Charles University in Prague First Faculty of Medicine Study programme: Specialization in Health Care Branch of Study: Addictology PharmDr. Bc. Zbyněk Oktábec, Ph.D. et Ph.D. Design of Pilot Clinical Trial of Treatment of Hepatitis C in Polyvalent Problem Drug Users with Pharmacological Substitution of Opioids and Methamphetamine (HCV-PPDUSOM) Master's Thesis Advisor: Mgr. Roman Gabrhelík, Ph.D. Prague, 2016 Abstract Hepatitis C is one of the most serious blood-borne complications of somatic health status of drug users. The HCV-positive injecting drug users are therefore directly indicated for the treatment of this type (and other types also) of hepatitis. Problematic adherence and treatment compliance is obvious in this group. Both foreign and domestic experiences show that stabilization of the use of illegal (and/or illegally acquired) substances is the essential part of the treatment of hepatitis. The interaction of the high quality treatment of somatic, psychosocial and add-on pharmacological care, including the substitution of illegal (and/or illegally acquired) drugs, leads to patient's increased compliance and adherence to HCV treatment. This diploma thesis is presenting both the theoretical frame and the study design of the pilot clinical trial of HCV treatment with the supportive substitution...

O objetivo geral da pesquisa foi associar os polimorfismos do gene HLA-G (região 3\' NT) com a coinfecção HIV/HCV e com os grupos (HIV, HCV e controles saudáveis). Trata-se de um estudo transversal, comparativo, descritivo. Participaram do estudo, 560 indivíduos, sendo 156 controles saudáveis, 102 coinfetados HIV/HCV, 186 infectados pelo HIV e 116 por HCV. Para a identificação dos polimorfismos, o DNA genômico foi extraído do sangue total e a genotipagem feita por PCR e visualizada em gel de poliacrilamida a 7%, no qual o polimorfismo de 14pb foi identificado, e por sequenciamento os outros sete SNPs. Os resultados sociodemográficos apontam que a amostra na sua grande maioria foi composta por indivíduos adultos e do sexo masculino. No que diz respeito à cor da pele, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, observou-se um maior número de coinfectados apresentando a cor preta e parda do que nos monoinfectados (P=0,0001). Com relação à categoria de exposição para aquisição do HIV, na comparação entre os grupos HIV e HIV/HCV, observou-se diferença significante na transmissão por via heterossexual, sendo sua frequência maior no grupo HIV (P=0,0000). No caso da comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, observou-se também diferença na transmissão heterossexual, sendo sua frequência significantemente maior no grupo HIV/HCV (P=0,0001). Quanto aos achados relacionados ao genótipo do HCV, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, o genótipo 1a apresentou frequência maior nos coinfectados (P=0,0001). No que diz respeito à carga viral do HIV, na comparação entre os grupos HIV e HIV/HCV, o grupo da monoinfecção apresentou maior carga viral do que o grupo da coinfecção (P=0,0350). Com relação ao grau de fibrose hepática, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, o grupo da coinfecção tem mais fibrose leve do que o grupo da monoinfecção (P=0,0009). Quanto aos polimorfismos genéticos da região 3\' NT do HLA-G, foi encontrado que o genótipo de heterozigose Del/Ins de 14 pb apresentou diferença significante nos indivíduos coinfectados pelo HIV/HCV (P=0,0216) quando comparados com o grupo controle. Em relação ao SNP +3003, a comparação dos grupos HCV e controle saudável mostrou que alelo +3003T apresentou uma frequência significantemente maior no grupo HCV (P=0,0147); o genótipo +3003C/T apresentou uma frequência maior no grupo controle (P=0,0095); o genótipo +3003T/T estava maior no grupo HCV (P=0,0095). A comparação entre os grupos HIV e HCV mostrou que a frequência do alelo +3003C estava maior no grupo HIV (P=0,0463); e o genótipo +3003T/T apresentou uma frequência maior no grupo HCV (P=0,0494). A frequência do genótipo +3187A/A estava maior no grupo HIV/HCV em comparação ao HIV (P=0,0193); e do +3187A/G estava maior no grupo HIV (P=0,0187). O genótipo +3196C/G apresentou frequência significamente maior no grupo HIV do que no controle saudável (P=0,0213). A UTR-10, na comparação entre os grupos HIV e controle, mostrou frequência maior no grupo HIV (P=0,0044); quando comparados os grupos HIV/HCV e HIV, frequência foi maior no grupo HIV (P=0,0300) e na comparação entre os grupos HIV e HCV, sua frequência também foi maior no grupo HIV (P=0,0140). A UTR-4, na comparação dos grupos HCV e controle saudável, revelou uma frequência maior no grupo controle (P=0,0147). A UTR-9, na comparação dos grupos HIV/HCV e HIV, mostrou frequência maior no grupo HIV/HCV (P=0,0460). Em relação aos dados clínicos, a presença do alelo T na posição +3035 foi significantemente associada à maior carga viral do HCV, acima de 400.000 cópias/mL (P=0,0244). Em relação aos tipos de genótipos do HCV, a presença do alelo +3027C foi associada ao subtipo 1a do HCV (P=0,0109). Adicionalmente, a presença do genótipo C/C na posição +3027 também foi significantemente associada com o subtipo 1a do HCV (P=0,0015). Ainda, o alelo A do SNP +3187 foi significantemente associado com os outros genótipos do HCV, excluindo o 1a (P=0,0369). Embora não esteja totalmente esclarecida a função do gene HLA-G, estudos têm sido desenvolvidos para melhor elucidar sua função nos contextos fisiológicos, como gestação, e patológicos, como tumores, transplantes, doenças inflamatórias e infecciosas. Tais estudos procuram ampliar o conhecimento sobre o sistema imunológico e contribuem para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas. Os resultados do presente estudo contribuem para a ampliação do conhecimento sobre os polimorfismos da região 3\' NT do gene HLA-G, na coinfecção HIV/HCV. Como também, na melhoria da assistência de enfermagem que deve buscar reduzir a morbimortalidade pela referida patologia. Porém, ainda há um longo percurso a ser percorrido na compreensão dos fatores imunogenéticos envolvidos na coinfecção pelo HIV/HCV / The general objective of the research was to associate the polymorphism of the gene HLA-G (region 3\' NT) with the co-infection HIV/HCV and with the groups (HIV, HCV and healthy control). It is a cross-sectional, comparative, descriptive study. 