Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor affecting children. The transcription factors MYCN and SOX9 are associated with initiation, maintenance and recurrence of MB and are also connected to more aggressive tumors. In this study, a ChIP was performed to isolate DNA from genes that are transcriptionally regulated by these proteins. Identification of these target genes will reveal new potential drug targets and help us better understand the functions of MYCN and SOX9. The ChIP was not fully optimized during this project and the target genes were not sent for sequencing and identified. To study the connection between SOX9 and recurrence, cells with different levels of SOX9 were treated with drugs, after which cell viability was measured. No significant difference in resistance could be measured. Change in expression level of MYCN, SOX9 and other relevant genes after drug treatment was also studied. The results show an increase in SOX9 and HES1, suggesting that these genes are involved in tumor recurrence.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13364号 / 論医博第2206号 / 新制||医||1045(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 高橋 淳, 教授 髙橋 良輔, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19224号 / 医博第4023号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32223 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 稲垣 暢也, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La voie de signalisation Notch joue un rôle essentiel dans le développement et l'homéostasie de l’épithélium intestinal et présente un potentiel oncogénique dans le cancer du côlon (CRC). L'un de ses gènes cibles, HES1, est un répresseur transcriptionnel de divers gènes, dont KLF4, facteur impliqué dans l'homéostasie intestinale et qui favorise la différenciation des cellules à mucus. De plus, afin d’éviter une activité aberrante de la voie Notch, HES1 exerce une boucle de rétrocontrôle négative sur son propre promoteur. Notre laboratoire s’intéresse à RIP140, un corégulateur transcriptionnel qui réprime l'activité de nombreux facteurs de transcription impliqués dans divers processus physiopathologiques. Dans l'épithélium intestinal, RIP140 inhibe la prolifération cellulaire et régule la différenciation en cellules de Paneth. L'objectif de ce travail a été d'étudier le dialogue entre RIP140 et la voie de signalisation Notch/HES1 ainsi que son impact sur différents paramètres cellulaires en utilisant différentes lignées cellulaires cancéreuses colorectales humaines ainsi que des modèles murins présentant une invalidation du gène Rip140. Pour cela, diverses expériences ont été mises en place en utilisant le gène HES1 comme principal marqueur d’activation de la voie Notch dans les lignées cellulaires de CRC SW620 et HT29. L’expression du gène HES1 a été analysée au niveau protéique, ARNm et transcriptionel en utilisant respectivement les techniques de Western-blot et d’immunofluorescence, de RT-QPCR et de gène rapporteur luciférase. L'activité de la voie Notch a été modulée par l'expression ectopique du domaine intracellulaire de récepteur Notch (NICD) ou en utilisant un inhibiteur de la γ-sécrétase. Le dialogue entre RIP140 et la voie de signalisation Notch est étroitement lié au niveau d'activation de la voie Notch et au niveau d’expression du facteur de transcription HES1. A de faibles niveaux d’activité de la voie Notch, RIP140 est une cible négative de NICD et exerce un effet positif sur la transcription du gène HES1 qui implique, au moins en partie, le complexe RBPJ/NICD. A de niveaux élevés d’activé de la voie Notch, RIP140 devient une cible positive de HES1 et exerce un effet négatif sur la transcription de ce gène en contribuant à la boucle de rétrocontrôle négative de HES1. De manière intéressante, comme le gène HES1, RIP140 a un impact important sur différents paramètres cellulaires. En effet, RIP140, est non seulement capable d’inhiber la prolifération des cellules intestinales, mais est également capable d’augmenter l'expression du gène KLF4 et de favoriser la différenciation en cellules à mucus. Conformément à ce dialogue entre RIP140 et la voie