LSD (Lesion Simulating Disease) é uma família de proteínas dedo de zinco descritas como importantes na resposta hipersensitiva (HR – hipersensitive response), limitando a área da lesão e a morte celular programada (PCD – programmed cell death), regulando negativamente as espécies reativas de oxigênio (ROS – reative oxygen species) geradas em condições de estresse biótico e abiótico. Até o presente momento, a maioria dos estudos incluindo genes LSD foi realizada em Arabidopsis thaliana, havendo poucos relatos em outros organismos. Além disto, a identificação completa dos genes LSD não foi ainda descrita, o que dificulta a reconstrução da história evolutiva desta família. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar sequências de genes LSD em diferentes genomas, realizar a análise filogenética dessa família e avaliar o perfil de expressão de genes GmLSD em diferentes órgãos de soja e sob condições de estresse. Nossos resultados permitiram a identificação de 117 possíveis genes LSD exclusivamente em Viridiplantae. Os organismos basais Volvox carteri e Chamydomonas reinhardtii apresentaram uma cópia de genes LSD. Além disso, a expansão do número de cópias gênicas parece ter ocorrido no clado Embriófita. As sequências identificadas foram analisadas quanto à presença do domínio dedo de zinco característico, sendo encontradas proteínas com uma, duas e três cópias de domínios LSD. Foi observada uma ampla conservação das três sequências de domínios LSD, indicando a manutenção destas ao longo da evolução da família. A análise filogenética mostrou que a arquitetura de proteínas com três domínios LSD representa a condição mais ancestral, sendo presente desde os organismos basais. As proteínas com dois domínios LSD foram identificadas somente no clado Embriófita e proteínas que possuem um domínio LSD foram altamente representadas no clado gramíneas. Os genes de monocotiledôneas e dicotiledôneas não formaram grupos separados, indicando que a expansão da família LSD foi anterior à diversificação entre esses clados. A análise de expressão dos genes GmLSD em diferentes órgãos de soja mostrou que estes tem expressão variável dependente do órgão. Foi avaliada a expressão dos genes GmLSD em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da ferrugem asiática da soja (ASR – Asian Soybean Rust). A abordagem de RNA-seq (no qual foi analisada somente a região da lesão) permitiu a identificação de GmLSD1, GmLSD3 e GmLSD4 nos genótipos suscetível (EMBRAPA48) e resistente (PI561356), enquanto que GmLSD6 e GmLSD8 foram detectados somente no genótipo resistente PI561356. Por outro lado, o experimento de RT-qPCR (em que foram analisadas folhas de soja infectadas por P. pachyrhizi) revelou que todos os genes GmLSD foram responsivos a inoculação do fungo, embora GmLSD1, GmLSD4 e GmLSD8 tenham sido modulados exclusivamente no genótipo resistente PI561356. A análise do perfil de expressão dos genes GmLSD em raízes e folhas de plantas de soja em condições de déficit hídrico mostrou que a maioria dos genes GmLSD foi modulada em resposta ao estresse. No entanto os genes GmLSD5 (folhas), GmLSD1 e GmLSD2 (raízes) foram diferencialmente expressos somente na cultivar tolerante EMBRAPA48. Esses resultados sugerem um possível envolvimento dos genes GmLSD na PCD causada por estresses bióticos e abióticos, assim como observado em Arabidopsis thaliana. Análises futuras com os genes GmLSD são particularmente interessantes para avaliar o potencial biotecnológico destes genes, sobretudo visando o desenvolvimento de plantas de soja mais tolerantes/resistentes à diferentes condições de estresse. / LSD (Lesion Simulating Disease) is a family of zinc finger proteins described as important in the hypersensitive response (HR), limiting the area of injury and the programmed cell death (PCD), negatively regulating the Reactive oxygen