560 individuals participated of the study, being 156 healthy control individuals, 102 co- infected HIV/HCV, 186 infected by HIV and 116 by HCV. For identifying the polymorphisms, the genomic DNA was extracted from the total blood and the genotyping was made by PCR and visualized in gel of polyacrylamide at 7%, in which the polymorphism of 14pb was identified, and by sequencing the other seven SNPs. The social demographic results point that the most of the sample was composed by male adult individuals. Regarding the color of the skin, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, a bigger number of co-infected with black skin and brown-skinned was observed than in the mono infected (P=0,0001). Regarding to the category of exposition for acquisition of the HIV, in the comparison between the groups HIV and HIV/HCV, a significant difference was observed in the transmission through heterosexual exposition, being its frequency bigger in the group HIV (P=0,0000). In the case of the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the difference in the heterosexual transmission was also observed, being its frequency significantly higher in the group HIV/HCV (P=0,0001). About the finding related to the genotype of the HCV, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the genotype 1a presented higher frequency in the co- infected (P=0,0001). Regarding to the viral load of the HIV, in the comparison between the groups HIV and HIV/HCV, the group of the mono infection presented bigger viral load that the group of the co-infection (P=0,0350). Regarding to the level of hepatic fibrosis, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the group of co-infection has a lighter fibrosis that the group of the mono infection (P=0,0009). Regarding to the genetic polymorphisms of the region 3\' NT of the HLA-G, it was found that the genotype of heterozygosis Del/Ins of 14 pb, presented significant difference in the individuals co-infected by the HIV/HCV (P=0,0216) when compared with the control group. About the SNP +3003, the comparison of the groups HCV and healthy control, it was showed that the allele +3003T presented a significant higher frequency in the group HCV (P=0,0147); the genotype +3003C/T presented a higher frequency in the control group (P=0,0095); the genotype +3003T/T was bigger in the group HCV (P=0,0095). The comparison between the groups HIV and HCV showed that the frequency of the allele +3003C was bigger in the group HIV (P=0,0463); and the genotype +3003T/T presented a bigger frequency in the group (P=0,0494). The frequency of the genotype +3187A/A was bigger in the group HIV/HCV in comparison to the HIV (P=0,0193); and of the +3187A/G was bigger in the group HIV (P=0,0187). The genotype +3196C/G presented frequency significantly bigger in the group HIV than in the healthy control (P=0,0213). The UTR-10, in comparison between the groups HIV and control, showed bigger frequency in the group HIV (P=0,0044); when compared the groups HIV/HCV and HIV, frequency was bigger in the group HIV (P=0,0300) and in the comparison between the groups HIV and HCV, its frequency was also bigger in the group (P=0,0140). The UTR-4, in the comparison of the groups HCV and healthy control, revealed a bigger frequency in the control group (P=0,0147). The UTR-9, in comparison of the groups HIV/HCV and HIV, showed bigger frequency in the group HIV/HCV (P=0,0460). Regarding to the clinical data, the presence of the allele T in the position +3035, was significantly associated to bigger viral load of the HCV, above 400.000 copies /mL (P=0,0244). About the types of genotypes of the HCV, the presence of the allele +3027C was associated with the subtype 1a of the HCV (P=0,0109). Additionally, the presence of the genotype C/C in the position +3027 was also significantly associated with the subtype 1a of the HCV (P=0,0015). Still, the allele A of the SNP +3187 was significantly associated with the other genotypes of the HCV, excluding the 1a (P=0,0369). Although the function of the gene HLA-G, is not totally clarified, studies have been developed for better elucidate its function in the physiological contexts, like gestation, and pathological, such as tumours, transplants, infectious and inflammatory diseases. These studies aim to extend the knowledge about the immunological system and contribute for the development of new diagnostic and therapeutic strategies. The results of this study contribute for enhancement of the knowledge about the polymorphisms of the region 3\' NT of the gene HLA-G, in the co-infection HIV/HCV. As well as, in the improvement of the assistance of nursing that must seek reducing the morbid mortality by the pathology referred. However, there is still a long path to be followed in the comprehension of the immunogenic factors involved in the co-infection by the HIV/HCV

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:54:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ROBERPAULO ANACLETO NEVES.pdf: 3157130 bytes, checksum: 0cf8ffe81408930e67e0854181733521 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / Durante anos a hepatite C foi conhecida sob a designação de hepatite não-A e não- B. Somente após sua identificação em 1989 tornou-se evidente que um considerável número de pessoas estavam infectadas pelo HCV. A transmissão ocorre principalmente pela via sexual e pelo uso de drogas injetáveis. Dentro da mesma visão epidemiológica o HIV e o HCV apresentam-se hoje como um importante problema mundial de saúde pública. A coinfecção pelos vírus HCV e HIV, tende a agravar o quadro clínico do infectado. O HCV dificulta a reconstituição do sistema imunitário, eleva o risco de hepatotoxicidade e diminui o tempo para o aparecimento da AIDS e morte. O objetivo principal deste estudo foi identificar a prevalência da infecção pelo Vírus da Hepatite C e coinfecção pelo vírus da Imunodeficiência Humana na população de detentos do Complexo Prisional de Aparecida de Goiânia, apontar os comportamentos de riscos e os fatores associados às infecções. Estudo transversal, descritivo e de abordagem quantitativa. Os detentos participantes foram submetidos à punção venosa para obtenção de amostras de soro e plasma, as quais foram submetidas a testes laboratoriais para a pesquisa do marcador sorológico anti-HCV, sendo os testes reagentes, submetidos à pesquisa do anti-HIV. O complexo prisional apresenta uma população total de 3250 indivíduos privados de liberdade. Destes, 1157 indivíduos aceitaram participar da pesquisa, sendo, 1015 do sexo masculino e 142 do sexo feminino. Utilizaram-se os testes Qui-Quadrado e Exato de Fisher (ambos com nível de significância estatística de 5%) e a razão de prevalência com intervalo de confiança de 95%. Foram identificados 51 indivíduos detentos sororreagentes para o anti-HCV, sendo 44 homens e 7 mulheres, o que correspondeu a 4,4% quando comparado com a população total de participantes. Destes 51 indivíduos, 3 apresentavam como comorbidade o HIV, o que correspondeu a 5,9% de coinfecção HCV/HIV. Os resultados indicam que a condição de marginalização, o baixo nível socioeconômico dos detentos, a superpopulação das prisões e a precária condição de saúde contribuem para a disseminação de doenças nas prisões, sendo necessária a implantação de programas de saúde contínuos a fim de possibilitar medidas de controle e prevenção dessas infecções no ambiente prisional.

