Estudos termoanalíticos de alguns aditivos alimentares da classe dos realçadores de sabor foram desenvolvidos visando avaliar sua estabilidade e resistência durante o preparo de alimentos a quente assim como investigar os eventuais intermediários de decomposição que poderiam resultar destes processos. Os sais foram obtidos de fontes industriais ou sintetizados e submetidos à caracterização por análise elementar, espectrometria vibracional na região do infra-vermelho, termogravimetria/termogravimetria derivada, análise térmica diferencial e em alguns casos, calorimetria exploratória diferencial. Foram estudados o ácido glutâmico e seus sais de amônio, lítio e sódio mono e dissubstituídos. Em todos os casos observou-se uma conversão a piroglutamato após desidratação dos sais monossubstituídos, a qual ocorre via a a-carboxila. A estabilidade térmica destes sais foi da ordem de 190-200 °C. No caso dos sais dissubstituídos de lítio e sódio não houve conversão ao piroglutamato pois as duas carboxilas estão salificadas. Os glutamatos de magnésio, cálcio estrôncio e bário, também foram preparados e investigados quanto ao seu comportamento térmico. Os sais se formaram na estequiometria 2:1 (ligante:metal), apresentando águas de hidratação em número característico e foram estáveis até 190- 200 °C. Finalmente foram estudados os mecanismos de decomposição térmica do inosinato-monofosfato de sódio e do guanilato-monofosfato de sódio, dois nucleotídeos que apresentam a propriedade de realçar o sabor de alimentos. Ambos apresentaram elevado grau de hidratação, para o qual foi possível distinguir mecanismos característicos de desidratação. A decomposição dos sais anidros ocorreu com saída do grupo purínico, seguida da decomposição do restante da molécula e formação de pirofosfato de sódio como resíduo final. / Thermal analytical studies of some food addictives of the flavor enhancer class were developed in order to evaluate their stability and resistance to the hot cooking process, as well as to identify the intermediaries of thermal decomposition that could remain at the end of such processes. The salts were obtained from industrial sources or synthesized and characterized by elemental analysis, infra-red spectroscopy, thermogravimetry/derivative thermogravimetry, differential thermal analysis and in some opportunities to differential scanning calorimetry. The glutamic acid and its ammonium, lithium and sodium salts mono and disubstituted were investigated. In all cases a conversion to pyroglutamate has been observed in the free acid and its monosubstituted salts after dehydration. The conversion undergoes by the ?-carboxyl group. The thermal stability was observed to be as high as 190-200 °C. In the case of the lithiu m and sodium dissubstituted salts any conversions to pyroglutamates were observed, once both carboxyl groups were salified. Magnesium, calcium, strontium and barium glutamates has also been synthesized and investigated in relation to its thermal behavior. The salts were formed in the 2:1 stoichiometry (ligand:metal), presenting hydration waters in a characteristic content and showed to be stable up to 190-200 °C. Finally the thermal decomposition mechanisms of dissodium inosinatemonophosphate and dissodium guanilate-monophosphate two nucleotides with flavor enhancement properties in food were also investigated. Both presented high degree of hydration, to which it was possible to propose a water release mechanism. The decomposition of the anhydrous salts occurred with release of the purine group followed by the decomposition of the rest of the molecule generating sodium pyrophosphate as residue.

