Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-14Bitstream added on 2014-06-13T19:05:41Z : No. of bitstreams: 1 aquino_ss_dr_ilha.pdf: 400224 bytes, checksum: ab22847d16ad3f9859cbd8f634e00915 (MD5) / A atividade dos microrganismos promove a ocorrência de inúmeros processos no solo, auxiliando no desenvolvimento das plantas e na qualidade do solo. O objetivo deste trabalho foi verificar a atividade microbiana do solo (carbono da biomassa microbiana e do CO2 liberado e micorrização) do solo e a produtividade de massa no sistema de integração lavourapecuária, em diferentes sistemas de manejo e seqüências de cultura. O experimento foi conduzido em dois anos agrícolas consecutivos, 2004/05 e 2005/06, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE) da UNESP - Ilha Solteira, município de Selvíria-MS, em um LATOSSOLO VERMELHO distrófico. No primeiro ano, a área foi dessecada em novembro para a semeadura direta das culturas da soja e do milho. A colheita foi realizada em março de 2005 e a área permaneceu em pousio para a regeneração da pastagem e, posterior, pastejo. O segundo ano agrícola, o experimento teve início em dezembro, com a dessecação da área e semeadura das culturas em plantio direto, sendo a colheita realizada em abril de 2006. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados em esquema de parcelas subdividas (3 x 2 x 2). Os tratamentos das parcelas foram: sem mobilização do solo; cultivo mínimo e preparo convencional e os tratamentos secundários foram quatro seqüências de culturas: sucessão (soja/soja); rotação (soja/milho); sucessão (milho/milho) e rotação (milho/soja). Conclui-se que as características químicas do solo apresentaram pequena redução no decorrer dos dois anos agrícolas sendo que o fósforo apresentou aumento no segundo ano para a cultura de soja em rotação; as variáveis microbiológicas e a produtividade de massa apresentaram valores ligeiramente superiores no segundo ano de plantio de soja em solo sem mobilização; a colonização micorrízica foi maior em... / The microorganisms activity promotes the occurrence of numberless processes in the soil, improving the plants development and soil quality. The objective of this study was to evaluate the microbial activity in the soil (carbon from the microbial biomass, from the evoluted CO2 and mycorrhization) and yield of crop-cattle raising integration, under different farming systems and crop sequences of culture. The experiment was carried out in two consecutive years, 2004/05 and 2005/06, at the farm Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão – (FEPE), UNESP - Ilha Solteira, in Selvíria - MS, in a Typic Hapludox. In the first year, the area was desiccated in November for the no-tillage sowing of soybean and corn. The harvest was in March 2005 and the area was kept under fallow land for the pasture recovery and grazing afterwards. In the second agricultural year, the experiment was established in December; the area was desiccated, the no-tillage sowing was performed and the harvest was in April 2006. The blocks randomized experimental design was used in a split-plot scheme (3 x 2 x 2). The treatments were: no-tillage; minimum-tillage and conventional-tillage and the secondary treatments were four crop sequences: succession (soybean/soybean); rotation (soybean/corn); succession (corn/corn) and rotation (corn/soybean). The conclusions were: the soil chemical characteristics values became slightly lower over the two agricultural years and the phosphorus levels increased in the second year for the soybean crop under rotation; the microbiological variables and the yield showed slightly higher values in the second year of the soybean crop in no-tillage; the mycorrhizal colonization was higher for crops under rotation and the microorganisms activity have indicated improvement of the crop-cattle raising integration system.