A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) é importante fator de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática e de carcinoma hepatocelular. A evolução para formas mais graves está relacionada a fatores ligados ao vírus, ao hospedeiro e à resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos do gene HLA-E, a expressão da molécula HLA-E e a gravidade da doença hepática pelo HCV. Foram incluídos 112 pacientes com hepatite C crônica e avaliados parâmetros clínicos, bioquímicos e histológicos (esteatose, atividade inflamatória e fibrose hepática). A variabilidade do gene HLA-E foi avaliada por sequenciamento de Sanger, e a expressão hepática da molécula, por imunoistoquímica. Para comparação da expressão hepática da molécula HLA-E e da variabilidade do gene HLA-E, foram usados dois grupos controles de indivíduos sem hepatopatia da mesma região geográfica. A imunoistoquímica para HLA-E identificou expressão da molécula nos hepatócitos e nas células de Kupffer. A expressão de HLAE em hepatócitos e células de Kupffer foi encontrada em 56,3% e 43,8% dos pacientes com HCV e em 20% e 10% nos controles (P = 0,008 e 0,02), respectivamente. Foi identificado que o percentual de pacientes do sexo masculino, com expressão moderada de HLA-E em células de Kupffer, foi maior em relação aos pacientes do sexo feminino (22,8% x 7,3%; P = 0,03). As amostras de fígado classificadas como esteatose, atividade necroinflamatória e fibrose graves apresentaram maior grau de expressão de HLA-E em células de Kupffer e hepatócitos, com associação linear significativa. Na análise multivariada, as variáveis que influenciaram significativamente a gravidade da doença foram a expressão da molécula HLA-E nos hepatócitos, a idade avançada e o índice de massa corporal maior que 25. Foram identificados 14 haplótipos diferentes do gene HLA-E, quatro deles ainda não descritos na literatura. A frequência do alelo HLA-E*01:01:01:03 foi menor no grupo de pacientes, quando comparada ao controle (P = 0,0001). O alelo HLA-E*01:03:05 associou-se a maior probabilidade (OR = 4,69) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer (P = 0,046). O genótipo TT do polimorfismo +424 T/C (rs1059510) associou-se a menor probabilidade (OR = 0,06) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer, em relação à ausência de expressão (P=0,009), a menor probabilidade (OR = 0,22) de atividade inflamatória moderada/grave em relação à leve (P = 0,047) e esteve associado a menor probabilidade (OR = 0,17) de fibrose hepática moderada/grave em relação à fibrose leve (P = 0,049). Os resultados do presente estudo sugerem que a pesquisa de fatores imunogenéticos, como a expressão hepática da molécula HLA-E e a identificação da variabilidade genética do HLA-E, pode ter aplicabilidade no manejo clínico dos pacientes, uma vez que auxilia na discriminação daqueles com maior risco de atingir formas avançadas da hepatite C crônica. / Chronic hepatitis C is an important risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The severity of liver disease can be influenced by factors related to the virus, the host and the immune response. The aim of this study was to evaluate the association between HLA-E gene polymorphisms, HLA-E molecule expression and HCV liver disease severity. We included 112 patients with chronic hepatitis C and evaluated clinical, biochemical and histological parameters (steatosis, inflammatory activity and liver fibrosis). The variability of the HLA-E gene was assessed by Sanger sequencing and liver HLA-E expression by immunohistochemistry. Two control groups of individuals without hepatopathy from the same geographical region were used to compare the HLA-E expression and the gene variability. Immunohistochemistry for HLA-E showed positivity in hepatocyte and Kupffer cell. HLA-E positivity in hepatocytes and Kupffer cells were found in 56.3% and 43.8% of HCV patients and in 20% and 10% in the controls (P = 0.008 and 0.02), respectively. We found that the percentage of male patients with moderate HLA-E expression in Kupffer cells was higher than in females (22.8% vs. 7.3%, P = 0.03). The liver samples classified as severe fibrosis, necroinflammatory activity and steatosis presented greater expression of HLA-E on Kupffer cells and hepatocytes. There was a positive linear association between HLA-E expression and severity of liver damage (P<0.05). In the multivariate analysis, the variables that significantly influenced the severity of the disease were HLA-E molecule expression in hepatocytes, advanced age and body mass index greater than 25. Fourteen different HLA-E haplotypes were identified, four of them not yet described in the literature. The frequency of the HLA-E * 01: 01: 01: 03 allele was lower in the group of patients than in the control group (P = 0.0001). The HLA-E * 01: 03: 05 allele was associated with increased likelihood (OR = 4.69) of HLA-E expression in the Kupffer cell (P = 0.046). The TT genotype of the +424 T / C polymorphism (rs1059510) was associated with a lower probability (OR = 0.06) of HLA-E expression in the Kupffer cell in relation to the absence of its expression (P = 0.009), was associated with a lower probability (OR=0,22) of moderate/severe necroinflammatory activity in relation to the mild inflammatory activity (P=0,047) and was associated with a lower probability (OR = 0.17) of moderate / severe hepatic fibrosis in relation to mild fibrosis (P = 0.049). The results of the present study suggest that the study for immunogenic factors such as HLA-E liver expression and the identification of certain polymorphisms and alleles of the HLA-E gene may have applicability in the clinical management of patients since it aids in discrimination of those at greatest risk of reaching advanced forms of chronic hepatitis C.