Neste estudo focamos no papel de cinco transportadores da família ABC (ATP-binding cassete) envolvidos com a captação ativa de oligopeptídeos, poliaminas, fosfato inorgânico, glutamato e glutamina, em duas espécies bacterianas: Streptococcus mutans, que causa a cárie, e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), responsável por diarreias e síndrome hemolítica urêmica em humanos. Com relação a inativação do sistema de transporte de oligopeptídeos de S. mutans não observamos alteração do crescimento bacteriano ou da aderência à superfícies abióticas. A deleção do sistema de captação de poliaminas não interferiu com o crescimento em meio rico, porém aumentou a resistência à ambiente ácidos. Inativação do sistema de transporte de fosfato inorgânico reduziu a aderência de S. mutans. Sobre os sistemas de transporte de glutamato e glutamina, mutantes de S. mutans apresentaram alterações nas taxas de crescimento e adesão à superfícies. Inativação da proteína OppA de EHEC não afetou a produção da toxina Stx bem como a patogenicidade in vitro e in vivo de EHEC. Em suma, o presente estudo demonstra que o papel dos transportadores ABC na fisiologia e patogenicidade de bactérias pode variar de acordo com a espécies bem como com o substrato transportado. / This study focuses on the role of five ABC (ATP-binding cassette) transport systems related to active uptake of oligopeptides, polyamines, inorganic phosphate, glutamate and glutamine. In this work we study two bacterial species: Streptococcus mutans, which causes caries, and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC), responsible for diarrhea and hemolytic uremic syndrome in humans. The inactivation of the S. mutans oligopeptide transport system did not change the bacterial growth and adherence to abiotic surfaces. Inactivation of the polyamine uptake system did not interfere with growth in rich medium, but increased the survival of bacteria in acid environments. Inactivation of the inorganic phosphate transport system reduced the adherence of S. mutans. Regarding the glutamate and glutamine transport systems, the S. mutans mutants showed changes in growth rates and adhesion to abiotic surfaces. Inactivation of the EHEC OppA protein, did not affect the production of the Stx toxin neither affected the in vitro and in vivo pathogenicity of the strain. Collectively, the present study shows that the roles of ABC transporters in the physiology and pathogenicity of bacteria may vary according to the species involved as well as the substrate transported.

A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

by Cheng Wai Ming. / Thesis submitted in: October, 1998. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1999. / Includes bibliographical references (leaves 54-68 (2nd gp.)). / Abstracts in English and Chinese. / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.iv / ABSTRACT --- p.v / ABSTRACT (Chinese) --- p.vii / Chapter CHAPTER 1 --- LITERATURE REVIEW --- p.1 / Chapter 1.1 --- Ionotropic glutamate receptors --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- AMP A receptor --- p.3 / Chapter 1.1.1.1 --- Structure of AMP A receptor --- p.3 / Chapter 1.1.1.2 --- Electrophysiological properties of AMPA receptor --- p.4 / Chapter 1.1.1.3 --- Pharmacology of AMPA receptors --- p.6 / Chapter 1.1.1.4 --- Kinetics of AMPA receptors --- p.8 / Chapter 1.1.2 --- NMDA receptor --- p.9 / Chapter 1.1.2.1 --- Structure of NMDA receptor --- p.9 / Chapter 1.1.2.2 --- Electrophysiological properties of NMDA receptor --- p.10 / Chapter 1.1.2.3 --- Pharmacology of NMDA receptor --- p.11 / Chapter 1.1.2.4 --- Kinetics of NMDA receptor --- p.12 / Chapter 1.2. --- The basal ganglia and the SNR --- p.12 / Chapter 1.3 --- Excitatory glutamatergic inputs on SNR --- p.16 / Chapter 1.4 --- Aim of study --- p.17 / Chapter CHAPTER 2 --- Electrophysiological properties of SNR neurones --- p.18 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.18 / Chapter 2.2 --- Methods --- p.19 / Chapter 2.2.1 --- In vitro slice preparation and maintenance --- p.19 / Chapter 2.2.2 --- Whole-cell patch-clamp recording --- p.20 / Chapter 2.2.3 --- Solutions and drugs --- p.21 / Chapter 2.2.4 --- Histological methods --- p.21 / Chapter 2.2.5 --- Data analysis --- p.22 / Chapter 2.3 --- Results --- p.22 / Chapter 2.3.1 --- Passive membrane properties of SNR neurones --- p.22 / Chapter 2.3.2 --- Firing rate and action potential characteristics --- p.23 / Chapter 2.3.3 --- Firing patterns --- p.23 / Chapter 2.3.4 --- Weak hyperpolarization activated inward rectification --- p.24 / Chapter 2.3.5 --- Slow aflerhyperpolarization --- p.25 / Chapter 2.3.6 --- Current-frequency relationship --- p.25 / Chapter 2.3.7 --- Morphology of labelled SNR neurones --- p.25 / Chapter 2.4 --- Discussion and conclusion --- p.26 / Chapter CHAPTER 3 --- AMPA and NMDA induced membrane responses --- p.30 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.30 / Chapter 3.2 --- Methods --- p.31 / Chapter 3.2.1 --- In vitro slice preparation and maintenance --- p.31 / Chapter 3.2.2 --- Whole-cell patch-clamp recording --- p.31 / Chapter 3.2.3 --- Solutions and drugs --- p.31 / Chapter 3.2.4 --- Drug application --- p.32 / Chapter 3.2.5 --- Immunocytochemistry --- p.32 / Chapter 3.2.6 --- Data analysis --- p.33 / Chapter 3.3 --- Results --- p.33 / Chapter 3.3.1 --- AMPA induced responses in SNR GABA neurones --- p.33 / Chapter 3.3.1.1 --- AMPA induced membrane depolarization --- p.33 / Chapter 3.3.1.2 --- AMPA induced membrane current --- p.34 / Chapter 3.3.1.3 --- Current-voltage relationship --- p.34 / Chapter 3.3.1.4 --- Effect of NBQX --- p.35 / Chapter 3.3.1.5 --- Effects of JSTX and spermine --- p.35 / Chapter 3.3.2 --- NMDA-induced response in SNR GABA neurones --- p.36 / Chapter 3.3.2.1 --- NMDA induced membrane depolarization --- p.36 / Chapter 3.3.2.2 --- NMDA induced membrane current --- p.36 / Chapter 3.3.2.3 --- APV blocked NMDA-induced current --- p.36 / Chapter 3.3.2.4 --- Effect of glycine on NMDA induced response --- p.37 / Chapter 3.3.2.5 --- Mg2+-sensitivity --- p.37 / Chapter 3.3.2.6 --- Current-voltage relationship --- p.38 / Chapter 3.3.3 --- GluR2 subunit immunostaining --- p.38 / Chapter 3.4 --- Discussion and conclusion --- p.39 / Chapter 3.4.1 --- AMPA receptors in SNR neurones --- p.39 / Chapter 3.4.2 --- NMDA receptors in SNR neurones --- p.41 / Chapter 3.4.3 --- Functional significance --- p.41 / Chapter CHAPTER 4 --- Glutamate-mediated synaptic currents in SNR --- p.43 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.43 / Chapter 4.2 --- Methods --- p.44 / Chapter 4.2.1 --- In vitro slice preparation and maintenance --- p.44 / Chapter 4.2.2 --- Electrophysiological recordings --- p.44 / Chapter 4.2.3 --- Electrical stimulation --- p.45 / Chapter 4.2.4 --- Solutions and drugs --- p.45 / Chapter 4.2.5 --- Data analysis --- p.46 / Chapter 4.3 --- Results --- p.46 / Chapter 4.3.1 --- Characteristics of spontaneous EPSCs --- p.46 / Chapter 4.3.1.1 --- General characteristics --- p.46 / Chapter 4.3.1.2 --- Kinetics --- p.47 / Chapter 4.3.1.3 --- Pharmacology --- p.47 / Chapter 4.3.2 --- Characteristics of evoked EPSCs --- p.48 / Chapter 4.3.2.1 --- General characteristics --- p.48 / Chapter 4.3.2.2 --- Pharmacological characterization --- p.49 / Chapter 4.3.2.3 --- Effects of bicuculline --- p.50 / Chapter 4.4 --- Discussion and conclusion --- p.50 / Chapter 4.4.1 --- Excitatory transmission onto SNR neurones --- p.50 / Chapter 4.4.2 --- Source of excitatory drive --- p.51 / Chapter 4.4.3 --- Interaction with GABA inputs --- p.52 / Chapter 4.4.4 --- Functional significance --- p.52 / REFERENCES --- p.54

Estudos termoanalíticos de alguns aditivos alimentares da classe dos realçadores de sabor foram desenvolvidos visando avaliar sua estabilidade e resistência durante o preparo de alimentos a quente assim como investigar os eventuais intermediários de decomposição que poderiam resultar destes processos. Os sais foram obtidos de fontes industriais ou sintetizados e submetidos à caracterização por análise elementar, espectrometria vibracional na região do infra-vermelho, termogravimetria/termogravimetria derivada, análise térmica diferencial e em alguns casos, calorimetria exploratória diferencial. Foram estudados o ácido glutâmico e seus sais de amônio, lítio e sódio mono e dissubstituídos. Em todos os casos observou-se uma conversão a piroglutamato após desidratação dos sais monossubstituídos, a qual ocorre via a a-carboxila. A estabilidade térmica destes sais foi da ordem de 190-200 °C. No caso dos sais dissubstituídos de lítio e sódio não houve conversão ao piroglutamato pois as duas carboxilas estão salificadas. Os glutamatos de magnésio, cálcio estrôncio e bário, também foram preparados e investigados quanto ao seu comportamento térmico. Os sais se formaram na estequiometria 2:1 (ligante:metal), apresentando águas de hidratação em número característico e foram estáveis até 190- 200 °C. Finalmente foram estudados os mecanismos de decomposição térmica do inosinato-monofosfato de sódio e do guanilato-monofosfato de sódio, dois nucleotídeos que apresentam a propriedade de realçar o sabor de alimentos. Ambos apresentaram elevado grau de hidratação, para o qual foi possível distinguir mecanismos