Notch/HES1, nous avons ensuite montré que HES1 et RIP140 inhibent mutuellement leurs effets sur la différenciation et la prolifération cellulaires. Nos données démontrent ainsi l'existence d'une boucle de rétrocontrôle impliquant RIP140 et la voie Notch/HES1 dans les lignées cellulaires de CRC. En effet, le gène RIP140 est à la fois une cible et un régulateur de la voie de signalisation Notch/HES1. Une activité aberrante de la voie Notch bascule la régulation de l'expression du gène HES1 par RIP140 d'un effet positif à un effet négatif via la boucle de rétrocontrôle négative de HES1. De plus, ce lien puissant entre RIP140 et HES1 a un impact sur la différenciation et la prolifération cellulaires. Il sera nécessaire d’analyser le recrutement de RIP140 et HES1 sur différents promoteurs cibles et de valider l'impact de ce dialogue in vivo, en utilisant un modèle de souris que j’ai développé au sein du laboratoire et qui présentent une invalidation conditionnelle du gène Rip140 dans l'épithélium intestinal. / The Notch signaling pathway plays an essential role in intestinal development and homeostasis and has an oncogenic potential in colon cancer (CRC). One of its target genes HES1 is a transcription repressor of a number of genes, including KLF4, which is implicated in intestinal homeostasis and promotes Goblet cell differentiation. In addition, to avoid aberrant activity of the Notch pathway, HES1 exerts a negative feedback loop on its own promoter. Our laboratory is studying RIP140, a transcriptional coregulator which represses the activity of many transcription factors involved in various pathophysiological processes. In the intestinal epithelium, RIP140 inhibits cell proliferation and regulates differentiation towards the Paneth cell lineage. The goal of this work was to investigate the crosstalk between RIP140 and the Notch/HES1 pathway and to study its cellular impacts in human CRC cells. Various experiments have been set up using the HES1 gene as the main output of the Notch pathway in two CRC cell lines (SW620 and HT29). HES1 gene expression has been assessed at the protein, mRNA and transcriptional levels using western-blot/immunofluorescence, RT-QPCR and luciferase reporter assays, respectively. The activity of the Notch pathway has been modulated through ectopic expression of the Notch intracellular domain (NICD) or using a γ-secretase inhibitor. RIP140 crosstalk with the Notch signaling pathway is tightly related to the level of activation of the Notch pathway and to the level of HES1 expression. At low Notch activity, RIP140 is a negative target of NICD and exerts a positive effect on HES1 gene transcription which involves, at least partly, the RBPJ/NICD complex. When the Notch pathway is fully activated, RIP140 becomes a positive target of HES1 and exerts a negative effect on HES1 gene transcription by contributing to the HES1 negative feedback loop. Interestingly, as it is the case for HES1, RIP140 has a strong impact on different cellular parameters. Indeed, we found that RIP140, not only decreases intestinal cell proliferation, but also increases KLF4 gene expression and Goblet cell differentiation. In line with the strong crosstalk between RIP140 and the Notch/HES1 pathway, we then showed that HES1 and RIP140 mutually inhibit their effects on cell differentiation and proliferation. Altogether, our data demonstrated the existence of a feed-back loop involving RIP140 and the Notch/HES1 pathway in CRC cells. Indeed, the RIP140 gene is both a target and a regulator of the Notch/HES1 signaling pathway. A high level of Notch/HES1 activity switches the regulation of HES1 gene expression by RIP140 from a positive to a negative effect through the HES1 negative feedback loop. Moreover, this strong link between RIP140 and HES1 has an impact on cell differentiation and proliferation. It would be however interesting to demonstrate the recruitment of each factor on target promoters and to validate the impact of this strong crosstalk, in vivo, using the newly mouse model that I developed with a conditional knock-out of the Rip140 gene in the intestinal epithelium.

