stimulate sugar uptake; 3) Ligands inhibit GLUT1–, GLUT3– and GLUT4–mediated sugar uptake in HEK293 cells; and 4) Inclusion of a benzonitrile head group on endofacial GLUT1 inhibitors confers greater inhibitory potency. Furthermore, we investigated AMPK-regulated GLUT1 trafficking in cultured blood-brain barrier endothelial cells, and show that inhibition of GLUT1 internalization is not responsible for increased cell surface levels of GLUT1 observed with AMPK activation in these cells. This study provides a framework for screening candidate GLUT1 inhibitors for specificity, and for optimizing drug design and delivery. Our data on transport stimulation at low inhibitor concentrations support the idea that GLUT1 functions as a cooperative oligomer of allosteric alternating access subunits.

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Le DT2 est caractérise par un défaut combiné de la sécrétion et de l’action de l’insuline. Depuis près d’un demi siècle la chirurgie bariatrique et notamment le Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB) ont montré des effets spectaculaires sur le contrôle glycémique remettant en question le paradigme de la prise en charge médicale du DT2. L’exclusion gastro duodénale induite par le RYGB améliore le métabolisme glucidique indépendemment de la perte de poids. Ainsi les modifications du flux biliaire semblent jouer un rôle, cependant les mécanismes sous-jacents ne sont pas clairs. Nous avons réalisés des RYGB chez le miniporc et nous avons montré que l'absorption intestinale du glucose est diminuée dans l’anse alimentaire (AL) dépourvue de bile. L'absorption du glucose dans l’AL était restaurée par l'ajout de la bile, et cet effet était inhibé lorsque le co transport actif sodium glucose 1 (SGLT1) était bloquée par la phlorizine. SGLT1 restait exprimée dans la AL, cependant la teneur dans la lumière de l’intestin en sodium était nettement diminuée. L’ajout de sodium dans l'AL provoquait le même effet que la bile sur l'absorption du glucose et augmentait également l’excursion glycémique post prandiale chez le miniporc au cours d’un repas test vigil. La diminution de l'absorption intestinale du glucose après RYGB a ensuite été confirmée chez l'homme. Nos résultats démontrent que la l’exclusion biliaire affecte le métabolisme post prandiale du glucose par modulation des co transporteurs intestinaux sodium-glucose. / Type 2 diabetes (T2D) is characterized primarily as a combined defect of insulin secretion and insulin action. For nearly a decade, the somewhat mysterious but spectacular benefit of metabolic surgery, and more specifically of Roux-en-Y gastric bypass (RYGB), on glucose control has been caused a questioning the current paradigm of T2D management. Gastro-intestinal exclusion by RYGB improves glucose metabolism, independent of weight loss. Although changes in intestinal bile trafficking have been shown to play a role, the underlying mechanisms are unclear. We performed RYGB in minipigs and showed that the intestinal uptake of ingested glucose is blunted in the bile deprived alimentary limb (AL). Glucose uptake in the AL was restored by the addition of bile, and this effect was abolished when active glucose intestinal transport was blocked with phlorizin. Sodium-glucose cotransporter 1 remained expressed in the AL, while intraluminal sodium content was markedly decreased. Adding sodium to the AL had the same effect as bile on glucose uptake. It also increased postprandial blood glucose response in conscious minipigs following RYGB. The decrease in intestinal uptake of glucose after RYGB was confirmed in humans. Our results demonstrate that bile diversion affects postprandial glucose metabolism by modulating sodium-glucose intestinal cotransport.