A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) é importante fator de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática e de carcinoma hepatocelular. A evolução para formas mais graves está relacionada a fatores ligados ao vírus, ao hospedeiro e à resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos do gene HLA-E, a expressão da molécula HLA-E e a gravidade da doença hepática pelo HCV. Foram incluídos 112 pacientes com hepatite C crônica e avaliados parâmetros clínicos, bioquímicos e histológicos (esteatose, atividade inflamatória e fibrose hepática). A variabilidade do gene HLA-E foi avaliada por sequenciamento de Sanger, e a expressão hepática da molécula, por imunoistoquímica. Para comparação da expressão hepática da molécula HLA-E e da variabilidade do gene HLA-E, foram usados dois grupos controles de indivíduos sem hepatopatia da mesma região geográfica. A imunoistoquímica para HLA-E identificou expressão da molécula nos hepatócitos e nas células de Kupffer. A expressão de HLAE em hepatócitos e células de Kupffer foi encontrada em 56,3% e 43,8% dos pacientes com HCV e em 20% e 10% nos controles (P = 0,008 e 0,02), respectivamente. Foi identificado que o percentual de pacientes do sexo masculino, com expressão moderada de HLA-E em células de Kupffer, foi maior em relação aos pacientes do sexo feminino (22,8% x 7,3%; P = 0,03). As amostras de fígado classificadas como esteatose, atividade necroinflamatória e fibrose graves apresentaram maior grau de expressão de HLA-E em células de Kupffer e hepatócitos, com associação linear significativa. Na análise multivariada, as variáveis que influenciaram significativamente a gravidade da doença foram a expressão da molécula HLA-E nos hepatócitos, a idade avançada e o índice de massa corporal maior que 25. Foram identificados 14 haplótipos diferentes do gene HLA-E, quatro deles ainda não descritos na literatura. A frequência do alelo HLA-E*01:01:01:03 foi menor no grupo de pacientes, quando comparada ao controle (P = 0,0001). O alelo HLA-E*01:03:05 associou-se a maior probabilidade (OR = 4,69) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer (P = 0,046). O genótipo TT do polimorfismo +424 T/C (rs1059510) associou-se a menor probabilidade (OR = 0,06) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer, em relação à ausência de expressão (P=0,009), a menor probabilidade (OR = 0,22) de atividade inflamatória moderada/grave em relação à leve (P = 0,047) e esteve associado a menor probabilidade (OR = 0,17) de fibrose hepática moderada/grave em relação à fibrose leve (P = 0,049). Os resultados do presente estudo sugerem que a pesquisa de fatores imunogenéticos, como a expressão hepática da molécula HLA-E e a identificação da variabilidade genética do HLA-E, pode ter aplicabilidade no manejo clínico dos pacientes, uma vez que auxilia na discriminação daqueles com maior risco de atingir formas avançadas da hepatite C crônica. / Chronic hepatitis C is an important risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The severity of liver disease can be influenced by factors related to the virus, the host and the immune response. The aim of this study was to evaluate the association between HLA-E gene polymorphisms, HLA-E molecule expression and HCV liver disease severity. We included 112 patients with chronic hepatitis C and evaluated clinical, biochemical and histological parameters (steatosis, inflammatory activity and liver fibrosis). The variability of the HLA-E gene was assessed by Sanger sequencing and liver HLA-E expression by immunohistochemistry. Two control groups of individuals without hepatopathy from the same geographical region were used to compare the HLA-E expression and the gene variability. Immunohistochemistry for HLA-E showed positivity in hepatocyte and Kupffer cell. HLA-E positivity in hepatocytes and Kupffer cells were found in 56.3% and 43.8% of HCV patients and in 20% and 10% in the controls (P = 0.008 and 0.02), respectively. We found that the percentage of male patients with moderate HLA-E expression in Kupffer cells was higher than in females (22.8% vs. 7.3%, P = 0.03). The liver samples classified as severe fibrosis, necroinflammatory activity and steatosis presented greater expression of HLA-E on Kupffer cells and hepatocytes. There was a positive linear association between HLA-E expression and severity of liver damage (P<0.05). In the multivariate analysis, the variables that significantly influenced the severity of the disease were HLA-E molecule expression in hepatocytes, advanced age and body mass index greater than 25. Fourteen different HLA-E haplotypes were identified, four of them not yet described in the literature. The frequency of the HLA-E * 01: 01: 01: 03 allele was lower in the group of patients than in the control group (P = 0.0001). The HLA-E * 01: 03: 05 allele was associated with increased likelihood (OR = 4.69) of HLA-E expression in the Kupffer cell (P = 0.046). The TT genotype of the +424 T / C polymorphism (rs1059510) was associated with a lower probability (OR = 0.06) of HLA-E expression in the Kupffer cell in relation to the absence of its expression (P = 0.009), was associated with a lower probability (OR=0,22) of moderate/severe necroinflammatory activity in relation to the mild inflammatory activity (P=0,047) and was associated with a lower probability (OR = 0.17) of moderate / severe hepatic fibrosis in relation to mild fibrosis (P = 0.049). The results of the present study suggest that the study for immunogenic factors such as HLA-E liver expression and the identification of certain polymorphisms and alleles of the HLA-E gene may have applicability in the clinical management of patients since it aids in discrimination of those at greatest risk of reaching advanced forms of chronic hepatitis C.