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. / Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Os agrupamentos ferro-enxofre [Fe-S] são grupos prostéticos requeridos em processos essenciais como respiração, fotossíntese, reações metabólicas, sinalização e regulação gênica. Em plantas, a biossíntese das proteínas Fe-S é compartimentalizada e adaptada às necessidades de uma célula eucariótica fotossintetizante. Diversos fatores ambientais afetam o desenvolvimento das plantas e limitam sua produtividade. Dentre esses organismos afetados encontram-se a soja e o arroz, culturas de grande importância comercial no Brasil e no mundo. Foram analisados, pelo método de RT-qPCR, os perfis de expressão dos genes que codificam a enzima cisteína desulfurase NFS1 e NFS2 de ambas as espécies, participantes da rota de formação dos cofatores [Fe-S] mitocondriais e plastídicos, respectivamente. Para Oryza sativa ssp. indica e ssp. japonica, as análises permitiram mostrar uma distribuição diferencial dos transcritos entre órgãos. OsNFS1 apresenta maiores níveis de transcritos tanto em raiz quanto em folha, enquanto OsNFS2 apresentou maiores níveis de transcritos em folha do que em raiz. A resposta destes genes ao frio (24 h a 4ºC) difere entre as subespécies. Na ssp. japonica, os dois genes são induzidos em ambos os tecidos. Para a ssp. indica há redução dos níveis de mRNA de NFS1 e aumento de NFS2 em folhas, e não há respostas em raízes. Nos tratamentos com alumínio na ssp. japonica, há redução dos níveis de mRNA de ambos os genes nas raízes, enquanto não há resposta na parte aérea. As análises em Glycine max, organismo que apresenta duplicação dos genes, permitiram demonstrar que a modulação destes é realizada de maneira diferencial. Em raiz, o tratamento com frio (5 h, 10 h e 24 h a 4ºC) promoveu a redução dos níveis de mRNA de uma das cópias de NFS1 e a indução da outra, enquanto os genes codificadores de NFS2 foram reprimidos. Em folha, o mesmo tratamento induziu uma das cópias de NFS1 e uma de NFS2, enquanto que as outras oscilaram em nível bem inferior de expressão. A exposição de G. max ao ácido salicílico induz a modulação dos genes mitocondriais, aumentando os níveis de mRNA em raízes e reprimindo-os em folhas. As análises dos cis-elementos permitiram mostrar a correlação destes com os dados encontrados em RT-qPCR. Desta maneira, tanto em arroz quanto em soja, a cisteína desulfurase parece ser modulada por diferentes estresses, possuindo padrões diferenciados conforme o órgão e o gene. / Iron-sulfur [Fe-S] clusters are prosthetic groups required to maintain life processes including respiration, photosynthesis, metabolic reactions, sensing, signaling and, gene regulation. In plants the biogenesis of Fe-S protein is compartmentalized and adapted to specific needs of the eukaryotic and photosynthetic cell. Many environmental factors affect plant development and limit the productivity and the geographical distribution. Among those affected organisms are soybean and rice, crops with huge economic importance worldwide. Here we analyze the expression profile of cysteine desulfurase genes NFS1 and NFS2, involved in the biogenesis of [Fe-S] clusters in mitochondria and plastid, respectively, from both species, by RT-qPCR. Analysis of Oryza sativa ssp. indica and ssp. japonica showed a differential expression between organs, OsNFS1 has a higher expression in roots and leaves than OsNFS2, and OsNFS2 is more expressed in leaves than in roots. Rice subspecies exhibited different responsiveness to cold. The japonica ssp. increased transcript level from both genes in both organs, while ssp. indica decreased OsNFS1 and increased OsNFS2 expressions in leaves, and did not change the expression pattern in roots. Rice ssp. japonica showed a decrease in OsNFS1 and OsNFS2 transcript levels in root, while leaves did not change, under aluminum stress. Soybean analysis, which presents duplication of both genes, demonstrated particular transcript levels considering organ and stress response. GmNFS1 had a high expression in roots, while GmNFS2 did not differ between organs. Cold-treated plants (0, 5, 10 and 24h at 4°C) showed a decrease in cysteine desulfurases transcript level in roots, and an increase in leaves. Plants treated with salicylic acid increased GmNFS1 transcript level in roots, and decreased in leaves. Besides that, an analysis of promoter regions showed the presence of different cis-elements among cysteine desulfurase genes, corroborating with differential expression of each loci. Our results suggest that cysteine desulfurases, in rice and soybean, may be involved in stress response, being modulated by different stimuli according to organ and gene.