Afin d'apporter une aide pour la chimiotaxonomie du genre Stereocaulon, les acides gras totaux de dix espèces de Stéréocaulon, de quelques cyanolichens et d'une cyanobactérie ont été étudiés. Les profils obtenus des acides gras saturés, insaturés et ramifiés ont été comparés par classification hiérarchique ascendante. Les acides gras iso et antéiso pourraient permettre de distinguer le genre Stereocaulon des cyanolichens à la différence des autres classes d'acides gras. Dans un deuxième temps, l'étude phytochimique du lichen S. evolutum récolté en Bretagne a permis d'isoler et de caractériser 22 métabolites secondaires. Parmi ces composés, deux sont nouveaux. Sept molécules possèdent une structure proche de l'atranorine, depside abondant et récurrent chez les Stéréocaulons. L'atranorine ayant montré lors d'un criblage une activité intéressante sur le virus de l'hépatite C, six molécules ainsi que deux dérivés hémisynthétiques ont alors été évalués. L'atranorine et le 4-O-déméthylbarbatate de méthyle ont présenté une bonne activité anti-VHC, le premier ciblant l'étape de pénétration et le deuxième l'étape de réplication. D'autres composés, deux depsidones et cinq diphényléthers, ont été testés sur l'enzyme Protéine Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B) qui est une cible d'intétêt dans le traitement du diabète de type 2 et le cancer du sein. Les deux depsidones (acide lobarique, acide norlobarique) et un diphényléther, l'anhydro-sakisacaulon A, ont montré une inhibition de PTP1B avec des CI₅₀ similaires au témoin acide ursolique. La modélisation de cette enzyme ayant été réalisée en parallèle, les études de docking ont permis de proposer des mécanismes d'interactions mis en jeu lors de l'inhibition de PTP1B par ces métabolites secondaires lichéniques et d'envisager l'optimisation structurale de ces composés en vue d'augmenter leur activité. / Total fatty acids (FA) of ten species of Stereocaulon in addition to cyanolichens and one cyanobacterium were studied. FA profiles based on saturated-, unsaturated- and branched chain-FAs were compared using a hierarchical ascendant classification. Cyanolichens differed from the Stereocaulon genus according iso- and anteiso-FAs profiles while no differences were seen according the other FAs families. The phytochemical study of Stereocaulon evolutum, harvested in Brittany, led to isolation and identification of 22 secondary metabolites. Two were new for lichens. Among the isolated compounds, seven compounds were structurally close to atranorin, a common and abundant depside in the Stereocaulon genus. In a previous screening, atranorin exhibited a noteworthy HCV inhibition, thus six lichen compounds and two synthetic molecules were also tested. Atranorin and methyl 4-O-demethylbarbatate were the most potent without any cytotoxicity, the first being active towards the virus penetration and the latter against the virus replication. Two depsidones and five diphenylethers were also isolated and were evaluated on the Protein Tyrosine Phosphatase 1B (PTP1B), a promising target for type 2 mellitus diabetis and breast cancer. Both depsidones (lobaric acid, norlobaric acid) and the diphenylether anhydrosakisacaulon A were as potent as the positive control ursolic acid. Simultaneously, a molecular docking study between PTP1B and the seven compounds suggested the most significant interactions to conceive possible more active compounds.