species (ROS) generated under biotic and abiotic stress conditions. To date, most studies including LSD genes were performed in Arabidopsis thaliana, with few reports in other organisms. Moreover, the complete identification of LSD genes has not yet been described, which difficult the reconstruction of the evolutionary history of this family. The goals of this study were to identify LSD gene sequences in different genomes, perform a phylogenetic analysis of this family and evaluate the expression profile of GmLSD genes in different soybean organs and under stress conditions. Our results allowed the identification of 117 putative LSD genes exclusively in Viridiplantae. Volvox carteri and Chamydomonas reinhardtii basal organisms showed one copy of LSD gene. Furthermore, the expansion of the number of genes copies seems to be occurred in Embryophyte clad. The identified sequences were analyzed for the presence of the characteristic zinc finger domain, being found proteins with one, two and three copies of LSD domains. We observed a wide conservation of the three sequences of LSD domains, indicating their maintenance throughout the evolution of the family. Phylogenetic analysis showed that the architecture of proteins with three LSD domains is the most ancestral condition, being present since the basal organisms. Proteins with two LSD domains have been identified only in Embryophyte clad and proteins having one LSD domain were highly represented in the Grass clad. The monocots and dicots genes not formed separate groups, indicating that the expansion of the LSD family was prior to diversification between these clades. The expression analysis of GmLSD genes in different soybean organs showed that these having an organ dependent variable expression. We evaluated the expression of GmLSD genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the Asian Soybean Rust (ASR) causal agent. The RNA-seq approach (wherein only the lesion site was analyzed) allowed the identification of GmLSD1, and GmLSD3 GmLSD4 in both susceptible (EMBRAPA48) and resistant (PI561356) genotypes, while GmLSD6 and GmLSD8 were detected only in PI561356 resistant genotype. Moreover, the RT-qPCR experiment (in which soybean leaves infected by P. pachyrhizi were analyzed) showed that all GmLSD were responsive to fungus inoculation, although GmLSD1, GmLSD4 and GmLSD8 were differentially expressed only in PI561356 resistant genotype. The analysis of GmLSD genes expression profile in roots and leaves of soybean plants under water deficit conditions showed that the majority GmLSD genes were modulated in response to stress. However, GmLSD5 (leaves), and GmLSD1 GmLSD2 (roots) genes were differentially expressed only in EMBRAPA48 tolerant cultivar. These results suggest a putative involvement of GmLSD genes in the PCD caused by biotic and abiotic stresses, as observed in Arabidopsis thaliana. Further analyzes with GmLSD genes are particularly interesting to evaluate the biotechnological potential of these genes, especially for the development of soybean plants more tolerant / resistant to various stress conditions.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

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O aumento no uso de agroquímicos decorrentes do plantio de transgênicos é exemplo de prática que coloca em cheque o futuro dos solos e biodiversidade. Dentre as espécies de ácaros fitófagos que causam danos à cultura destacam-se Mononychellus planki McGregor e Tetranychus ludeni Zacher. O Caliothrips phaseoli Hood (Thysanoptera: Thripidae) também pode atingir nível de praga nestas plantações. Estes ácaros e inseto se alimentam das folhas da soja causando clorose e perda na produção de grãos. Neoseiulus californicus McGregor (Acari: Phytoseiidae) é utilizado no controle de populações de ácaros praga em culturas agrícolas, porém