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-20T16:38:13Z No. of bitstreams: 1 2015_ThiagoBatistaMoreira.pdf: 1767532 bytes, checksum: 510474b46282622a269c16979be52398 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-03-09T13:48:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ThiagoBatistaMoreira.pdf: 1767532 bytes, checksum: 510474b46282622a269c16979be52398 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-09T13:48:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ThiagoBatistaMoreira.pdf: 1767532 bytes, checksum: 510474b46282622a269c16979be52398 (MD5) / Durante o crescimento heterotrófico, as plântulas dependem completamente das reservas armazenadas na semente. Tais reservas proporcionam o carbono e o nitrogênio necessário para a produção de biomassa, bem como poder redutor e ATP necessários para a manutenção e crescimento. Embora, conhecimentos detalhados dos processos metabólicos responsáveis pela mobilização das reservas durante esse momento do desenvolvimento sejam evidentes, a utilização das reservas e a contribuição de cada uma para o balanço de carbono, de nitrogênio e de energia em plântulas permanecem ainda obscuras. Na tentativa de elucidar essas questões utilizou-se da análise de balanço de fluxos (ABF) para estudar o metabolismo e a mobilização de reservas durante a germinação e o crescimento inicial em plântulas de soja. Para tanto, primeiramente realizou-se uma caracterização extensiva da biomassa das plântulas durante a germinação e crescimento inicial com o objetivo de determinar as restrições para o ABF. Um modelo metabólico baseado no genoma de Arabdopsis thaliana foi adaptado possibilitando a degradação de reservas não contempladas no modelo original, além de possibilitar o transporte de metabólitos entre os cotilédones e o eixo. As simulações do metabolismo levou em conta a alta eficiência do metabolismo aplicando uma função objetivo da minimização de fluxos de todas as reações ativadas. Os resultados das simulações mostraram que a degradação dos açúcares solúveis e o aumento da concentração de aminoácidos livres ocorreram durante a germinação. Nos períodos subsequentes a germinação, houve a degradação de ácidos graxos pela da β-oxidação e ativação do ciclo do glioxalato, e um transporte significante de metabólitos entre os cotilédones e o eixo. Os resultados obtidos demonstraram que diferentes tipos de reservas são utilizados de forma coordenada para atender as necessidades do crescimento das plântulas e auxiliam a prever modificações no metabolismo e na composição de reservas das sementes ou a atividade enzimática no metabolismo em diferentes condições as quais as plântulas podem ser submetidas durante a germinação e o crescimento inicial. / During heterotrophic growth seedlings depend entirely upon the reserves previously stored within the seed. Such reserves provide the carbon and nitrogen necessary for the production of new biomass, as well as the reducing power and ATP necessary for cell maintenance and growth. Whilst we have detailed knowledge of the metabolic processes responsible for mobilization of seed reserves, how the degradation of different reserves is coordinated and how each type of reserve contributes to the carbon, nitrogen and energy balance of the seedling remains unclear. To address these questions we used flux balance analysis (FBA) to study metabolism and reserve mobilization during initial growth of soybean seedlings. This firstly involved the extensive characterization of seedling biomass during initial growth with the aim of determining constraints for FBA. A pre-existing genome scale stoichiometric metabolic model was then adapted to allow the analysis of reserve degradation and the transport of metabolites between cotyledons and the growing seedling. FBA indicated extensive shifts in primary metabolism during seedling growth. The first day of post-germinative growth was characterized by degradation of raffinose series sugars and amino acids released from protein. Subsequent days saw the activation of the glyoxylate cycle and significant transport of metabolites between cotyledons and the growing seedling. These data help reveal how different types of reserves are used in a coordinated fashion to meet the needs of the growing seedling and may help to predict the effects of manipulation of seed reserve composition or enzyme activity on metabolism and growth.