Abstract The significant root growth inhibition in zinc-treated soybean (Glycine max) seedling correlated with the increase of PODs and laccases activity. The increase of the activities of PODs (pI 8.3, pI 7.7, pI 4.8, pI 4.4 and pI 3.7) and laccases (pI 9.4, pI 8.3, pI 7.4, and pI 3.7) are accompanied by a rise of lignin contents in Zn-treated tissues. Our results suggested that laccases work during the early stage of Zn treatment. Laccases and peroxidases work cooperatively in lignin synthesis when the time of Zn treatment was prolonged.

The auxins, including indole-3-acetic acid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA) and naphthaleneacetic acid (NAA), promotes the formation of adventitious root in hypocotyls of soybean (Glycine max). IBA significantly promotes the formation of adventitious roots more than IAA and NAA . The activity of anionic pI 3.7 peroxidase (POX) and cationic pI 8.5 POX were inhibited by exogenous auxins during the induction of adventitious root on day 2. Besides, the activity of pI 5.3 POX was enhanced by IBA during the initiation stage on day 4. The increase of the activity of pI 5.3 POX was accompanied by the increase of H2O2 levels. In the previous researches, it shows that the promoter of pI 8.5 POX gene contains both ARF/AuxRE and CATATGGMSAUR motifs that are responded to auxins. In this studies, the pI 5.3 POX gene, which responses to auxins a day or two later, contains only ARF/AuxRE motif. The regulation of pI 5.3 POX gene is probably initiation phase-dependent. The results suggest that anionic pI 5.3 POX produces significant amount of H2O2 through the binding of auxin to POX and mediate the auxin signaling pathway leading to plant growth .

Os agrupamentos ferro-enxofre [Fe-S] são grupos prostéticos requeridos em processos essenciais como respiração, fotossíntese, reações metabólicas, sinalização e regulação gênica. Em plantas, a biossíntese das proteínas Fe-S é compartimentalizada e adaptada às necessidades de uma célula eucariótica fotossintetizante. Diversos fatores ambientais afetam o desenvolvimento das plantas e limitam sua produtividade. Dentre esses organismos afetados encontram-se a soja e o arroz, culturas de grande importância comercial no Brasil e no mundo. Foram analisados, pelo método de RT-qPCR, os perfis de expressão dos genes que codificam a enzima cisteína desulfurase NFS1 e NFS2 de ambas as espécies, participantes da rota de formação dos cofatores [Fe-S] mitocondriais e plastídicos, respectivamente. Para Oryza sativa ssp. indica e ssp. japonica, as análises permitiram mostrar uma distribuição diferencial dos transcritos entre órgãos. OsNFS1 apresenta maiores níveis de transcritos tanto em raiz quanto em folha, enquanto OsNFS2 apresentou maiores níveis de transcritos em folha do que em raiz. A resposta destes genes ao frio (24 h a 4ºC) difere entre as subespécies. Na ssp. japonica, os dois genes são induzidos em ambos os tecidos. Para a ssp. indica há redução dos níveis de mRNA de NFS1 e aumento de NFS2 em folhas, e não há respostas em raízes. Nos tratamentos com alumínio na ssp. japonica, há redução dos níveis de mRNA de ambos os genes nas raízes, enquanto não há resposta na parte aérea. As análises em Glycine max, organismo que apresenta duplicação dos genes, permitiram demonstrar que a modulação destes é realizada de maneira diferencial. Em raiz, o tratamento com frio (5 h, 10 h e 24 h a 4ºC) promoveu a redução dos níveis de mRNA de uma das cópias de NFS1 e a indução da outra, enquanto os genes codificadores de NFS2 foram reprimidos. Em folha, o mesmo tratamento induziu uma das cópias de NFS1 e uma de NFS2, enquanto que as outras oscilaram em nível bem inferior de expressão. A exposição de G. max ao ácido salicílico induz a modulação dos genes mitocondriais, aumentando os níveis de mRNA em raízes e reprimindo-os em folhas. As análises dos cis-elementos permitiram mostrar a correlação destes com os dados encontrados em RT-qPCR. Desta maneira, tanto em arroz quanto em soja, a cisteína desulfurase parece ser modulada por