característicos de desidratação. A decomposição dos sais anidros ocorreu com saída do grupo purínico, seguida da decomposição do restante da molécula e formação de pirofosfato de sódio como resíduo final. / Thermal analytical studies of some food addictives of the flavor enhancer class were developed in order to evaluate their stability and resistance to the hot cooking process, as well as to identify the intermediaries of thermal decomposition that could remain at the end of such processes. The salts were obtained from industrial sources or synthesized and characterized by elemental analysis, infra-red spectroscopy, thermogravimetry/derivative thermogravimetry, differential thermal analysis and in some opportunities to differential scanning calorimetry. The glutamic acid and its ammonium, lithium and sodium salts mono and disubstituted were investigated. In all cases a conversion to pyroglutamate has been observed in the free acid and its monosubstituted salts after dehydration. The conversion undergoes by the ?-carboxyl group. The thermal stability was observed to be as high as 190-200 °C. In the case of the lithiu m and sodium dissubstituted salts any conversions to pyroglutamates were observed, once both carboxyl groups were salified. Magnesium, calcium, strontium and barium glutamates has also been synthesized and investigated in relation to its thermal behavior. The salts were formed in the 2:1 stoichiometry (ligand:metal), presenting hydration waters in a characteristic content and showed to be stable up to 190-200 °C. Finally the thermal decomposition mechanisms of dissodium inosinatemonophosphate and dissodium guanilate-monophosphate two nucleotides with flavor enhancement properties in food were also investigated. Both presented high degree of hydration, to which it was possible to propose a water release mechanism. The decomposition of the anhydrous salts occurred with release of the purine group followed by the decomposition of the rest of the molecule generating sodium pyrophosphate as residue.

A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

Neste estudo focamos no papel de cinco transportadores da família ABC (ATP-binding cassete) envolvidos com a captação ativa de oligopeptídeos, poliaminas, fosfato inorgânico, glutamato e glutamina, em duas espécies bacterianas: Streptococcus mutans, que causa a cárie, e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), responsável por diarreias e síndrome hemolítica urêmica em humanos. Com relação a inativação do sistema de transporte de oligopeptídeos de S. mutans não observamos alteração do crescimento bacteriano ou da aderência à superfícies abióticas. A deleção do sistema de captação de poliaminas não interferiu com o crescimento em meio rico, porém aumentou a resistência à ambiente ácidos. Inativação do sistema de transporte de fosfato inorgânico reduziu a aderência de S. mutans. Sobre os sistemas de transporte de glutamato e glutamina, mutantes de S. mutans apresentaram alterações nas taxas de crescimento e adesão à superfícies. Inativação da proteína OppA de EHEC não afetou a produção da toxina Stx bem como a patogenicidade in vitro e in vivo de EHEC. Em suma, o presente estudo demonstra que o papel dos transportadores ABC na fisiologia e patogenicidade de bactérias pode variar de acordo com a espécies bem como com o substrato transportado. / This study focuses on the role of five ABC (ATP-binding cassette) transport systems related to active uptake of oligopeptides, polyamines, inorganic phosphate, glutamate and glutamine. In this work we study two bacterial species: Streptococcus mutans, which causes caries, and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC), responsible for diarrhea and hemolytic uremic syndrome in humans. The inactivation of the S. mutans oligopeptide transport system did not change the bacterial growth and adherence to abiotic surfaces. Inactivation of the polyamine uptake system did not interfere with growth in rich medium, but increased the survival of bacteria in acid environments. Inactivation of the inorganic phosphate transport system reduced the adherence of S. mutans. Regarding the glutamate and glutamine transport systems, the S. mutans mutants showed changes in growth rates and adhesion to abiotic surfaces. Inactivation of the EHEC OppA protein, did not affect the production of the Stx toxin neither affected the in vitro and in vivo pathogenicity of the strain. Collectively, the present study shows that the roles of ABC transporters in the physiology and pathogenicity of bacteria may vary according to the species involved as well as the substrate transported.