não são conhecidos seus parâmetros biológicos quando alimentados com M. planki e C. phaseoli. O objetivo deste trabalho foi conhecer os parâmetros biológicos de N. californicus quando alimentado de M. planki, T. ludeni e C. phaseoli sobre folhas de soja nas condições de laboratório e avaliar a influência da transgenia sobre o ciclo biológico de T. ludeni. Os ácaros foram coletados em plantações de soja da cidade de Lajeado - RS. No estudo com o predador foram utilizados ovos individualizados em arenas com M. planki, T. ludeni e C. phaseoli como alimento. Foram realizados estudos observando o desenvolvimento e reprodução de T. ludeni sobre soja convencional Fundacef 44, RR Nideira 5909, resistente ao glifosato e BT Rota 54, resistente ao glifosato e ao ataque de lagartas. A viabilidade total de ovo-adulto para o predador se alimentando de T. ludeni, M. planki e C. phaseoli foram 96.66%, 76.67% e 53.33%, respectivamente. O predador não completou seu desenvolvimento sendo alimentado com C. phaseoli, pois não houve oviposição. A capacidade de aumentar em número (rm) foi de 14.46 fêmeas/fêmeas/dias com T. ludeni e 13.39 com M. Planki. A transgenia na soja não demonstrou interferir na biologia de T. ludeni. Esta espécie pode estar em fase de adaptação à cultura, pois teve parâmetros de reprodução menores que o esperado. Os resultados poderão subsidiar trabalhos de controle biológico na soja e outras culturas que apresentarem as mesmas espécies herbívoras em nível de praga. Também contribuir para as discussões acerca do uso de transgênicos. / The genetically modified cultivars change management culture of soybean, Glycine max L. Merri: Fabaceae. The dramatic increase in the use of agrochemicals arising from the planting of GM crops is practical example that puts in check the future of soil and agricultural biodiversity. Among the species of phytophagous mites that cause damage to culture, include Mononychellus planki McGregor, Tetranychus ludeni Zacher and Tetranychus urticae Koch. Caliothrips phaseoli Hood (Thysanoptera: Thripidae) is a species of insect that can also reach plague level in these plantations. The species lay their eggs on the leaves of soybeans and feed her causing chlorosis and loss in grain production. Neoseiulus californicus McGregor is already used in the control of pest mites in different cultures, but are not known their biological parameters feeding on M. planki and C. phaseoli. The aim of this study was to evaluate the biological parameters of N. californicus feeding on M. planki, T. ludeni and C. phaseoli in soybean leaves and the influence of transgenic on an herbivore, T. ludeni. The mites were collected in soy plantations in the city of Lajeado-RS. In the study with the predator, individualized eggs were used in arenas with M. planki, T. ludeni and C. phaseoli as food. Noted the development and reproduction of t. ludeni in different soybean cultivars, these being, conventional soybeans Fundacef 44, and of two types of genetically modified soybeans, RR Nideira 5909 glyphosate resistance e BT Rota 54 glyphosate resistant and the attack of caterpillar. The total egg viability-adult for the predator feeding on T. ludeni, M. planki and C. phaseoli was 96.66% respectively, 76.67% and 53.33%. The predator has not completed its development being fed with C. phaseoli, do you ovipositou. The ability to increase in number (rm) was 14.46 with T. ludeni and 13.39 female/female/day with M. planki. The varieties in soybeans has not shown to interfere with the biology of T. ludeni. Is species may be in the process of adaptation to the culture, as it had playback parameters smaller than expected. The results may subsidize works of biological control in soybeans and other crops which submit same herbivore species pest level. Also, contribute to discussions about the use of transgenic crops.