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est l’un des principaux problèmes de santé publique chez les utilisateurs de drogues injectables (UDI). Actuellement, plusieurs outils sont disponibles pour réduire le fardeau du VHC dans cette population. Ceux-ci incluent des programmes de réduction des méfaits, tels que le traitement par un opioïde agoniste (TAO), pouvant réduire le risque d'infection par le VHC, ainsi que des traitements antiviraux extrêmement efficaces pour éradiquer le virus parmi les infectés. Plus récemment, il y a eu un intérêt national et international à éliminer le VHC en tant que menace pour la santé publique d'ici 2030, tout en priorisant les UDI dans les efforts de prévention et traitement. Parallèlement à ce mouvement, plus globalement, le fardeau des méfaits liés aux pratiques d’injection chez les UDI, tels que la surdose, soulignent la nécessité d’adopter une vision plus large sur leur santé. Dans l’ensemble, cette thèse vise à combler certaines lacunes dans les connaissances vis-à-vis de l’élimination du VHC chez les UDI. Premièrement, puisque le lien entre l’adéquation du dosage des TAO et le risque d’infection au VHC est peu connu, j’examine cette relation dans un échantillon d’UDI suivis dans la cohorte HEPCO à Montréal. Les résultats indiquent que le risque d'infection par le VHC ne serait pas systématiquement réduit chez toutes les personnes recevant des TAO, mais plutôt que ce risque varie en fonction de la dose prescrite et de l’adéquation du dosage telle que perçue par le patient. Ces résultats soulignent qu’un élargissement de l'accès aux TAO ne serait pas suffisant pour atteindre les objectifs de prévention et d'élimination du VHC, et que l’adéquation du dosage devrait être prise en compte dans le cadre de nos efforts de prévention. Deuxièmement, l’accès aux traitements antiviraux est faible chez les UDI, en partie à cause des préoccupations des prestataires et des décideurs politiques qui craignent une augmentation de la consommation de drogues et des comportements à risque après le traitement. En capitalisant sur deux études différentes - la cohorte IMPACT à Montréal et les essais SIMPLIFY / D3FEAT menés dans plusieurs pays - je montre que les comportements liés à la drogue diminuent ou restent stables après le traitement du VHC. Ensemble, ces deux études suggèrent que les préoccupations liées à une consommation élevée de drogue ou à une hausse des comportements à risque après le traitement ne seraient pas fondées. Ainsi, ces résultats appuient davantage une augmentation de l’accès au traitement chez les UDI. Troisièmement, allant au-delà du VHC en tant que problématique principale, en capitalisant une fois de plus sur les données collectées dans HEPCO, j’examine les associations entre trois facteurs - le TAO, le logement et le revenu - et la fréquence d’injection chez les UDI. Puisque la consommation de drogues est dynamique dans le temps, j'examine dans quelle mesure ces trois facteurs sont liés à la fréquence d’injection chez des UDI ayant des trajectoires d’injection variées. Nos résultats indiquent que la stabilité socioéconomique et le TAO seraient systématiquement liés à une fréquence d'injection inférieure chez les UDI, quelles que soit leurs trajectoires d’injection sous-jacentes. Globalement, ces résultats suggèrent qu’il y aurait des moyens de soutenir tous les UDI à atteindre de petits changements comportementaux qui pourraient réduire les risques liés aux pratiques d’injection, qu’ils soient ou non en mesure d’arrêter l’injection de drogues. En conclusion, alors que presque tous les pays ont lancé un effort mondial pour éliminer le VHC, des efforts sont nécessaires pour optimiser les programmes de réduction des méfaits bien établis afin de réduire la transmission du VHC, et d’accroître l’accès au traitement chez ceux qui sont infectés, tout en considérant les besoins et les préoccupations des communautés touchées. Cette thèse a fourni des données permettant d’éclairer (i) l’optimisation des TAO dans la prévention de la transmission du VHC, (ii) l’élargissement de l’accès au traitement du VHC et (iii) l’accès à des logements et revenus stables afin de réduire plus globalement les risques liés aux pratiques d’injection chez les UDI. Ainsi, ces résultats pourraient aider à réduire le fardeau du VHC chez les UDI et à soutenir le progrès vers l'élimination du VHC. / Infection with hepatitis C virus (HCV) is one of the main public health concerns affecting people who inject drugs (PWID). Although no effective prophylactic vaccine currently exists to prevent acquisition of HCV, a number of other tools are available to curb the HCV burden among PWID. These include harm-reduction programs, such as opioid agonist treatment (OAT), which can reduce the risk of HCV infection among those susceptible, and highly effective antiviral therapies to eradicate the virus among those who are infected. In recent years, there has been national and international interest in eliminating HCV as a public health threat by 2030, prioritising PWID in prevention and treatment efforts given that they are the population most affected. In parallel to this global effort, the high prevalence of injection-related harms among PWID that are unrelated