cotutelle: Dre Cathy Vaillancourt / Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est un état gestationnel dans lequel le fœtus est empêché de grandir et qui se caractérise par un poids fœtal inférieur au 10e percentile. En ce moment, aucun traitement n'est disponible, ce qui offre peu de possibilités aux personnes à risque. Il a été démontré que l'entraînement physique (ExT) améliore la santé de la mère, du placenta et du fœtus. En outre, le RCIU présent dans un modèle murin de pré-éclampsie a été prévenu par l'ExT. En tant que tel, nous devons nous intéresser uniquement au RCIU, car il n'existe actuellement aucun traitement pour cette pathologie. Le transporteur de glucose, à savoir GLUT4, est régulé à la hausse par l'ExT dans le muscle squelettique. Comme le RCIU est causé par une insuffisance placentaire et une diminution du transport des nutriments, l'objectif de cette ce mémoire est d'évaluer les bénéfices de l'ExT sur le transport placentaire du glucose. Les souris ont été assignées soit au régime japonais, soit au régime nord-américain (NA) à l'âge de 3 semaines, après le sevrage. Comme l'ont étudié précédemment Falcao et ses collègues (2009), nous avons voulu étudier l'effet du régime alimentaire sur le transport du glucose chez les souris WT et KO en raison des différences observées dans l'altération du placenta, le poids de l'organe et la fonction endothéliale. Nous avons donné aux souris l'accès à une roue d'exercice à usage libre 4 semaines avant et pendant la gestation. Les souris ont été sacrifiées à la fin de la gestation et le placenta a été prélevé. Les placentas ont été fixés dans de la cire de paraffine et l'immunohistochimie a été réalisée en utilisant les anticorps pour GLUT1, GLUT3, GLUT4, Pan Cytokératine, un marqueur de la prolifération du trophoblaste et CD31, un marqueur des cellules endothéliales. Nous voulions étudier la colocalisation de ces deux types de cellules dominantes avec les transporteurs de glucose. Nous avons constaté que le marquage de GLUT4 et GLUT1 dans le labyrinthe placentaire était accru chez les souris entraînées des deux génotypes et chez les souris RCIU entraînées, respectivement. En outre, nous avons constaté une colocalisation accrue de GLUT4 avec les cellules endothéliales et trophoblastes chez les souris entraînées dans l'ensemble du placenta. La colocalisation de GLUT3 avec la cytokératine Pan Cytokératine était plus faible chez les souris normales et RCIU entraînées, tandis que la colocalisation GLUT3-CD31 était significativement plus faible uniquement chez les souris ExT KO. Un effet du régime alimentaire a été observé sur GLUT4. La présence de GLUT4-Pan Cytokératine dans la caduque maternelle et le sac vitellin était significativement plus élevée chez les souris WT et KO nourries avec le régime nord- américain (NA). La colocalisation GLUT4-Pan Cytokératine et GLUT4-CD31 dans la plaque choriale était significativement plus élevée chez les souris WT nourries au régime NA que chez les souris nourries au régime japonais. Notre étude suggère que l'ExT améliore le transport placentaire du glucose par la modulation des transporteurs de glucose. À notre connaissance, nous sommes le premier groupe à rapporter ces résultats. L'ExT est donc une voie prometteuse pour la prévention du RCIU, mais d'autres études doivent être menées pour confirmer nos résultats. / Intrauterine Growth Restriction (IUGR) is a gestational condition in which the fetus is prevented from growing and characterized by a fetal weight below the 10th percentile. At present no treatments are available, proposing few avenues for those at risk. Exercise training (ExT) has been shown to improve maternal, placental, and fetal health. In addition, IUGR present in a mouse model of preeclampsia was prevented with Ext. As such, we need to look at IUGR alone as there are no current treatments for this condition. Glucose transporter, namely GLUT4, is upregulated due to ExT in the skeletal muscle. As IUGR is caused by placental insufficiency and diminished nutrient transport, the aim of this thesis is to evaluate the benefits of ExT on placental glucose transport. The mice were either assigned to the Japanese diet or the North American (NA) diet group at 3 weeks of age, after weaning. As previously studied by Falcao and colleagues (2009), we wanted to look at the effect of diet on WT and KO mice on glucose transport due to the differences in placental alteration, organ weight and endothelial function that was observed. We gave the mice access to a free-use exercise wheel 4 weeks prior to and during gestation. The mice were sacrificed at the end of gestation, and the placenta was collected. The placentas were fixed in paraffin wax, and immunohistochemistry was performed using the antibodies for GLUT1, GLUT3, GLUT4, Pan Cytokeratin, a marker of trophoblast proliferation and CD31, a marker of endothelial cells. We wanted to look at the colocalization of these two dominant cell types in conjunction with the glucose transporters. We found that GLUT4 and GLUT1 labelling in the placental labyrinth was increased in trained mice of both genotypes and trained IUGR mice, respectively. Additionally, we found increased GLUT4 colocalization with endothelial and trophoblast cells in trained mice in the overall placenta. GLUT3 colocalization with Pan Cytokeratin was significantly lower in trained normal and IUGR mice while GLUT3-CD31 co-localization was significantly lower in ExT KO mice only. An effect of diet was observed in GLUT4. GLUT4-Pan Cytokeratin in the maternal decidua and the yolk sac was significantly higher in both WT and KO mice fed the North American (NA) diet. GLUT4-Pan Cytokeratin and GLUT4-CD31 colocalization in the chorionic plate was significantly higher in NA diet-fed WT mice compared to the Japanese diet-fed WT mice. Our study suggests that ExT improves placental glucose transport through the modulation of the glucose transporters. To our knowledge, we are the first group to report these findings. As such, ExT is a promising avenue for the prevention of IUGR, however more studies need to be done to confirm our results.