As urease de plantas catalisam a hidrólise da ureia e apresentam efeitos tóxicos a fungos patogênicos e insetos fitófagos. Em soja [Glycine max L. Merrill] foram descritas duas ureases estruturais: a embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, e a ubíqua, codificada pelo gene Eu4. Sabe-se que a urease embrião-específica purificada apresenta efeito inibitório sobre o crescimento in vitro de fungos filamentosos e desenvolvimento de insetos. A urease ubíqua é responsável pela reciclagem de toda a ureia proveniente do metabolismo, mas não há informações sobre seu envolvimento no sistema de defesa das plantas. A transformação genética é uma ferramenta importante em estudos de genômica funcional e, portanto, a disponibilidade de sistemas eficientes é um pré-requisito essencial. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas estavelmente transformadas a partir de embriões somáticos de soja submetidos ao sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium, bem como a identificação e caracterização funcional dos genes que codificam as ureases estruturais de soja, especialmente a urease ubíqua em relação aos processos de resposta a fungos patogênicos. Inicialmente, testamos a eficiência de transformação de embriões somáticos secundários por um método que combina o bombardeamento de partículas livres de DNA com o sistema Agrobacterium. Plantas transgênicas férteis foram regeneradas de vários experimentos independentes de transformação utilizando diferentes plasmídios. Posteriormente, foi realizada a caracterização dos genes que codificam ureases presentes no genoma da soja. O gene Eu4 apresentou um padrão de expressão diferencial para genótipos suscetível e resistente ao longo do período de infecção por Phakopsora pachyrhizi, o agente etiológico da ferrugem asiática. Plantas transgênicas foram geradas visando a superexpressão de Eu4. Contudo, apenas uma planta apresentou níveis aumentados de expressão desse gene, enquanto que as demais plantas apresentaram o fenômeno de co-supressão dos genes endógeno e transgene. Avaliou-se o crescimento vegetativo dos fungos Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii e Penicillium herguei em meio de cultura contendo extrato protéico bruto de plantas transgênicas expressando maiores e menores níveis de urease e de plantas não-transgênicas. O crescimento dos fungos foi inversamente proporcional a quantidade da urease presente no extrato protéico das plantas. Quando infectadas por uredósporos de P. pachyrhizi, folhas destacadas das plantas co-suprimidas desenvolveram um número significativamente maior de lesões, pústulas e pústulas abetas do que folhas com níveis normais da enzima. Em conjunto estes resultados indicam um 15 importante envolvimento da urease ubíqua da soja na resposta à infecção da planta por fungos patogênicos. Além disso, um terceiro gene que codifica urease foi encontrado no banco de dados com a sequência completa do genoma da soja. O gene foi denominado Eu5 e seu produto SBU-III. A análise filogenética mostra que SBU-III está fortemente relacionada à isoforma embrião-específica. Apesar da grande similaridade na seqüência primária da proteína, SBU-III apresenta uma mutação em um aminoácido altamente conservado entre as ureases, sugerindo ausência da atividade ureolítica. O padrão de expressão do gene Eu5 em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento foi determinado por RT-qPCR. Transcritos foram detectados em sementes um dia após a quebra de dormência, em raízes de plantas jovens e em embriões em desenvolvimento. As evidências sugerem que SBU-III não está envolvida na disponibilização de nitrogênio para as plantas, mas esta pode ter função de defesa. / Plants ureases catalyze urea hydrolysis and display toxic effects against pathogenic fungi and phytophagous insects. For soybean [Glycine max L. Merrill] two structural ureases have been described: the embryo-specific, encoded by Eu1 gene, and the ubiquitous, encoded by Eu4 gene. The toxic property of purified embryo-specific urease against filamentous fungi and insects was demonstrated in vitro. The ubiquitous urease is responsible for recycling all metabolically-derived urea, but there were no information about its putative defense role. Plant genetic transformation offers significant advancement in functional genomics. Therefore an efficient transformation system is required. This study aims to obtain stable transformed plants derived from somatic embryos submitted to the integrated bombardment/ Agrobacterium system, as well as identify and functionally characterize the soybean structural urease-encoding genes, specially the ubiquitous urease gene response to fungi. First, the transformation of soybean proliferating somatic embryos by a procedure that combines DNA-free particle bombardment and Agrobacterium was evaluated. Transgenic fertile plants were recovered from many transformation experiments using different plasmids. After, a study of ureases enconding genes present in the soybean genome was carried out. In the present work, Eu4 gene showed a differential expression pattern in susceptible and resistant genotypes over the course of Phakopsora pachyrhizi infection, the Asian rust causal agent. Transgenic plants aiming Eu4 overexpression were obtained. However, a single transgenic plant exhibited Eu4 overexpression, whereas the other ones showed co-suppression of endogenous and transgenes urease genes. The growth of Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii and Penicillium herguei in media containing crude protein extract from either transgenic or non-transgenic leaves was evaluated. Fugal growth was inversely proportional to ubiquitous urease amount in plant crude extracts. When infected by P. pachyrhizi uredospores, detached leaves of co-suppressed plants developed a significantly higher number of lesions, pustules and erupted pustules than leaves containing normal levels of the enzyme. These results suggested an important role of soybean ubiquitous urease in plant response against fungal infection. Furthermore, by searching the completed soybean genome sequence, a third urease-encoding locus was identified. The gene was designated Eu5 and its product, SBU-III. Phylogenetic analysis shows that SBU-III is closely related to the embryo-specific isoform. Although a high similarity in amino acid sequence was observed, a mutation in a highly conserved residue suggests absence of ureolytic activity. Expression profile of Eu5 gene in different organs and developmental stages was determined by RT-qPCR. Transcripts were detected in seeds one day after dormancy break, roots of young plants and embryos of developing seeds. Evidences suggest that SBU-III may not be involved in nitrogen availability to plants, but a defense role was proposed.