Os nossos resultados demonstraram a atividade enzimática prolina desidrogenase (PRODH) do produto do gene anotado como codificante de uma prolina oxidase na base dados do genoma de Trypanosoma cruzi. A atividade da proteína codificada por esse gene foi avaliada inicialmente por complementação de uma linhagem de S. cerevisiae deficiente na expressão funcional da PRODH endógena, e posteriormente mediante a obtenção da enzima recombinante ativa expressa em um sistema bacteriano. Nos estudos feitos tanto com leveduras complementadas com o gene PRODH, quanto com as formas epimastigotas de T. cruzi, observamos que nesses organismos há uma correlação positiva entre o nível intracelular de prolina livre e a resistência ao estresse oxidativo. Através dos ensaios de RT-PCR quantitativo observamos que o RNAm do gene da PRODH é regulado ao longo do ciclo de vida do T. cruzi, com maior nível de expressão no estágio epimastigota intracelular, perfil apresentado também em experimentos de Western Blotting, o que é concordante com o papel fundamental desse aminoácido na diferenciação dessa forma para as forma tripomastigota. Nos diferentes ensaios de localização subcelular observou-se que a proteína PRODH está presente na mitocôndria. A seqüência da PRODH apresenta um sítio EF-hand de ligação a Ca2+. Mostramos experimentalmente a funcionalidade desse sítio e a sua função na regulação da atividade por Ca2+. Em ensaios de respiração mitocondrial, utilizando prolina como substrato, foi mostrado que a prolina fornece elétrons à cadeia respiratória através da PRODH, transferindo elétrons e gerando FADH2 no mesmo nível e com a mesma eficiência que o complexo II (succinato desidrogenase). O análogo de prolina T4C, inibidor do transporte de prolina, causa uma diminuição do conteúdo de prolina livre intracelular, o que foi relacionado com uma diminuição significativa da sobrevivência do parasito em combinação com o estresse nutricional e oxidativo, mostrando a participação do metabolismo de prolina na resistência a esses estresses. Todos esses dados sugerem ademais que o transportador de prolina do parasita pode ser um alvo para drogas terapêuticas de interesse quando combinada com outras drogas que agem via geração de espécies reativas de oxigênio. / In the present work, we demonstrated the proline dehydrogenase enzymatic activity (PRODH) for the protein encoded by a gene annotated as a proline oxidase in the T. cruzi genome data base. This activity was shown firstly through complementation of a S. cerevisiae lineage lacking its endogenous PRODH gene. The PRODH gene was also expressed in a bacterial system and the active recombinant protein was obtained. Experiments performed with both, complemented yeasts and T. cruzi epimastigotes, showed a correlation between the intracellular free proline levels and the oxidative stress resistance. Quantitative RT-PCR assay revealed that the PRODH gene is differentially expressed across T. cruzi life cycle, being the highest expression level shown by the intracellular epimastigote form, this result was confirmed by Western blotting. Both results are in accordance with the fact that proline is essential for the differentiation of the intracellular epimastigote into trypomastigote. Subcellular localization assays showed that PRODH is present preferentially in the mitochondria. In silico analyses of the PRODH peptidic sequence indicated the presence of an EF-hand domain, wich is, usually, involved in Ca2+ binding. In fact, our results confirm not only the ability of such domain of binding Ca2+ but also its function in the activity regulation. Mitochondrial respiration assays using proline as substrate showed that PRODH transfers electrons and generates FADH2, with an eficience comparable to that of the complex II (Succinate dehydrogenase). Experiments using the T4C, an analogue of proline that inhibits the proline uptake, caused the depletion of the intracellular free proline, which was followed by the significantly decrement of the cellular viability of the parasites under nutritional and oxidative stresses. Taken together, this data suggest that proline transporters are promising drug targets when combined with other drugs that act by generating reactive oxygen species.