diferentes estresses, possuindo padrões diferenciados conforme o órgão e o gene. / Iron-sulfur [Fe-S] clusters are prosthetic groups required to maintain life processes including respiration, photosynthesis, metabolic reactions, sensing, signaling and, gene regulation. In plants the biogenesis of Fe-S protein is compartmentalized and adapted to specific needs of the eukaryotic and photosynthetic cell. Many environmental factors affect plant development and limit the productivity and the geographical distribution. Among those affected organisms are soybean and rice, crops with huge economic importance worldwide. Here we analyze the expression profile of cysteine desulfurase genes NFS1 and NFS2, involved in the biogenesis of [Fe-S] clusters in mitochondria and plastid, respectively, from both species, by RT-qPCR. Analysis of Oryza sativa ssp. indica and ssp. japonica showed a differential expression between organs, OsNFS1 has a higher expression in roots and leaves than OsNFS2, and OsNFS2 is more expressed in leaves than in roots. Rice subspecies exhibited different responsiveness to cold. The japonica ssp. increased transcript level from both genes in both organs, while ssp. indica decreased OsNFS1 and increased OsNFS2 expressions in leaves, and did not change the expression pattern in roots. Rice ssp. japonica showed a decrease in OsNFS1 and OsNFS2 transcript levels in root, while leaves did not change, under aluminum stress. Soybean analysis, which presents duplication of both genes, demonstrated particular transcript levels considering organ and stress response. GmNFS1 had a high expression in roots, while GmNFS2 did not differ between organs. Cold-treated plants (0, 5, 10 and 24h at 4°C) showed a decrease in cysteine desulfurases transcript level in roots, and an increase in leaves. Plants treated with salicylic acid increased GmNFS1 transcript level in roots, and decreased in leaves. Besides that, an analysis of promoter regions showed the presence of different cis-elements among cysteine desulfurase genes, corroborating with differential expression of each loci. Our results suggest that cysteine desulfurases, in rice and soybean, may be involved in stress response, being modulated by different stimuli according to organ and gene.

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. / Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-05T17:08:36Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 384107 bytes, checksum: f7efd9f5b0c82417e3f4a40af943b9d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T17:08:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 384107 bytes, checksum: f7efd9f5b0c82417e3f4a40af943b9d6 (MD5) Previous issue date: 2004-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O plantio, no Brasil, da soja geneticamente modificada, resistente ao glyphosate, permite a utilização desse herbicida também em pós-emergência nessa cultura. Em regiões dos Estados Unidos, aonde esta prática já vem sendo realizada, foi relatado o efeito tóxico do glyphosate a microrganismos, dentre eles o rizóbio, microssimbionte da soja. Decorrente disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito in vitro do glyphosate sobre estirpes de Bradyrhizobium, recomendadas, nacionalmente, para inoculação em sementes de soja. Foram realizados quatro experimentos em laboratório com as estirpes de Bradyrhizobium elkanii: SEMIA 587 e SEMIA 5019, e Bradyrhizobium japonicum: SEMIA 5079 e SEMIA 5080. No primeiro experimento avaliou-se o efeito de concentrações crescentes do glyphosate, variando de 0,0 a 43,2 μg L-1. No segundo experimento, as estirpes foram submetidas ao glyphosate puro ou em mistura ao herbicida carfentrazone-ethyl e, também, aos herbicidas fomesafen e imazethapyr. As concentrações dos herbicidas foram: 12,9; 3,6; 1,4; e 1,8 μg L-1, respectivamente, de glyphosate-K, fomesafen, imazethapyr e carfentrazone-ethyl. No terceiro experimento, testaram-se as principais formulações comerciais de glyphosate e, por fim, avaliou-se o crescimento das estirpes sob ação do glyphosate em