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. / Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.

Ureases são tradicionalmente conhecidas por catalisar a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Em soja, três isoformas de urease foram descritas: 1) urease ubíqua, codificada pelo gene Eu4; 2) urease embrião específica, codificada pelo gene Eu1; 3) urease SBU-III, codificada por Eu5. O nitrogênio (N) é o nutriente mais limitante para o crescimento e desenvolvimento da planta. Portanto, mecanismos eficientes para capturar o N nas suas diversas formas, e realocá-lo, são necessários para otimizar o uso do nutriente pela planta. O produto N da atividade da urease - a amônia é incorporada em compostos orgânicos, principalmente, pela atividade da glutamina sintetase. Assim, a urease está envolvida na remobilização do N, bem como na assimilação do N primário. Um estudo anterior foi realizado por nossa equipe com o objetivo de superexpressar o gene Eu4 em plantas de soja. Inesperadamente, as plantas transgênicas exibiram cosupressão do transgene Eu4 e de todos os genes endógenos que codificam as isoformas de urease. Foi verificada também, uma diminuição da atividade ureolítica. Visando determinar o papel das ureases no desenvolvimento da soja, foram comparadas plantas transgênicas co-suprimidas, plantas mutantes e seus respectivos controles. O desenvolvimento das plantas foi avaliado 7, 14, 21 e 30 dias após a semeadura. As plantas co-suprimidas apresentaram um atraso no desenvolvimento durante o primeiro mês após a germinação. Um desenvolvimento mais lento foi observado para o duplo mutante eu1- a/eu4- e o mutante simples eu3-a (este gene codifica uma proteína acessória inativa). A absorção de N nas plantas transgênicas foi significativamente menor do que a das plantas não transgênicas. Entre os mutantes, eu3-a apresentou o menor e eu1-a o maior conteúdo de N. Um número significativamente menor de sementes foi obtido para as plantas transgênicas. Em conjunto estes resultados indicam que o aconteúdo da urease ou da atividade ureolítica desempenham um papel importante no desenvolvimento da planta. A soja (Glycine max) é afetada por vários estresses bióticos e abióticos, que limitam a distribuição geográfica das culturas e levam a reduções significativas de crescimento e produtividade. No Brasil, as doenças causadas por nematoides são um dos estresses bióticos mais prejudiciais para a soja. As principais espécies encontradas no Brasil são Meloidogyne spp. (formadores de galhas), Heterodera glycines (cisto), Pratylenchus brachyurus (lesões radiculares) e Rotylenchulus reniformis (reniforme). Nematoides formadores de galhas e de cisto (nematóides sedentários), os patógenos mais prejudiciais à soja, são muito difíceis de controlar. Neste estudo, foi identificado um peptídeo derivado da urease de soja (nomeado Soyuretox), que exerce efeito tóxico contra fitonematoides formadores de galhas (M. javanica). Soyuretox foi expresso em raízes de plantas compostas plantas transgênicas estáveis de soja. Raízes de plantas compostas e plantas transgênicas estáveis superexpressando Soyuretox exibiram uma redução significativa (50% e 37.5%, respectivamente) no número médio de nematoides e ovos, quando comparado com raízes não transformadas, 45 dias após a inoculação. Este é o primeiro relato de resistência a nematóides causada por um peptideo derivado de uma urease. Soyuretox pode representar uma ferramenta útil bem como uma nova e eficiente alternativa para o controle de pragas e doenças em culturas economicamente importantes. / Ureases are traditionally known for catalyzing the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In soybean, three urease isoforms have been described: 1) ubiquitous urease, encoded by