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-31Bitstream added on 2014-06-13T19:57:56Z : No. of bitstreams: 1 pereira_cf_me_jabo.pdf: 251548 bytes, checksum: 5f49e2adf0e6888d7d09cb177137b1c4 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O emprego de procedimentos adequados para avaliar o vigor de sementes é fundamental dentro do programa de controle de qualidade de sementes. O objetivo dessa pesquisa foi verificar a influência dos fungos Colletotrichum dematium var. truncata, Phomopsis sojae e Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis na qualidade fisiológica de sementes de soja determinada pelo índice de velocidade de emergência (IVE), germinação (TG), teste de frio (TF) e condutividade elétrica (CE). A pesquisa foi realizada em condições de laboratório com a cultivar Embrapa 48 e em condições de campo com as cultivares Embrapa 48, Goiânia e Emgopa 313. Em condições de laboratório, as sementes foram inoculadas por sobreposição em meio de cultura BDA sem e com restrição hídrica (-1 Mpa, pelo uso de Manitol) com crescimento micelial dos fungos em estudo pelo período de 20 horas. Após a inoculação, as sementes foram secas naturalmente e realizaram-se os testes de sanidade e de vigor. Para a condutividade elétrica determinou-se também a concentração de Potássio (K), Cálcio (Ca) e Magnésio (Mg) na água de embebição das sementes. Em condições de campo as plantas das cultivares Embrapa 48, Goiânia e Emgopa 313 foram inoculadas com os fungos a partir do florescimento por três vezes durante seu desenvolvimento. A colheita foi realizada separadamente para cada cultivar e cada tratamento. Foram realizados os mesmos testes feitos com as sementes inoculadas artificialmente. Pelos resultados encontrados no experimento de inoculação em laboratório verifica-se que o método de inoculação das sementes para a cultivar Embrapa 48 com os fungos em estudos foi eficiente, encontrando-se infecção de 50% para Colletotrichum dematium var. truncata e Phomopsis sojae, e, 25% para Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis. Todos os fungos afetaram a germinação e o vigor das sementes,... / The use of adequate procedures for evaluate the vigor of seeds is fundamental into the quality control of seeds. The objective of this research was to verify the influence of the fungi Colletotrichum dematium var. truncata and Phomopsis sojae, and, for Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis in the physiological quality of soybean seeds determined for the emergence speed index, germination, cold test and electrical conductivity test. The research was carried in laboratory conditions with cultivar Embrapa 48 and in field conditions with cultivars Embrapa 48, Goiânia and Emgopa 313. In laboratory conditions, the seeds had been inoculated by contact culture medium BDA without and with hydric restriction (-1 Mpa, using Manitol) with micelial growth fungi for the period of 20 hours. After the inoculation, the seeds had been droughts and the vigor and health tests were done. For the electrical conductivity the Potassium (K), Calcium (Ca) and Magnesium (Mg) concentration was also determined, in the water of imbibibtion of the seeds. In field conditions the plants of cultivars Embrapa 48, Goiânia and Emgopa 313 had been inoculated with the fungi from the bloom for three times during the plant growth. The harvest was carried through separately each to cultivate and each fungi inoculated. The same tests of the seeds inoculated artificially had been carried through. For the results in the inoculation in laboratory it as verified that the method of inoculation of the seeds with the fungi per contact was efficient, wih infection of 50% for Colletotrichum dematium var. truncata and Phomopsis sojae, and 25%, for Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis. All the fungi had affected the germination and vigor of the seeds, for emergency speed index, the cold test and accelerated aging. The use of Manitol for hydric restriction did not modify the results of the vigor tests ...(Complete abstract, click electronic access below)