to HCV, such as overdose, highlight a need to adopt a broader view on drug user health. Overall, this thesis is concerned with addressing some of the knowledge gaps and barriers that remain to achieving HCV elimination in PWID. First, because little is known about the importance of OAT dosage in influencing the risk of HCV acquisition, I examine this relationship in a sample of PWID followed in the Hepatitis Cohort (HEPCO) in Montreal. Findings indicate that the risk of HCV infection may not be systematically reduced for everyone receiving OAT and rather, that the risk of infection varies considerably according to the level of the prescribed OAT dosage and patient-perceived dosage adequacy. These findings suggest that simply scaling-up OAT access may not be sufficient to achieving the HCV elimination goals, and that the dosage of treatment should be considered as part of prevention efforts. Second, uptake of HCV treatment is low among PWID, partly due to concerns among providers and policymakers that drug use and injection risk behaviours may increase following treatment, thereby negating the benefits of therapy. Capitalising on two different studies - the IMPACT Cohort in Montreal and the SIMPLIFY/D3FEAT trials conducted in several countries - I illustrate that drug-related behaviours decrease or remain stable following HCV treatment. Together, these two studies suggest that concerns of escalating drug use or risk behaviours following HCV treatment are unfounded, further supporting the importance of expanding access to therapy among PWID. Third, moving beyond HCV as the primary focus of research, and capitalising once more on data collected in HEPCO, I examine the associations between three factors- OAT, housing and income, and patterns of injection frequency among PWID. Recognizing that injection patterns are dynamic over time, I examine the extent to which these three factors relate to injection frequencies among PWID with diverse trajectories of injection drug use, followed over a period of 7.5 years. Our findings indicate that socioeconomic stability and OAT are consistently associated with a lower injection frequency among all PWID, irrespective of their underlying injection trajectory and whether or not they are on a path to cessation. These findings suggest that there may be ways to support PWID in making small behavioral changes that could reduce their risks of injection-related harms, irrespective of whether or not they are in a position to stop injecting. In conclusion, at a time when many countries have embarked onto a global effort to eliminate HCV, efforts are needed to ensure that well-evidenced harm-reduction programs are optimised to reduce transmission of HCV, treatment for HCV infection is scaled-up among those who are infected ,and efforts do not overlook the basic needs and concerns of affected communities. This thesis provided data to help inform (i) optimisation of OAT provision for the prevention of HCV transmission, (ii) expanded access to HCV treatment, and (iii) access to stable housing and income to reduce the risk of injection-related harms among PWID. Ultimately, findings could contribute to reducing the HCV burden among PWID, helping move towards HCV elimination and, more broadly, improving the overall health of this marginalised group.

La prévalence de l’hépatite C est en constante évolution depuis les dix dernières années et constitue un enjeu de santé publique important. La prévalence est particulièrement élevée chez les utilisateurs de drogue par injection. La nécessité d’implanter des activités de prévention sur le passage à l’injection s’inscrit dans une perspective globale pour tenter d’enrayer le phénomène. Une formation portant sur la prévention du passage à l’injection de drogue chez les jeunes a été mise en place en Estrie, par l’Agence de santé et des services sociaux. Le présent mémoire s’est intéressé à l’évaluation d’implantation de ce projet en mettant en lumière les facteurs facilitants et les obstacles à la mise en œuvre des interventions de prévention sur le passage à l’injection, effectuées par les intervenants. Cela a également permis de recueillir des données régionales sur la clientèle desservie, les contextes d’interventions de même que les pistes de solution à envisager pour mieux orienter les actions de prévention et de formation. Le projet visait à ce que l’évaluation soit utile et utilisée par les décideurs régionaux et les intervenants sur le terrain. Les résultats ont démontré que la clientèle à risque est peu rejointe par les intervenants formés. Les intervenants agissent principalement auprès d’une clientèle qui utilise déjà des drogues par injection. Le manque de connaissances et d’aptitudes pour intervenir sur la prévention du passage à l’injection est parmi les obstacles principaux identifiés tout comme la réticence de certains milieux à l’aborder. La clientèle jeune et plus vulnérable est particulièrement difficile à rejoindre. Le travail sur le terrain et la concertation ont, entre autres, été nommés comme des facteurs facilitants. Plusieurs améliorations, visant à la fois la formation et les stratégies d’intervention, sont ainsi nécessaires pour permettre une amélioration de la mise en œuvre du projet.