Os nossos resultados demonstraram a atividade enzimática prolina desidrogenase (PRODH) do produto do gene anotado como codificante de uma prolina oxidase na base dados do genoma de Trypanosoma cruzi. A atividade da proteína codificada por esse gene foi avaliada inicialmente por complementação de uma linhagem de S. cerevisiae deficiente na expressão funcional da PRODH endógena, e posteriormente mediante a obtenção da enzima recombinante ativa expressa em um sistema bacteriano. Nos estudos feitos tanto com leveduras complementadas com o gene PRODH, quanto com as formas epimastigotas de T. cruzi, observamos que nesses organismos há uma correlação positiva entre o nível intracelular de prolina livre e a resistência ao estresse oxidativo. Através dos ensaios de RT-PCR quantitativo observamos que o RNAm do gene da PRODH é regulado ao longo do ciclo de vida do T. cruzi, com maior nível de expressão no estágio epimastigota intracelular, perfil apresentado também em experimentos de Western Blotting, o que é concordante com o papel fundamental desse aminoácido na diferenciação dessa forma para as forma tripomastigota. Nos diferentes ensaios de localização subcelular observou-se que a proteína PRODH está presente na mitocôndria. A seqüência da PRODH apresenta um sítio EF-hand de ligação a Ca2+. Mostramos experimentalmente a funcionalidade desse sítio e a sua função na regulação da atividade por Ca2+. Em ensaios de respiração mitocondrial, utilizando prolina como substrato, foi mostrado que a prolina fornece elétrons à cadeia respiratória através da PRODH, transferindo elétrons e gerando FADH2 no mesmo nível e com a mesma eficiência que o complexo II (succinato desidrogenase). O análogo de prolina T4C, inibidor do transporte de prolina, causa uma diminuição do conteúdo de prolina livre intracelular, o que foi relacionado com uma diminuição significativa da sobrevivência do parasito em combinação com o estresse nutricional e oxidativo, mostrando a participação do metabolismo de prolina na resistência a esses estresses. Todos esses dados sugerem ademais que o transportador de prolina do parasita pode ser um alvo para drogas terapêuticas de interesse quando combinada com outras drogas que agem via geração de espécies reativas de oxigênio. / In the present work, we demonstrated the proline dehydrogenase enzymatic activity (PRODH) for the protein encoded by a gene annotated as a proline oxidase in the T. cruzi genome data base. This activity was shown firstly through complementation of a S. cerevisiae lineage lacking its endogenous PRODH gene. The PRODH gene was also expressed in a bacterial system and the active recombinant protein was obtained. Experiments performed with both, complemented yeasts and T. cruzi epimastigotes, showed a correlation between the intracellular free proline levels and the oxidative stress resistance. Quantitative RT-PCR assay revealed that the PRODH gene is differentially expressed across T. cruzi life cycle, being the highest expression level shown by the intracellular epimastigote form, this result was confirmed by Western blotting. Both results are in accordance with the fact that proline is essential for the differentiation of the intracellular epimastigote into trypomastigote. Subcellular localization assays showed that PRODH is present preferentially in the mitochondria. In silico analyses of the PRODH peptidic sequence indicated the presence of an EF-hand domain, wich is, usually, involved in Ca2+ binding. In fact, our results confirm not only the ability of such domain of binding Ca2+ but also its function in the activity regulation. Mitochondrial respiration assays using proline as substrate showed that PRODH transfers electrons and generates FADH2, with an eficience comparable to that of the complex II (Succinate dehydrogenase). Experiments using the T4C, an analogue of proline that inhibits the proline uptake, caused the depletion of the intracellular free proline, which was followed by the significantly decrement of the cellular viability of the parasites under nutritional and oxidative stresses. Taken together, this data suggest that proline transporters are promising drug targets when combined with other drugs that act by generating reactive oxygen species.