meio de cultura enriquecido de aminoácidos aromáticos. Com base nos resultados, verificou-se que o glyphosate reduziu o crescimento das estirpes de Bradyrhizobium em todas as concentrações testadas, sendo esta redução tanto maior, quanto maior a concentração do herbicida no meio de cultura. As estirpes de Bradyrhizobium apresentaram sensibilidade diferencial às menores concentrações do glyphosate, sendo SEMIA 587, a mais sensível. Contudo, na maior concentração do glyphosate todas as estirpes tiveram seu crescimento reduzido, em média, 60%. Na comparação entre os herbicidas, observou-se que carfentrazone-ethyl, além de ter proporcionado menor inibição no crescimento de todas as estirpes, reduziu a toxicidade do glyphosate quando em mistura. Os herbicidas que se mostraram mais tóxicos foram fomesafen e imazethapyr. Dentre as marcas comerciais testadas, foi verificado o efeito tóxico dos aditivos presentes nas mesmas, uma vez que o glyphosate puro apresentou toxidez menor, comparado aos produtos formulados. A formulação Zapp Qi® apresentou a menor toxidez e Roundup Transorb®, a maior, causando inibição total do crescimento das estirpes. A suplementação do meio de cultura com aminoácidos aromáticos diminuiu a ação tóxica do glyphosate puro e da formulação comercial Zapp Qi®, sobre o Bradyrhizobium, entretanto, foi indiferente para Roundup Transorb®, o qual inibiu quase que totalmente o crescimento de três das quatro estirpes testadas independente do enriquecimento do meio. / In Brazil, soybean genetically modified plantation, resistant to glyphosate, will also allow this herbicide use in post emergence in that culture. In the United States areas, where this practice has already being accomplished, it was told the glyphosate toxicant effect to microorganisms, among them the soybean rhizobium microsymbiont. Due to that, this work aimed to evaluate the in vitro glyphosate effect on Bradyrhizobium strains, nationally recommended, for soybean seeds inoculation. Four experiments were accomplished in laboratory with Bradyrhizobium elkanii strains SEMIA 587 and SEMIA 5019 and Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In the first experiment the glyphosate growing concentrations effect was evaluated, varying from 0.0 to 43.2 μg L-1. In the second one, the strains were submitted to the pure glyphosate and in mixture to the herbicide carfentrazone-ethyl and also to the herbicides fomesafen and imazethapyr. In the third experiment, it was tested the main commercial formulations of glyphosate and, finally, the strains growth was evaluated under glyphosate action in medium enriched by aromatic amino acids. Based in these results, it was verified that the Bradyrhizobium strains growth was reduced by the glyphosate in all the tested concentrations, being so much this reduction larger, as larger is the concentration of herbicide in the medium. The Bradyrhizobium strains presented differential sensibility to the glyphosate smallest concentrations, being SEMIA 587, the most sensitive. However, in the largest glyphosate concentration, all the strains had its growth reduced, on the average, 60%. Comparison the herbicides, it was observed that carfentrazone-ethyl, besides having provided smaller inhibition in all strains growth, reduced the glyphosate toxicity when in mixture. The treatments with fomesafen and imazethapyr were the ones that showed more toxins. Among the tested commercial marks, toxicant effect of its addictive was verified in them, once the pure glyphosate presented smaller toxicity, compared to the formulated products. The formulation Zapp Qi ® presented the smallest toxicity and Roundup Transorb ®, the largest, causing total inhibition of strains growth. The supplementation of the medium with aromatic amino acids decreased the toxicant action of the pure glyphosate and of the commercial formulation Zapp Qi®, on Bradyrhizobium, however, it was indifferent for Roundup Transorb ®, which totally inhibited the growth of three of the four tested strains, not depending of the enrichment medium.