La dédifférentiation du chondrocyte peut être provoquée par le stress mécanique ou cytokinique ainsi que la diffusion des facteurs de croissance dans le cartilage. C’est un élément-clé de la dégradation irréversible qui accompagne l’arthrose (ostéoarthritis, OA). Notre but est de rechercher des mécanismes moléculaires susceptibles d’être des cibles thérapeutiques originales contre cette affection. Or, il a été montré récemment que la voie des récepteurs Notch est fortement exprimée dans l’OA humaine. Objectifs: Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch /Hes1/Hey1 dans les effets de l’Interleukine-1 β (IL-1β) et du FGF2 sur la dédifférenciation in-vitro des chondrocytes. Méthodes: Des chondrocytes de cartilage articulaire humain ou murin sont mis en culture primaire, puis traités par IL-1β ou FGF2. L’expression de Notch1-R/Hes1/Hey1 est étudiée par immunocytochimie, immunoblot et q-RT-PCR. L’implication de Hes1 dans les effets de l'IL-1β et du FGF2 a été étudiée au moyen d’un siRNA spécifique anti Hes1. Résultats: En normoxie, le marquage de Notch-R1 est localisé à la membrane et dans le cytoplasme des chondrocytes, sans effet des effecteurs. Notch1-R est en revanche nucléaire en hypoxie. L’hypothèse d’un contrôle de la localisation de Notch1-R par la pO2 est confortée par l’inhibition de l’expression de la Préséniline (γ-secrétase) en hypoxie. L’étude des effets des effecteurs sur Hes1 et Hey1 a été réalisée dans les conditions classiques de culture en normoxie. Hes1 est cytoplasmique mais passe dans le noyau sous l’effet de l’IL1β ou de FGF2, suggérant la possibilité d’effets transcriptionnels. Les ARNm de Hes1 sont augmentés d’un facteur de 2,5 avec l’IL-1β et de 7-8 avec le FGF2. Hey1 est insensible à l’IL-1β mais augmente de 4-5 fois sous FGF2. Ces effets sont transcriptionnels directement pour Hes1 (DRB-) et indirectement pour Hey1 (DRB+). Ils passent par la voie NF-κB pour les deux facteurs mais en plus par p38 MAP pour le FGF2. L’induction de Hes1 est insensible au DAPT, inhibiteur de la γ-sécrétase, donc indépendant d’une activation de novo du Notch-R1. L’utilisation d’un siRNA spécifique contre Hes1 montre que l’induction de Hey1 par FGF2 dépend de Hes1 et permet de vérifier l’influence de Hes1 dans la modulation des marqueurs phénotypiques. Hes1 est impliqué dans l’induction par IL-1β de l’expression de MMP13 et ADMTS-5. Hes1 est aussi le médiateur de l’induction par le FGF2 des messagers de la MMP13 (en partie) et de l’isomère Col2A. La protéine Col2A immature est normalement absente du cartilage de souris post-natale, où Col2B est l’isoforme essentielle du collagène de type 2. A l’inverse, le cartilage de souris vieillissante réexprime Col2A, comme cela a été montré dans le cartilage arthrosique chez l’homme. Conclusion: Hes1 est le médiateur des effets d’IL-1β et du FGF2 sur la dédifférentiation in-vitro des chondrocytes (Col2A, MMP13). La voie de Hes1 apparaît donc comme une cible valide pour de nouvelles thérapeutiques contre la dégradation chondrocytaire et donc les maladies dégénératives du cartilage. / Chondrocyte dedifferentiation is a key element of irreversible cartilage degradation induced by mechanical or cytokinic stress, or growth factors, as in degenerative osteoarthritis (OA). Our goal is to search for new therapeutical targets within this process, and Notch signaling has been reported to be strongly expressed during human OA. Objectives: To investigate the involvement of the Notch1/Hes1/Hey1 pathway as mediators of interleukin 1 β (IL-1β) and FGF2 in chondrocytes in vitro. Methods: Mouse or human articular chondrocytes were established in primary culture then challenged with IL-1β or FGF2. Notch-R1, Hes1/Hey1 and chondrogenic target genes expression was monitored by immunocytochemistry, q-rt-PCR, and immunoblotting. Hes1 involvement in IL-1β/FGF2 induced gene expression was investigated with a specific siRNA against Hes1. Results: In normoxia, Notch1-R labeling remained nuclear and stable in intensity in chondrocytes, irrespective of treatment. This suggested steady-state activation of this pathway. In contrast, Notch1-R labeling was located almost exclusively at the membrane or cytoplasm of chondrocytes in hypoxia, irrespective of treatment. Notch-R1 activation may thus be, at least in part, regulated by pO2 as