the Eu4 gene; 2) embryo-specific urease, encoded by Eu1gene; 3) SBU-III urease, encoded by Eu5. Nitrogen (N) is the most limiting nutrient for plant growth and development. Therefore efficient mechanisms both to take up N in its various forms, and to reallocate it, are necessary for optimal N use efficiency. The N product of urease activity- ammonia- is incorporated into organic compounds mainly by glutamine synthase activity. Thus, urease is involved in N remobilization, as well as in primary N assimilation. A previous study was performed by our team aiming to overexpress Eu4 gene in soybean plants. Unexpectedly, the transgenic plants exhibited endogenous (for all three genes) and introduced Eu4 transgene co-suppression and decreased ureolytic activity. Here, we sought to determine urease roles in soybean development by silencing all urease isoforms. Analyses were performed using transgenic co-suppressed and mutant plants. Plant development was evaluated 7, 14, 21 and 30 days after sowing. The cosuppressed plants presented a developmental delay during the first month after germination when compared with control. A slower development was observed for the double eu1-a/eu4-a mutant and the eu3-a (this gene codify an inactive accessory protein) single mutant. The N uptake in transgenic plants was significantly lower than that captured by non-transgenic plants. Among mutants, eu3-a presented the lowest and eu1- a the highest N content. A significantly lower number of seeds was obtained for transgenic plants. Altogether, these results indicate that the urease content and/or ureolytic activity play an important role in plant development. Soybeans (Glycine max) are affected by several abiotic and biotic stresses that limit the geographical distribution of cultures and lead to significant reductions in growth and productivity. In Brazil, the diseases caused by nematodes are one of the most damaging biotic stresses for soybeans.. The main species found in Brazil are Meloidogyne spp. (root-knot), Heterodera glycines (cyst), Pratylenchus brachyurus (root lesion) and Rotylenchulus reniformis (reniform). Root-knot and cyst nematodes (sedentary nematodes), the most damaging soybean pathogens, are very difficult to control. In this study, we identified a soybean urease-derived peptide (named Soyuretox) that exerts toxic effects against the root-knot phytonematode (M. javanica). Soyuretox was expressed in soybean roots of composite plants and complete stable transgenic plants. Roots of composite plants and stable transgenic plants overexpressing Soyuretox exhibited a significant reduction (50% and 37.5%, respectively) in the average number of nematodes and eggs when compared with non-transformed roots, 45 days after inoculation. This is the first report of nematode resistance caused by a urease-derived peptide. Soyuretox may represent a useful tool as a new and efficient alternative to control pests and diseases in economically important crops.

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Copper-treated soybean ( Glycine max ) seedling shows significant inhibition in soybean root growth, and enhancement in POD activity. Cu is an efficient catalyst in the formation of several reactive oxygen species and free radical. The increase in POD activity induced by Cu might remove excess hydrogen peroxide serving a detoxifying role during Cu-treatment. The increase of cationic ( pI 8.9, pI 8.3 and pI 7.7 ) PODs and anionic ( pI 6.5, pI 5.6 and pI 4.4 ) PODs activities is accompanied by a rise of lignin contents in Cu-treated tissues. We suggest that the increase in cationic ( pI 8.9, pI 8.3 and pI 7.7 ) and anionic ( pI 6.5, pI 5.6 and pI 4.4 ) PODs induced by Cu is responsible for lignin synthesis in soybean roots during Cu treatment.