As urease de plantas catalisam a hidrólise da ureia e apresentam efeitos tóxicos a fungos patogênicos e insetos fitófagos. Em soja [Glycine max L. Merrill] foram descritas duas ureases estruturais: a embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, e a ubíqua, codificada pelo gene Eu4. Sabe-se que a urease embrião-específica purificada apresenta efeito inibitório sobre o crescimento in vitro de fungos filamentosos e desenvolvimento de insetos. A urease ubíqua é responsável pela reciclagem de toda a ureia proveniente do metabolismo, mas não há informações sobre seu envolvimento no sistema de defesa das plantas. A transformação genética é uma ferramenta importante em estudos de genômica funcional e, portanto, a disponibilidade de sistemas eficientes é um pré-requisito essencial. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas estavelmente transformadas a partir de embriões somáticos de soja submetidos ao sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium, bem como a identificação e caracterização funcional dos genes que codificam as ureases estruturais de soja, especialmente a urease ubíqua em relação aos processos de resposta a fungos patogênicos. Inicialmente, testamos a eficiência de transformação de embriões somáticos secundários por um método que combina o bombardeamento de partículas livres de DNA com o sistema Agrobacterium. Plantas transgênicas férteis foram regeneradas de vários experimentos independentes de transformação utilizando diferentes plasmídios. Posteriormente, foi realizada a caracterização dos genes que codificam ureases presentes no genoma da soja. O gene Eu4 apresentou um padrão de expressão diferencial para genótipos suscetível e resistente ao longo do período de infecção por Phakopsora pachyrhizi, o agente etiológico da ferrugem asiática. Plantas transgênicas foram geradas visando a superexpressão de Eu4. Contudo, apenas uma planta apresentou níveis aumentados de expressão desse gene, enquanto que as demais plantas apresentaram o fenômeno de co-supressão dos genes endógeno e transgene. Avaliou-se o crescimento vegetativo dos fungos Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii e Penicillium herguei em meio de cultura contendo extrato protéico bruto de plantas transgênicas expressando maiores e menores níveis de urease e de plantas não-transgênicas. O crescimento dos fungos foi inversamente proporcional a quantidade da urease presente no extrato protéico das plantas. Quando infectadas por uredósporos de P. pachyrhizi, folhas destacadas das plantas co-suprimidas desenvolveram um número significativamente maior de lesões, pústulas e pústulas abetas do que folhas com níveis normais da enzima. Em conjunto estes resultados indicam um 15 importante envolvimento da urease ubíqua da soja na resposta à infecção da planta por fungos patogênicos. Além disso, um terceiro gene que codifica urease foi encontrado no banco de dados com a sequência completa do genoma da soja. O gene foi denominado Eu5 e seu produto SBU-III. A análise filogenética mostra que SBU-III está fortemente relacionada à isoforma embrião-específica. Apesar da grande similaridade na seqüência primária da proteína, SBU-III apresenta uma mutação em um aminoácido altamente conservado entre as ureases, sugerindo ausência da atividade ureolítica. O padrão de expressão do gene Eu5 em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento foi determinado por RT-qPCR. Transcritos foram detectados em sementes um dia após a quebra de dormência, em raízes de plantas jovens e em embriões em desenvolvimento. As evidências sugerem que SBU-III não está envolvida na disponibilização de nitrogênio para as plantas, mas esta pode ter função de defesa. / Plants ureases catalyze urea hydrolysis and display toxic effects against pathogenic fungi and phytophagous insects. For soybean [Glycine max L. Merrill] two structural ureases have been described: the embryo-specific, encoded by Eu1 gene, and the ubiquitous, encoded by Eu4 gene. The toxic property of purified embryo-specific urease against filamentous fungi and insects was demonstrated in vitro. The ubiquitous urease is responsible for recycling all metabolically-derived urea, but there were no information about its putative defense role. Plant genetic transformation offers significant advancement in functional genomics. Therefore an efficient transformation system is required. This study aims to obtain stable transformed plants derived from somatic embryos submitted to the integrated bombardment/ Agrobacterium system, as well as identify and functionally characterize the soybean structural urease-encoding genes, specially the ubiquitous urease gene response to fungi. First, the transformation of soybean proliferating somatic embryos by a procedure that combines DNA-free particle bombardment and Agrobacterium was evaluated. Transgenic fertile plants were recovered from many transformation experiments using different plasmids. After, a study of ureases enconding genes present in the soybean genome was carried out. In the present work, Eu4 gene showed a differential expression pattern in susceptible and resistant genotypes over the course of Phakopsora pachyrhizi infection, the Asian rust causal agent. Transgenic plants aiming Eu4 overexpression were obtained. However, a single transgenic plant exhibited Eu4 overexpression, whereas the other ones showed co-suppression of endogenous and transgenes urease genes. The growth of Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii and Penicillium herguei in media containing crude protein extract from either transgenic or non-transgenic leaves was evaluated. Fugal growth was inversely proportional to ubiquitous urease amount in plant crude extracts. When infected by P. pachyrhizi uredospores, detached leaves of co-suppressed plants developed a significantly higher number of lesions, pustules and erupted pustules than leaves containing normal levels of the enzyme. These results suggested an important role of soybean ubiquitous urease in plant response against fungal infection. Furthermore, by searching the completed soybean genome sequence, a third urease-encoding locus was identified. The gene was designated Eu5 and its product, SBU-III. Phylogenetic analysis shows that SBU-III is closely related to the embryo-specific isoform. Although a high similarity in amino acid sequence was observed, a mutation in a highly conserved residue suggests absence of ureolytic activity. Expression profile of Eu5 gene in different organs and developmental stages was determined by RT-qPCR. Transcripts were detected in seeds one day after dormancy break, roots of young plants and embryos of developing seeds. Evidences suggest that SBU-III may not be involved in nitrogen availability to plants, but a defense role was proposed.

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. / Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.

Ureases são tradicionalmente conhecidas por catalisar a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em soja, três isoformas de urease foram descritas: 1) urease ubíqua, codificada pelo gene Eu4; 2) urease embrião específica, codificada pelo gene Eu1; 3) urease SBU-III, codificada por Eu5. O nitrogênio (N) é o nutriente mais limitante para o crescimento e desenvolvimento da planta. Portanto, mecanismos eficientes para capturar o N nas suas diversas formas, e realocá-lo, são necessários para otimizar o uso do nutriente pela planta. O produto N da atividade da urease - a amônia é incorporada em compostos orgânicos, principalmente, pela atividade da glutamina sintetase. Assim, a urease está envolvida na remobilização do N, bem como na assimilação do N primário. Um estudo anterior foi realizado por nossa equipe com o objetivo de superexpressar o gene Eu4 em plantas de soja. Inesperadamente, as plantas transgênicas exibiram cosupressão do transgene Eu4 e de todos os genes endógenos que codificam as isoformas de urease. Foi verificada também, uma diminuição da atividade ureolítica. Visando determinar o papel das ureases no desenvolvimento da soja, foram comparadas plantas transgênicas co-suprimidas, plantas mutantes e seus respectivos controles. O desenvolvimento das plantas foi avaliado 7, 14, 21 e 30 dias após a semeadura. As plantas co-suprimidas apresentaram um atraso no desenvolvimento durante o primeiro mês após a germinação. Um desenvolvimento mais lento foi observado para o duplo mutante eu1- a/eu4- e o mutante simples eu3-a (este gene codifica uma proteína acessória inativa). A absorção de N nas plantas transgênicas foi significativamente menor do que a das plantas não transgênicas. Entre os mutantes, eu3-a apresentou o menor e eu1-a o maior conteúdo de N. Um número significativamente menor de sementes foi obtido para as plantas transgênicas. Em conjunto estes resultados indicam que o aconteúdo da urease ou da atividade ureolítica desempenham um papel importante no desenvolvimento da planta. A soja (Glycine max) é afetada por vários estresses bióticos e abióticos, que limitam