O objetivo geral da pesquisa foi associar os polimorfismos do gene HLA-G (região 3\' NT) com a coinfecção HIV/HCV e com os grupos (HIV, HCV e controles saudáveis). Trata-se de um estudo transversal, comparativo, descritivo. Participaram do estudo, 560 indivíduos, sendo 156 controles saudáveis, 102 coinfetados HIV/HCV, 186 infectados pelo HIV e 116 por HCV. Para a identificação dos polimorfismos, o DNA genômico foi extraído do sangue total e a genotipagem feita por PCR e visualizada em gel de poliacrilamida a 7%, no qual o polimorfismo de 14pb foi identificado, e por sequenciamento os outros sete SNPs. Os resultados sociodemográficos apontam que a amostra na sua grande maioria foi composta por indivíduos adultos e do sexo masculino. No que diz respeito à cor da pele, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, observou-se um maior número de coinfectados apresentando a cor preta e parda do que nos monoinfectados (P=0,0001). Com relação à categoria de exposição para aquisição do HIV, na comparação entre os grupos HIV e HIV/HCV, observou-se diferença significante na transmissão por via heterossexual, sendo sua frequência maior no grupo HIV (P=0,0000). No caso da comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, observou-se também diferença na transmissão heterossexual, sendo sua frequência significantemente maior no grupo HIV/HCV (P=0,0001). Quanto aos achados relacionados ao genótipo do HCV, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, o genótipo 1a apresentou frequência maior nos coinfectados (P=0,0001). No que diz respeito à carga viral do HIV, na comparação entre os grupos HIV e HIV/HCV, o grupo da monoinfecção apresentou maior carga viral do que o grupo da coinfecção (P=0,0350). Com relação ao grau de fibrose hepática, na comparação entre os grupos HCV e HIV/HCV, o grupo da coinfecção tem mais fibrose leve do que o grupo da monoinfecção (P=0,0009). Quanto aos polimorfismos genéticos da região 3\' NT do HLA-G, foi encontrado que o genótipo de heterozigose Del/Ins de 14 pb apresentou diferença significante nos indivíduos coinfectados pelo HIV/HCV (P=0,0216) quando comparados com o grupo controle. Em relação ao SNP +3003, a comparação dos grupos HCV e controle saudável mostrou que alelo +3003T apresentou uma frequência significantemente maior no grupo HCV (P=0,0147); o genótipo +3003C/T apresentou uma frequência maior no grupo controle (P=0,0095); o genótipo +3003T/T estava maior no grupo HCV (P=0,0095). A comparação entre os grupos HIV e HCV mostrou que a frequência do alelo +3003C estava maior no grupo HIV (P=0,0463); e o genótipo +3003T/T apresentou uma frequência maior no grupo HCV (P=0,0494). A frequência do genótipo +3187A/A estava maior no grupo HIV/HCV em comparação ao HIV (P=0,0193); e do +3187A/G estava maior no grupo HIV (P=0,0187). O genótipo +3196C/G apresentou frequência significamente maior no grupo HIV do que no controle saudável (P=0,0213). A UTR-10, na comparação entre os grupos HIV e controle, mostrou frequência maior no grupo HIV (P=0,0044); quando comparados os grupos HIV/HCV e HIV, frequência foi maior no grupo HIV (P=0,0300) e na comparação entre os grupos HIV e HCV, sua frequência também foi maior no grupo HIV (P=0,0140). A UTR-4, na comparação dos grupos HCV e controle saudável, revelou uma frequência maior no grupo controle (P=0,0147). A UTR-9, na comparação dos grupos HIV/HCV e HIV, mostrou frequência maior no grupo HIV/HCV (P=0,0460). Em relação aos dados clínicos, a presença do alelo T na posição +3035 foi significantemente associada à maior carga viral do HCV, acima de 400.000 cópias/mL (P=0,0244). Em relação aos tipos de genótipos do HCV, a presença do alelo +3027C foi associada ao subtipo 1a do HCV (P=0,0109). Adicionalmente, a presença do genótipo C/C na posição +3027 também foi significantemente associada com o subtipo 1a do HCV (P=0,0015). Ainda, o alelo A do SNP +3187 foi significantemente associado com os outros genótipos do HCV, excluindo o 1a (P=0,0369). Embora não esteja totalmente esclarecida a função do gene HLA-G, estudos têm sido desenvolvidos para melhor elucidar sua função nos contextos fisiológicos, como gestação, e patológicos, como tumores, transplantes, doenças inflamatórias e infecciosas. Tais estudos procuram ampliar o conhecimento sobre o sistema imunológico e contribuem para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas. Os resultados do presente estudo contribuem para a ampliação do conhecimento sobre os polimorfismos da região 3\' NT do gene HLA-G, na coinfecção HIV/HCV. Como também, na melhoria da assistência de enfermagem que deve buscar reduzir a morbimortalidade pela referida patologia. Porém, ainda há um longo percurso a ser percorrido na compreensão dos fatores imunogenéticos envolvidos na coinfecção pelo HIV/HCV / The general objective of the research was to associate the polymorphism of the gene HLA-G (region 3\' NT) with the co-infection HIV/HCV and with the groups (HIV, HCV and healthy control). It is a cross-sectional, comparative, descriptive study. 