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique. / Mouse hepatitis virus type 3 (MHV3) is an excellent model to study immunological disorders related to viral infections. The fulminant acute hepatitis induced in susceptible C57BL/6 mice is characterized by the presence of necrotic and inflammatory foci in the liver associated with B and T cell immunodeficiencies leading to the death of the animals in 3 to 5 days post-infection. The fulminance of this viral infection suggests a deficiency in the natural immunity mechanisms under control of NK and NK-T cells and an imbalance between the hepatic tolerance and the inflammatory responses. To understand the different mechanisms involved in the acute hepatitis, in vivo infections have been done in C57BL/6 mice with either the pathogenic L2-MHV3, or with its attenuated variants: the weak attenuated 51.6-MHV3, the highly attenuated CL12-MHV3 or the non-pathogenic YAC-MHV3 viruses, possessing different tropisms for liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. The results demonstrate that splenic and myeloid NK cells are impaired during a MHV3 infection. This impairment is due to a recruitment of these cells in the liver and a virus-induced apoptotic phenomenon. The recruitment and the subsequent apoptosis of NK and NK-T cells during the first three days of infection are in relation with the pathogenicity of the MHV3 variants. In spite of the fact that hepatic recruited NK cells are still cytotoxic, these cells undergo apoptosis due to viral replication via the formation of syncytia. Addition of IL-12 and IL-18, which are impaired during the acute hepatitis, promote a synergistic IFN-g production by NK cells depending of both the p38 MAPK pathway and the viral replication. Moreover, the specific viral receptor CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) is essential for this response but also exerts an inhibitory action. Levels of the immunosuppressive cytokines IL-10, TGF-b and PGE2, mainly produced by Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells, and implicated in the natural hepatic tolerance, are in inverse correlation with the pathogenicity of the MHV3 variants. Finally, viral infection promotes the secretion of IL-6 and TNF-a by macrophages, triggered by the fixation of viral particules to TLR2 and heparan sulfate receptors rather than the engagement of CEACAM1a receptor and viral replication. In conclusion, our results suggest new mechanisms by which the MHV3 virus disturbs the innate immunity under control of NK and NK-T cells, as well as the cytokines involved in the hepatic tolerance to the detriment of the inflammatory response.

Les cellules endothéliales (EC) constituent une première barrière physique à la dissémination de virus pléiotropiques circulant par voie hématogène mais leur contribution à la défense innée anti-virale est peu connue. Des dysfonctions des EC de la barrière hémato-encéphalique (BMEC) et des sinusoïdes hépatiques (LSEC) ont été rapportées dans des neuropathologies et des hépatites aiguës ou chroniques d’origine virale, suggérant que des atteintes à leur intégrité contribuent à la pathogenèse. Les sérotypes de coronavirus de l’hépatite murine (MHV), se différenciant par leur capacité à induire des hépatites et des maladies neurologiques de sévérité variable et/ou leur tropisme pour les EC, représentent des modèles viraux privilégiés pour déterminer les conséquences de l’infection des EC sur la pathogenèse virale. Lors d’infection par voie hématogène, le sérotype MHV3, le plus virulent des MHV, induit une hépatite fulminante, caractérisée par une réponse inflammatoire sévère, et des lésions neurologiques secondaires alors que le sérotype moins virulent, MHV-A59, induit une hépatite modérée sans atteintes secondaires du système nerveux central (SNC). Par ailleurs, le sérotype MHV3, à la différence du MHV-A59, démontre une capacité à stimuler la production de cytokines par la voie TLR2. Les variants atténués du MHV3, les virus 51.6-MHV3 et YAC-MHV3, sont caractérisés par un faible tropisme pour les LSEC et induisent respectivement une hépatite modérée et subclinique. Compte tenu de l’importance des LSEC dans le maintien de la tolérance hépatique et de l’élimination des pathogènes circulants, il a été postulé que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire lors d’infections par les MHV est associée à la réplication virale et à l’altération des propriétés tolérogéniques et vasculaires des LSEC. Les désordres inflammatoires hépatiques pourraient résulter d’une activation différentielle du TLR2, plutôt que des autres TLR et des hélicases, selon les sérotypes. D’autre part, compte tenu du rôle des BMEC dans la prévention des infections du SNC, il a été postulé que l’invasion cérébrale secondaire par les coronavirus est reliée à l’infection des BMEC et le bris subséquent de la barrière hémato-encéphalique (BHE). À l’aide d’infections in vivo et in vitro par les différents sérotypes MHV, chez des souris ou des cultures de BMEC et de LSEC, nous avons démontré, d’une part, que l’infection in vitro des LSEC par le sétotype MHV3, à la différence des variants 51.6- et YAC-MHV3, altérait la production du facteur vasodilatant NO et renversait leur phénotype tolérogénique en favorisant la production de cytokines et de chimiokines inflammatoires. Ces dysfonctions se traduisaient in vivo par une réponse inflammatoire incontrôlée et une dérégulation du recrutement intrahépatique de leucocytes, favorisant la réplication virale et les dommages hépatiques. Nous avons aussi démontré, à l’aide de souris TLR2 KO et de LSEC dont l’expression du TLR2 a été abrogée par des siRNA, que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire induite par le sérotype MHV3, dépendait en partie de l’induction et de l’activation préférentielle du TLR2 par le virus dans le foie. D’autre part, la sévérité de la réplication virale au foie et des désordres dans le recrutement leucocytaire intrahépatique induits par le MHV3, et non par le MHV-A59 et le 51.6-MHV3, corrélaient avec une invasion virale subséquente du SNC, au niveau de la BHE. Nous avons démontré que l’invasion cérébrale du MHV3 était associée à une infection productive des BMEC et l’altération subséquente des protéines de jonctions serrées occludine, VE-cadhérine et ZO-1 se traduisant par une augmentation de la perméabilité de la BHE et l’entrée consécutive du virus dans le cerveau. Dans l’ensemble, les résultats de cette étude mettent en lumière l’importance du maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des LSEC et des BMEC lors d’infections virales aigües par des MHV afin de limiter les dommages hépatiques associés à l’induction d’une réponse inflammatoire exagérée et de prévenir le passage des virus au cerveau suite à une dissémination par voie hématogène. Ils révèlent en outre un nouveau rôle aggravant pour le TLR2 dans l’évolution de l’hépatite virale aigüe ouvrant la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques visant à moduler l’activité inflammatoire du TLR2. / Endothelial cells (EC) act as a physical barrier against invasion by pleiotropic blood borne viruses but their contribution in innate antiviral defense is poorly known. Dysfunctions in blood-brain barrier EC (BMECs) and liver sinusoidal EC (LSECs) have been reported in viral neuropathologies and hepatitis, suggesting that loss of ECs integrity may contribute to the pathogenesis. Mouse hepatitis coronaviruses (MHV), differing in their ability to induce severe to subclinical hepatitis and neurological diseases and / or their tropism for ECs, are relevant viral models to study the consequences of EC infection in viral pathogenesis. Following hematogenous infection, the MHV3 serotype, the most virulent MHV, induces fulminant hepatitis, characterized by severe inflammatory response, followed by neurological damage whereas the less virulent MHV-A59 serotype induces milder hepatitis but does not invade the central nervous system (CNS). In addition, MHV3, in contrast to MHV-A59, shows ability to induce TLR2-dependent cytokine response. The attenuated MHV3 variants, 51.6-MHV3 and YAC-MHV3, are characterized by a weak tropism for LSECs and induce moderated and subclinical hepatitis respectively. Given the importance of LSECs in hepatic tolerance and the elimination of circulating pathogens, it has been postulated that the severity of hepatitis and inflammatory response induced by MHVs correlates with infection and alterations in vascular and tolerogenic properties of LSECs. Hepatic inflammatory disorders may result from differential activation of TLR2, rather than other TLRs and helicases, according to serotypes. Moreover, given the role of BMECs in preventing CNS infections, it has been postulated that secondary cerebral invasion by coronaviruses is related to infection of BMECs and subsequent breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Through in vitro and in vivo infections of isolated BMECs, LSECs or mice with the different MHVs, we demonstrated, first, that in vitro productive infection of LSECs by the highly virulent MHV3 serotype, in contrast to 51.6- et YAC-MHV3 variants, altered their production of vasoactive factors and overthrew their intrinsic tolerogenic properties by promoting inflammatory cytokines and chemokines production. These disturbances were reflected in vivo by an uncontrolled inflammatory response and a deregulation of intrahepatic leukocyte recruitment, favoring viral replication and liver damages. We demonstrated, using TLR2 KO mice and LSECs treated with siRNA for TLR2 that the abnormal inflammatory response induced by MHV3 depended in part on preferential induction and activation of TLR2 by the virus on the surface of hepatic cells. Moreover, the severity of the primary viral replication in the liver and disorders in intrahepatic leucocyte recruitment induced by MHV3, but not by MHV-A59 and 51.6-MHV3, correlated with a subsequent brain invasion at the BBB level. Such invasion was related to productive infection of BMECs and subsequent IFN--dependent disruption of tight junction proteins occludin, VE-cadherin and ZO-1, resulting in an increase of BBB permeability and further viral entry into the CNS. Overall, the results of this study highlight the importance of structural and functional integrity of LSECs and BMECs during acute viral infections by MHVs to limit liver damages associated with viral-induced exacerbation of inflammatory response and prevent brain invasion by MHVs following viral spread through the bloodstream. They also reveal a new worsening role for TLR2 in the evolution of acute viral hepatitis paving the way for new therapies targeting TLR2-induced inflammatory activity.

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique. / Mouse hepatitis virus type 3 (MHV3) is an excellent model to study immunological disorders related to viral infections. The fulminant acute hepatitis induced in susceptible C57BL/6 mice is characterized by the presence of necrotic and inflammatory foci in the liver associated with B and T cell immunodeficiencies leading to the death of the animals in 3 to 5 days post-infection. The fulminance of this viral infection suggests a deficiency in the natural immunity mechanisms under control of NK and NK-T cells and an imbalance between the hepatic tolerance and the inflammatory responses. To understand the different mechanisms involved in the acute hepatitis, in vivo infections have been done in C57BL/6 mice with either the pathogenic L2-MHV3, or with its attenuated variants: the weak attenuated 51.6-MHV3, the highly attenuated CL12-MHV3 or the non-pathogenic YAC-MHV3 viruses, possessing different tropisms for liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. The results demonstrate that splenic and myeloid NK cells are impaired during a MHV3 infection. This impairment is due to a recruitment of these cells in the liver and a virus-induced apoptotic phenomenon. The recruitment and the subsequent apoptosis of NK and NK-T cells during the first three days of infection are in relation with the pathogenicity of the MHV3 variants. In spite of the fact that hepatic recruited NK cells are still cytotoxic, these cells undergo apoptosis due to viral replication via the formation of syncytia. Addition of IL-12 and IL-18, which are impaired during the acute hepatitis, promote a synergistic IFN-g production by NK cells depending of both the p38 MAPK pathway and the viral replication. Moreover, the specific viral receptor CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) is essential for this response but also exerts an inhibitory action. Levels of the immunosuppressive cytokines IL-10, TGF-b and PGE2, mainly produced by Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells, and implicated in the natural hepatic tolerance, are in inverse correlation with the pathogenicity of the MHV3 variants. Finally, viral infection promotes the secretion of IL-6 and TNF-a by macrophages, triggered by the fixation of viral particules to TLR2 and heparan sulfate receptors rather than the engagement of CEACAM1a receptor and viral replication. In conclusion, our results suggest new mechanisms by which the MHV3 virus disturbs the innate immunity under control of NK and NK-T cells, as well as the cytokines involved in the hepatic tolerance to the detriment of the inflammatory response.

Le nombre croissant d'admissions hospitaliairres provoquées par les effets second d'un traitement thérapeutique constitue un problème majeur de santé publique. L'hépatite médicamenteuse, la pathologie iatrogène la plus fréquente pose également un problème d'ordre économique. En effet, l'hépatotoxicité des médicaments constitue la première cause de leur retrait du marché pharmaceutique. La non détection de ce potentiel hépatotoxique, avant commercialisation provient essentiellement du caractère idiosyncratique de ce type d'hépatites médicamenteuscs. Cclles-ci se divisent en deux types : les hépatites médicamenteuses qualifiées de directes et à l'inverse les hépatites médicamenteuses immunoallergiques. Les mécanismes sous-jacents des hépatites médicamenteuses idiosyncratiques sont généralement méconnus et leur comprehension constitue donc à la fois un impératif de santé publique et économique. Mon travail s'est inscrit dans cette optique et a consisté à appréhendcr les premières étapes impliquées dans l'apparition des, hépatites idiosyncratiques et en particulier celle induite par l'acide tiénilique (AT). En effet, ce diurétique, retiré du marché pharmaceutique français en 1992 a été responsable de nombreuses hépatites imrnunoallergiques., Les patients atteints de ces hepatitis induites par l'AT possèdent des anticorps très spécifiques, désignés anti-LKM2, dirigés contre le CYP2C9, le P450 responsible de la métabolisation de l'AT. Les principaux resultants obtenus sont les suivants : nous avons montré que l'activation de l'isomère de l'acide tiénilique par les microsomes hépatiques humains conduit à la formation de sulfoxydes de thiophène. Ces metabolites électrophiles instables, comme ceux de l'AT, réagissent avec les proteins hépatiques avec lesquelles ils forment des adduits covalents. La formation de sulfoxydes de thiophène liée à l'activation de l'AT chez l'homme constitue probablement la première étape impliquée dans les hepatites induites par ce médicament. Nous avons ensuite démontré que la fixation covalente de l'AT après activation par les microsomes hépatiques est très spécifique chez l'homme. En effet le CYP2C9 est la cible principale des metabolites de l'AT. L'alkylation du CYP2C9 par l'AT in vivo chez l'homme pourrait constituer la seconde étape impliquée dans l'hépatite induite par ce medicament. Nous avons ensuite montré que le CYP2C11, l'homologue du CYP2C9 humain, est une cible privilégiée des métabolites de l'AT chez le rat. Nous montrons que cette fixation covalente sur le CYP2C11 est observable à la fois in vitro et in vivo. Nous montrons que les adduits de l'AT chez le rat sont principalement localizes au niveau des hépatocyte centrolobulaires. L'alkylation majoritaire des hépatocytes centrolobulaires chez l'homme pourrait favoriser la présentation d'adduits d'AT aux cellules immunocompétentes sanguines et constituer la troisième étape des hepatitis autoimmunes induites par le medicament. Nous montrons qu'en effet les patients traits avec l'AT possèdent des anticorps capables de reconnaitre l'AT lorsqu'il est lié à des proteins.

Introduction: L’activation des cellules stellaires hépatiques (CSHs) est un point clé du processus de fibrose hépatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hépatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hépatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqués dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais l’effet de ces cellules sur les CSHs n’est pas encore élucidé. Objectif: Comprendre le rôle des cytokines de type Th17 dans le processus d’activation des CSHs. Méthodes: La lignée de CSHs humaine LX2 a été stimulée par l’IL-17A ou l’IL-22 puis comparée à des cellules traitées par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). L’activation des CSHs a été évaluée en examinant les molécules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagène de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des métalloprotéases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. L’expression protéique a été validée par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. L’expression membranaire de l’IL-10Rb, du TGF-b-RII et de l’IL-17RA a été mesurée par cytométrie en flux. Résultats: L’IL-17A et l’IL-22 n’activent pas les cellules LX2, car aucune induction d’a-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I n’a été observée. Cependant, l’IL-17A et l’IL-22 sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b, tel que démontré par une forte expression et production d’a-SMA, collagène type I et TIMP-I. L’IL-17A, mais pas l’IL-22, induit la surexpression à la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse d’expression du TGF--RII après stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos résultats démontrent une fonction pro-fibrotique de l’IL-17A et de l’IL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b. L’IL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que l’IL-22 agit probablement par des mécanismes intracellulaires. / Background: Activated hepatic stellate cells (HSCs) are key initiators of the fibrogenic process. Intrahepatic CD4+ T cells are major producers of hepatoprotective cytokines such as IL-10 produced by regulatory T cells (Tregs) or inflammatory and regulatory cytokines like IL-17 and IL-22 produced by Th17 cells. Th17 cells have been implicated in various conditions or liver damage but the mechanism of action of Th17 cytokines on HSC is still poorly understood. Aims: To understand the role of the different Th17 cytokines (IL17-A and IL-22) in modulating HSC activation. Methods: The HSC line LX2 was stimulated with increasing doses of IL-17A or IL-22, and compared to TGF-b and PBS-treated cells. Activation of HSCs was evaluated by examining the expression of the pro-fibrotic molecules alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagen type I (COL1A1) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase I (TIMP-I) by q-PCR. Protein expression was validated by either western blot or picro Sirius red stain. Cell surface expression of the cytokine receptors IL-10Rb, TGF-b-RII and IL-17RA was evaluated by flow cytometry. Results: IL-17A and IL-22 alone did not induce LX2 activation, as no induction of a-SMA, COL1A1 and TIMP-I was observed. However, both IL-17A and IL-22 sensitized HSCs to the action of suboptimal doses of TGF-b, confirmed by strong a-SMA, collagen type I and TIMP-I gene expression and protein production. IL-17A but not IL-22 upregulated TGF-b-RII cell surface expression and partially inhibited TGF-b-RII downmodulation upon TGF-b stimulation. Conclusion: Our results demonstrated a pro-fibrotic function for IL-17A and IL-22, as both cytokines sensitize HSC to the action of TGF-b. IL-17A acts through upregulation and stabilization of the TGF-b-RII while IL-22 probably acts through an intracellular mechanism.

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