a distribuição geográfica das culturas e levam a reduções significativas de crescimento e produtividade. No Brasil, as doenças causadas por nematoides são um dos estresses bióticos mais prejudiciais para a soja. As principais espécies encontradas no Brasil são Meloidogyne spp. (formadores de galhas), Heterodera glycines (cisto), Pratylenchus brachyurus (lesões radiculares) e Rotylenchulus reniformis (reniforme). Nematoides formadores de galhas e de cisto (nematóides sedentários), os patógenos mais prejudiciais à soja, são muito difíceis de controlar. Neste estudo, foi identificado um peptídeo derivado da urease de soja (nomeado Soyuretox), que exerce efeito tóxico contra fitonematoides formadores de galhas (M. javanica). Soyuretox foi expresso em raízes de plantas compostas plantas transgênicas estáveis de soja. Raízes de plantas compostas e plantas transgênicas estáveis superexpressando Soyuretox exibiram uma redução significativa (50% e 37.5%, respectivamente) no número médio de nematoides e ovos, quando comparado com raízes não transformadas, 45 dias após a inoculação. Este é o primeiro relato de resistência a nematóides causada por um peptideo derivado de uma urease. Soyuretox pode representar uma ferramenta útil bem como uma nova e eficiente alternativa para o controle de pragas e doenças em culturas economicamente importantes. / Ureases are traditionally known for catalyzing the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In soybean, three urease isoforms have been described: 1) ubiquitous urease, encoded by the Eu4 gene; 2) embryo-specific urease, encoded by Eu1gene; 3) SBU-III urease, encoded by Eu5. Nitrogen (N) is the most limiting nutrient for plant growth and development. Therefore efficient mechanisms both to take up N in its various forms, and to reallocate it, are necessary for optimal N use efficiency. The N product of urease activity- ammonia- is incorporated into organic compounds mainly by glutamine synthase activity. Thus, urease is involved in N remobilization, as well as in primary N assimilation. A previous study was performed by our team aiming to overexpress Eu4 gene in soybean plants. Unexpectedly, the transgenic plants exhibited endogenous (for all three genes) and introduced Eu4 transgene co-suppression and decreased ureolytic activity. Here, we sought to determine urease roles in soybean development by silencing all urease isoforms. Analyses were performed using transgenic co-suppressed and mutant plants. Plant development was evaluated 7, 14, 21 and 30 days after sowing. The cosuppressed plants presented a developmental delay during the first month after germination when compared with control. A slower development was observed for the double eu1-a/eu4-a mutant and the eu3-a (this gene codify an inactive accessory protein) single mutant. The N uptake in transgenic plants was significantly lower than that captured by non-transgenic plants. Among mutants, eu3-a presented the lowest and eu1- a the highest N content. A significantly lower number of seeds was obtained for transgenic plants. Altogether, these results indicate that the urease content and/or ureolytic activity play an important role in plant development. Soybeans (Glycine max) are affected by several abiotic and biotic stresses that limit the geographical distribution of cultures and lead to significant reductions in growth and productivity. In Brazil, the diseases caused by nematodes are one of the most damaging biotic stresses for soybeans.. The main species found in Brazil are Meloidogyne spp. (root-knot), Heterodera glycines (cyst), Pratylenchus brachyurus (root lesion) and Rotylenchulus reniformis (reniform). Root-knot and cyst nematodes (sedentary nematodes), the most damaging soybean pathogens, are very difficult to control. In this study, we identified a soybean urease-derived peptide (named Soyuretox) that exerts toxic effects against the root-knot phytonematode (M. javanica). Soyuretox was expressed in soybean roots of composite plants and complete stable transgenic plants. Roots of composite plants and stable transgenic plants overexpressing Soyuretox exhibited a significant reduction (50% and 37.5%, respectively) in the average number of nematodes and eggs when compared with non-transformed roots, 45 days after inoculation. This is the first report of nematode resistance caused by a urease-derived peptide. Soyuretox may represent a useful tool as a new and efficient alternative to control pests and diseases in economically important crops.