560 individuals participated of the study, being 156 healthy control individuals, 102 co- infected HIV/HCV, 186 infected by HIV and 116 by HCV. For identifying the polymorphisms, the genomic DNA was extracted from the total blood and the genotyping was made by PCR and visualized in gel of polyacrylamide at 7%, in which the polymorphism of 14pb was identified, and by sequencing the other seven SNPs. The social demographic results point that the most of the sample was composed by male adult individuals. Regarding the color of the skin, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, a bigger number of co-infected with black skin and brown-skinned was observed than in the mono infected (P=0,0001). Regarding to the category of exposition for acquisition of the HIV, in the comparison between the groups HIV and HIV/HCV, a significant difference was observed in the transmission through heterosexual exposition, being its frequency bigger in the group HIV (P=0,0000). In the case of the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the difference in the heterosexual transmission was also observed, being its frequency significantly higher in the group HIV/HCV (P=0,0001). About the finding related to the genotype of the HCV, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the genotype 1a presented higher frequency in the co- infected (P=0,0001). Regarding to the viral load of the HIV, in the comparison between the groups HIV and HIV/HCV, the group of the mono infection presented bigger viral load that the group of the co-infection (P=0,0350). Regarding to the level of hepatic fibrosis, in the comparison between the groups HCV and HIV/HCV, the group of co-infection has a lighter fibrosis that the group of the mono infection (P=0,0009). Regarding to the genetic polymorphisms of the region 3\' NT of the HLA-G, it was found that the genotype of heterozygosis Del/Ins of 14 pb, presented significant difference in the individuals co-infected by the HIV/HCV (P=0,0216) when compared with the control group. About the SNP +3003, the comparison of the groups HCV and healthy control, it was showed that the allele +3003T presented a significant higher frequency in the group HCV (P=0,0147); the genotype +3003C/T presented a higher frequency in the control group (P=0,0095); the genotype +3003T/T was bigger in the group HCV (P=0,0095). The comparison between the groups HIV and HCV showed that the frequency of the allele +3003C was bigger in the group HIV (P=0,0463); and the genotype +3003T/T presented a bigger frequency in the group (P=0,0494). The frequency of the genotype +3187A/A was bigger in the group HIV/HCV in comparison to the HIV (P=0,0193); and of the +3187A/G was bigger in the group HIV (P=0,0187). The genotype +3196C/G presented frequency significantly bigger in the group HIV than in the healthy control (P=0,0213). The UTR-10, in comparison between the groups HIV and control, showed bigger frequency in the group HIV (P=0,0044); when compared the groups HIV/HCV and HIV, frequency was bigger in the group HIV (P=0,0300) and in the comparison between the groups HIV and HCV, its frequency was also bigger in the group (P=0,0140). The UTR-4, in the comparison of the groups HCV and healthy control, revealed a bigger frequency in the control group (P=0,0147). The UTR-9, in comparison of the groups HIV/HCV and HIV, showed bigger frequency in the group HIV/HCV (P=0,0460). Regarding to the clinical data, the presence of the allele T in the position +3035, was significantly associated to bigger viral load of the HCV, above 400.000 copies /mL (P=0,0244). About the types of genotypes of the HCV, the presence of the allele +3027C was associated with the subtype 1a of the HCV (P=0,0109). Additionally, the presence of the genotype C/C in the position +3027 was also significantly associated with the subtype 1a of the HCV (P=0,0015). Still, the allele A of the SNP +3187 was significantly associated with the other genotypes of the HCV, excluding the 1a (P=0,0369). Although the function of the gene HLA-G, is not totally clarified, studies have been developed for better elucidate its function in the physiological contexts, like gestation, and pathological, such as tumours, transplants, infectious and inflammatory diseases. These studies aim to extend the knowledge about the immunological system and contribute for the development of new diagnostic and therapeutic strategies. The results of this study contribute for enhancement of the knowledge about the polymorphisms of the region 3\' NT of the gene HLA-G, in the co-infection HIV/HCV. As well as, in the improvement of the assistance of nursing that must seek reducing the morbid mortality by the pathology referred. However, there is still a long path to be followed in the comprehension of the immunogenic factors involved in the co-infection by the HIV/HCV

The chimeric Alb-uPA SCID mouse that has been transplanted with human hepatocytes is a model to facilitate in vivo study of HCV. We explored further development of the model by using repopulation with immortalized human hepatocytes (IHH) in place of primary human hepatocyte (PHH) transplantation to support HCV infection. In vitro HCV studies typically utilize a human hepatoma cell line (Huh7) and rely on transfection with transcribed genomic RNA derived from a unique HCV strain (JFH1). Unfortunately, this system has not been successful in support of infection with serum-derived HCV (HCVser). IHH may offer an alternative since their differentiation status remains close to that of PHH. IHH transfected with HCV RNA (H77 or JFH1) or infected with HCVser showed stable intracellular and supernatant HCV RNA by real-time RT-PCR. IHH showed intracellular HCV NS3 proteins. HCV transfected or infected IHH secrete infectious HCVcc for in vivo and vitro. / Experimental Surgery

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Zwischen August 1978 und März 1979 wurden in der DDR durch viruskontaminiertes Anti-D-IgG 2867 Frauen mit HCV-Genotyp 1b infiziert, von denen 427 Frauen aus dem Leipziger Raum stammen. Diese Arbeit untersucht nach über 30 Jahren HCV-Infektion den natürlichen HCV-Verlauf von 356 der 427 Frauen aus dem Leipziger Raum. Ziel dieser Untersuchung ist herauszufinden, ob eine HCV-Infektion mit einer erhöhten Leberzirrhoserate bzw. erhöhten Mortalitätsrate einhergeht. Dabei stellen die 356 Frauen in dieser Untersuchung die Gesamtkohorte dar. In die Auswertung der Teilkohorte konnten 181 der 356 Frauen eingeschlossen werden, die im Zeitraum von 2005-2011 mindestens einmal untersucht und von denen aktuelle klinische und laborchemische Parameter erhoben wurden. Patientinnen mit HC-Viruspersistenz wurden z. T. mehrfach untersucht. Von der Gesamtkohorte wurden alle vorhandenen Leberbiopsien, serologische und molekularvirologische Daten wie anti-HCV, HCV-PCR und Viruslast, Leberzirrhose-Eintritt, Todesfälle, Formen der akuten Hepatitis-C-Infektion (ikterisch, anikterisch, asymptomatisch) erfasst. Die bestehenden Daten der Gesamtkohorte waren Grundlage für die Berechnung der Gesamt-Leberzirrhoserate und Gesamtmortalität sowie für die Erstellung der Kaplan-Meier-Kurven und Überlebenstabellen. Dabei wurde in den Überlebenskurven der Eintritt einer Leberzirrhose bzw. der Tod als Ereignis definiert. Für die Auswertung der Teilkohorte (n=181/356) wurden zusätzlich laborchemische Parameter (u. a. Transaminasen), Komorbiditäten (BMI, Diabetes mellitus, Steatosis hepatis), Koinfektionen, FibroScan-Werte, IL28 rs 12979860 Polymorphismus bzw. durch Anamnesebögen bestehender Alkoholkonsum, Medikation, Begleiterkrankungen bzw. subjektive Beschwerden, ermittelt. Bei mehreren Alanin-Aminotransferase-Werten (ALAT-Werten) wurde der Verlauf über fünf Jahre klassifiziert als ständig normwertig, fluktuierend, ständig erhöht und erhöht aufgrund hepatotoxische Einflüsse, die nicht allein HCV-bedingt sind (z. B. durch Alkoholkonsum, Steatosis hepatis, Medikation, Cholestase). In dieser Untersuchung wurden drei Gruppen untereinander verglichen. Patientinnen mit einem akut selbstlimitierenden Verlauf bzw. Patientinnen ohne HCV-Nachweis stellen die Kontrollgruppe (HCV-RNA negative Gruppe) dar, in der Annahme, dass die nur kurz verweilende Hepatitis-C-Infektion bei den akut selbstlimitierenden Verläufen keinen wesentlichen Einfluss auf die Überlebensrate hat. Die HCV-RNA positive Gruppe setzt sich aus therapienaiven HCV-Infizierten und antiviral therapierten HCV-Infizierten zusammen, die keine sustained virological response (SVR) erreicht haben, sogenannte Non-Responder. Diese HCV-RNA positive Gruppe soll das Risiko des weitgehend natürlichen Hepatitis-C-Verlaufes darstellen. Zu der Gruppe mit SVR zählen Patientinnen, die sechs Monate nach einer erfolgreichen antiviralen Therapie weiterhin HCV-PCR negativ sind. Patientinnen mit einer SVR wurden gesondert betrachtet, um einen zu starken Einfluss auf den natürlichen HCV-Verlauf auszuschließen. Dabei war die antivirale Ansprechrate mit Erreichen einer SVR in der Teilkohorte mit 60,1% höher als vorbeschrieben. Eine akute Hepatitis-C konnte bei 279/356 Patientinnen eruiert werden, von denen 82/270 (29,4%) einen ikterischen Verlauf aufwiesen. Dabei wird ein homozygoter CC-Polymorphismus mit einem ikterischen Verlauf und mit einer spontanen Viruselimination assoziiert. Unter Ausschluss der Patientinnen ohne HCV-Nachweis entwickelten 173/329 (53%) eine chronische Hepatitis-C. Das durchschnittliche Alter bei Infektion betrug 24 (16-38) Jahre und zum Zeitpunkt der Studie 54 (46-71) Jahre. Von der Teilkohorte waren 154/181 Frauen (85,1%) weiterhin anti-HCV positiv und bei 59/181 Frauen (32,6%) wurde HCV-RNA detektiert. Die Hälfte der Frauen (92/181; 50,8%) hatten permanent normwertige ALAT-Werte und bei 51/181 Frauen (28,2%) wurden fluktuierende ALAT-Werte ermittelt. Nur 38/181 Frauen (21%) wiesen permanent erhöhte ALAT-Werte auf, die v. a. bei HCV-RNA positiven Patientinnen nachgewiesen wurden, welche mit einer erhöhten Leberzirrhoserate assoziiert werden (p=0,001). Ein weiterer Leberzirrhose-assoziierender-Kofaktor ist ein bestehender Diabetes mellitus (p=0,013). Zusätzlich wird ein Diabetes mellitus mit einem vermehrten Auftreten von Steatosis hepatis (p=0,005) in Verbindung gebracht. Ein Zusammenhang zwischen Steatosis hepatis und erhöhte Leberzirrhoserate besteht hingegen nicht (p=0,839). In allen Gruppen ist mit steigendem Alter ein Zuwachs an Adipositas (32%), Diabetes mellitus (7,7%) und Steatosis hepatis (25,4%) vorhanden. Jedoch konnte bisher kein wesentlicher Einfluss auf die Leberzirrhoserate bzw. Mortalitätsrate bei HCV-RNA positiven Patientinnen nachgewiesen werden. Dennoch sollten Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion auf eine Diabetes mellitus Manifestation getestet werden, um ggf. eine antivirale Therapie bei erhöhtem Leberzirrhose-Risiko zu beginnen. In künftigen Studien sollten diese Parameter mehr berücksichtigt werden, um einen möglichen Einfluss auf die Leberzirrhoserate feststellen zu können. Erwartungsgemäß weisen HCV-RNA positive Patientinnen einen höheren intrahepatischen Inflammations- und Fibrosegrad auf als HCV-RNA negative Patientinnen. Vor allem ist ein starker Anstieg an Leberzirrhosen bei den HCV-RNA positiven Frauen ab einem Lebensalter über 50 Jahre zu erkennen. Dennoch ist die Gesamtzirrhoserate 32 Jahre nach HCV-Infektion mit nur 6,45% (22/341) erstaunlich niedrig. Eine Erklärung ist, dass durch den exakt bekannten Infektionszeitpunkt dieser Untersuchung das gesamte HCV-Spektrum (Genotyp 1b), inklusive aller akut selbstlimitierenden Verläufe, Patientinnen ohne HCV-Nachweis und Patientinnen mit einer chronischen Hepatitis-C, erfasst wurde. Somit konnte eine einseitige Patientenselektion zu Gunsten fortgeschrittener Leberfibrosen von chronischen Hepatitis-C-Patientinnen vermieden werden. Ein weiterer Vorteil liegt in dem jungen Infektionsalter mit resultierenden geringen Komorbiditäten, die den natürlichen HCV-Verlauf beeinflussen könnten. Dennoch ist mit zunehmender Studienlänge eine steigende Unterrepräsentation an Patientinnen mit akut selbstlimitierenden Verläufen zu verzeichnen, die im Gegensatz zu den Patientinnen mit chronischer Hepatitis, bei fehlender Symptomatik nicht mehr kontinuierlich den Arzt konsultieren. Dadurch ist in der Teilkohorte der Anteil an fortgeschrittenen Leberzirrhosen mit 12/181 (6,6%) Präzirrhosen und 16/181 (8,8%) Leberzirrhosen erhöht. Dabei sind sieben Frauen mit einer Präzirrhose und 11 Frauen mit einer Leberzirrhose HCV-RNA positiv. Werden die Patientinnen mit einer SVR ausgeschlossen, erhöht sich die Zirrhoserate in der Teilkohorte auf 9,8% und in der Gesamtkohorte auf 6,9%. Die „wahre“ Leberzirrhoserate liegt womöglich zwischen diesen Prozentsätzen. Überraschenderweise besteht bisher keine erhöhte Mortalität bei HCV-RNA positiven Patientinnen im Vergleich zu HCV-RNA negativen Patientinnen, obwohl die Leberzirrhoserate bei den HCV-RNA positiven Patientinnen signifikant erhöht ist (Log-Rang: p=0,001). Insgesamt sind 14 von 349 Frauen (4%) verstorben, von denen acht nicht-HCV-assoziiert waren. Bedingt durch den verstärkten Einsatz von Dualtherapien mit Peg-Interferon und Ribavirin nimmt der Anteil chronisch HCV-Infizierter zu Gunsten der Patientinnen mit SVR kontinuierlich ab. Dennoch sind Leberzirrhosen und Todesfälle in der Gruppe mit SVR zu verzeichnen, die als Spätkomplikation einer durchlebten HCV-Infektion gewertet werden sollten, um eine weitere Patientenselektionen zu verhindern. Durch eine SVR sind normwertige Transaminasen bzw. regrediente Inflammations- bzw. Fibrosegrade zu erreichen. So haben von der Teilkohorte 36/48 (75%) der Patientinnen mit SVR normwertige ALAT-Werte. Die Zirrhoserate von Patientinnen mit SVR liegt 32 Jahre nach HCV-Infektion mit 11,5% signifikant unter der von HCV-RNA positiven Patientinnen mit 30%. Dennoch lässt sich eine erhöhte Überlebenswahrscheinlichkeit von Patientinnen mit SVR gegenüber HCV-RNA positiven Patientinnen momentan nicht belegen. Die nächsten 10 bis 20 Jahre werden eine richtungsweisende Aussage über die Überlebenskurven zeigen. Dafür sind weitere Langzeitstudien nötig. Jedoch wird es zukünftig immer schwieriger werden die Kohorte weiterzuverfolgen. Der Grund liegt in der anhaltenden Abnahme der untersuchten Patientinnen, bedingt durch Umzug, Namens- oder Arztwechsel. Zusammenfassend ist nach über 30 Jahren HCV-Infektion nur ein mäßiger Anstieg an Leberzirrhosen in einer weiblichen Population mit jungem Infektionsalter zu verzeichnen. Jedoch sollte bei zu erwartendem stärkeren Anstieg an Leberzirrhosen, bei HCV-RNA positiven Patientinnen ab einem Alter über 50, eine frühzeitige antivirale Therapie erwogen werden.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-14Bitstream added on 2014-06-13T18:31:21Z : No. of bitstreams: 1 yamasaki_lht_me_sjrp.pdf: 6194517 bytes, checksum: 350d37acd1e46ef2885eecc1354a317c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) é considerada um grande problema de saúde pública, desde a sua descoberta em 1989. Entretanto a terapia mais utilizada atualmente, baseada no uso de Peginterferon, tem sucesso em aproximadamente 50% dos pacientes com o genótipo 1. Embora os mecanismos envolvidos nesta resistência viral ainda não sejam esclarecidos, sugere-se que fatores virais e do hospedeiro participam deste. A proteína não-estrutural 5A (NS5A) está envolvida em diversos processos celulares e é um componente essencial para o HCV. Entretanto, sua estrutura e função ainda não foram bem elucidadas. A partir destes fatos, os objetivos do presente estudo foram elaborar um modelo teórico da NS5A e investigar as propriedades estruturais e funcionais in silico. Foram analisadas 345 sequências da proteína NS5A do HCV de 23 pacientes infectados com o genótipo 1 ou 3. As composições de aminoácidos e de estrutura secundária demonstraram que há diferença entre os genótipos, podendo indicar que há diferenças nas interações proteína-proteína entre os genótipos, o que pode estar relacionado com a diferença da taxa de resistência ao tratamento. A análise funcional foi realizada com o ProtFun, que sugeriu que a NS5A estaria envolvida nas funções celulares de metabolismo intermediário central, tradução, crescimento, tranporte, ligação e hormônio. Estas funções variaram entre os domínios, suportando a hipótese de que a NS5A é uma proteína multifuncional. A análise pelo PROSITE indicou vários sítios de glicosilação, fosforilação e miristoilação, que são altamente conservados e podem ter função importante na estabilização da estrutura e função, sendo assim possíveis alvos de novos antivirais. Alguns deles estão em regiões relacionadas com a resposta ao tratamento. Outro... / Hepatitis C virus (HCV) infects almost 3% of people worldwide and it is considered the main cause of liver chronic diseases and transplants. Until today, there is no effective vaccine and the current most used therapy, based on Peginterferon, is successful only in 50% of patients infected by genotype 1. Although the outcomes of this treatment resistance are unclear, it is suggested host and virus factors may participate in this mechanism. Non-structural 5A (NS5A) protein is involved in several cellular and virus processes and it is a critical component of HCV. However, its structure and function are still uncertain. Regarding these facts, the present study attachments were to elaborate a model of the NS5A protein and to investigate NS5A structural and functional features, using in silico tools. It was analyzed 345 sequences of HCV NS5A protein from 23 patients infected by genotypes 1 or 3. Residues and secondary structure composition of all sequences demonstrated that there are differences between genotypes. It may indicate that there are differences in interactions between genotypes, which could be related with the distinct average of treatment resistance. In addition, among those that varied between genotypes, there were amino acids in regions that studies suggested as related with virus persistence. Functional analysis was performed with ProtFun. It suggested that NS5A is involved with central intermediary metabolism, translation, growth, transport, ligation and hormone functions in the cell. These functions vary between the domains, strengthening the hypothesis that NS5A is a multifunctional protein. Prosite motif search indicated that there are many glicosilation, fosforilation and myristoilation sites, which are highly conserved and may play an important role in structural stabilization and... (Complete abstract click electronic access below)