supported by the inhibition of γ-secretase (Presenilin1) expression in hypoxia versus normoxia. In normoxia, addition of IL1β or FGF2 to the cells induced Hes1 translocation to the nucleus, suggesting the possibility of transcriptional effects. This was associated with a transient increase of Hes1 mRNA cyclic expression with mechanistic differences between the two effectors. Hes1 mRNA was increased 2.5-fold by IL-1β and 7-8-fold by FGF2. IL-1β elicited a loss of cyclicity in Hes1 expression while FGF2 conserved the cycles, akin to the effect of serum. These effects were transcriptional and occurred through NF-κB for both effectors but only through the p38 pathway for FGF2. Hey1 expression was not modified by IL-1β, while a 4-5 fold transient increase was observed with FGF2, always posterior to the Hes1 peak. Hey induction by FGF2 was transcriptional and depended on Hes1 expression (DRB). Hes1/ Hey inductions by IL-1β or FGF2 were insensitive to DAPT, a γ-secretase inhibitor, confirming the independence from novel activation of Notch-R. Hes1 expression was silenced by a specific siRNA, showing that the FGF2-induced Hey1 expression is under Hes1 control and ascertaining the role of Hes1 in chondrocyte phenotype modulations. Hes1 mediated IL-1β induction of MMP-13 and ADAMTS-5. Hes1 also mediated FGF2 up-regulation of MMP13 (partly) and Col2A isomer expression. Col2A is normally absent in post-natal mice cartilage, Col2B being the essential isoform of Type 2 collagen. Conversely, aging mice cartilage re-expresses Col2A abundantly as shown for human OA cartilage. Conclusion: Hes1 mediates IL-1β and FGF2 modulations of dedifferentiating chondrocyte phenotype (MMP13, Col2A). Thus the Hes1 pathway appears a valid target for therapeutical research on chondrocytes dedifferentiation, hence degradative cartilage diseases.

Résumé: La réactivation de la voie Notch est une des caractéristiques les plus redondantes observées au cours de la carcinogenèse pancréatique. L’expression aberrante de la protéine HES1, cible de la signalisation Notch, est observée dès les premières phases de la carcinogenèse (Miyamoto et al., 2003). L’utilisation d’inhibiteurs de gamma-sécrétase semble être une stratégie thérapeutique prometteuse soutenue par de nombreuses études in vitro et in vivo (Plentz et al. 2009). Cette étude vise à démontrer que l’inhibition de la voie Notch et particulièrement de sa protéine cible, HES1, permet de réduire les propriétés tumorigéniques des cellules cancéreuses pancréatiques humaines. Pour cela, nous avons utilisé deux lignées cellulaires issues d’adénocarcinomes pancréatiques humains : MIAPaCa-2 et BxPC-3 ; celles-ci ont été traitées avec des inhibiteurs de gamma-sécrétase et infectées par des lentivirus codant pour des shARNs ciblant de manière spécifique les ARNm de Notch1 ou Hes1. Nos RÉSULTATS démontrent que les cellules BxPC-3 présentent un plus fort niveau d'activation de NOTCH1 qui corrèle avec un plus fort niveau d'expression d’HES1 comparativement aux cellules MIAPaCa-2. L’inhibition de la voie Notch réduit la prolifération des cellules BxPC-3 sans affecter celle des cellules MIAPaCa-2 ni même la survie cellulaire des deux lignées. De plus, on observe une diminution de la migration des cellules BxPC-3 suite à l’inhibition de la voie Notch. Notre étude suggère, d'une part, que l’efficacité des inhibiteurs de gamma-secrétase ne dépend pas seulement de l’expression des récepteurs NOTCHs mais principalement de leur niveau d'activation. Et, d’autre part, une implication directe et majeure de la protéine cible HES1 dans la médiation des effets de la voie Notch.||Abstract:

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21991号 / 医博第4505号 / 新制||医||1037(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武田 俊一, 教授 坂井 義治, 教授 松田 道行 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22318号 / 医博第4559号 / 新制||医||1041(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邉 大, 教授 林 康紀, 教授 伊佐 正 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22639号 / 医博第4622号 / 新制||医||1044(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 林 康紀, 教授 伊佐 正, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第23424号 / 医科博第129号 / 新制||医科||9(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 林 康紀, 教授 伊佐 正, 教授 高橋 淳 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM