La famille des protéines MTA (Metastasis Tumor Antigen) compte trois membres MTA1, 2 et 3 qui diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, une région désorganisée. La région N-terminale est impliquée dans l’interaction avec le complexe corépresseur NuRD. NuRD est recruté par des facteurs de transcription au niveau de leurs gènes cibles pour réprimer la transcription. Les protéines HIC1 et BCL11 recrutent le complexe NuRD via les protéines MTA afin de réprimer leurs gènes cibles.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux modalités d’interactions entre les protéines HIC1 et BCL11 interagissant toutes deux avec l’extrémité C-terminale des protéines MTA. Dans ce cadre, nous avons montré que l’interaction HIC1-BCL11 ne semble pas jouer un rôle direct dans la régulation synergique de gènes cibles communs. Ensuite, nous avons montré que les protéines BCL11 interagissent avec les trois protéines MTA via leur motif N-terminal conservé MSRRKQ pour recruter différents complexes NuRD. De plus, la phosphorylation de la Sérine 2 de BCL11B médiée par PKC (Protein Kinase C) lors de l’activation des lymphocytes T CD4+, régule son activité de facteur de transcription. De plus, nous avons identifié CXCL12/SDF1 comme nouveau gène cible de HIC1 dans les lymphocytes T CD4+. Cette chimiokine est le ligand commun aux récepteurs CXCR4 et CXCR7 impliqués dans la migration et le « homing » des cellules de l’immunité. Enfin, nous avons également identifié deux nouveaux gènes cibles de HIC1 : ApoER2 et VLDLR codant tous deux des récepteurs à la Reelin. Cette voie de signalisation est impliquée dans la migration des précurseurs neuronaux lors du développement du cervelet. / MTA (Metastasis Tumor Antigen) proteins family is composed of three members: MTA1, 2 and 3 which differ in their C-terminus, a disorganized domain. The N-terminal region is involved in the interaction with the NuRD corepressor complex. NuRD is recruited by transcription factors at their target genes to repress transcription. HIC1 and BCL11 proteins recruit NuRD through interaction with MTA proteins to repress their target genes. In the first part of my work, we have deciphered the mechanisms of interactions between HIC1 and BCL11 proteins which both also interacted with MTA proteins. In this context, we showed that HIC1-BCL11 interaction does not allow the direct synergistic repression of common target genes. In the second part of my work, we showed that BCL11 proteins interact with the three MTA members via their conserved MSRRKQ motif to recruit NuRD complexes. Furthermore, we identified the PKC (Protein Kinase C)-mediated phosphorylation of BCL11B Serine 2 which regulates its transcription factor’s activity during activation of human CD4+ T lymphocytes. In fact, the phosphorylation of BCL11B Serine 2 allows the switch from a transcriptional repressor to an activator during TCR activation of human CD4+ T cells. In parallel to this work, we identified SDF1 as a new direct target gene of HIC1 in these cells. The SDF1 chemokine is the common ligand for chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 involved in the migration and in the homing of immune cells. In addition, we also identified two other new direct target genes of HIC1: ApoER2 and VLDLR encoding both receptors for Reelin. This signaling pathway is involved in the migration of neuronal precursors during cerebellar development.

Le gène HIC1 a été caractérisé comme un gène suppresseur de tumeur situé en 17p13.3, une région hyperméthylée ou délétée dans de nombreux cancers. HIC1 code un répresseur transcriptionnel caractérisé par plusieurs domaines fonctionnels. Au niveau de la région centrale, se retrouve un motif conservé MK314HEP important pour la répression des gènes cibles de HIC1 au sein duquel la Lysine 314 est soit SUMOylée soit acétylée. HIC1 est au centre de boucles de régulation complexes mettant en jeu le gène suppresseur de tumeurs TP53 et la désacétylase SIRT1. En réponse aux cassures double brin de l’ADN (DSBs) non réparables, HIC1 réprime l’expression de SIRT1 favorisant ainsi l’apoptose médiée par p53. De plus, dans ces conditions on observe une augmentation de la SUMOylation de la Lysine 314 de HIC1 de manière dépendante de la kinase ATM, ce qui favorise l’interaction avec le complexe répresseur NuRD. HIC1 joue également un rôle dans la réparation des DSBs. Nous avons montré que la SUMOylation de HIC1 n’était pas nécessaire pour la réparation des DSBs. Grâce à une analyse de protéomique, nous avons identifié un site potentiel de phosphorylation LS694QG par des kinases de la famille PIKK. Ainsi, nous avons montré dans des fibroblastes humains BJ-hTERT, que la protéine HIC1 est rapidement phosphorylée sur la Sérine 694 par la kinase ATM en réponse aux DSBs. De plus, par la technique de « Comet Assay » nous avons montré que cette phosphorylation est importante pour la réparation.HIC1 jouerait donc un double rôle dans la réponse aux dommages à l’ADN : soit il agirait en tant que répresseur transcriptionnel dans le cas de DSBs non réparables, soit il faciliterait la réparation des DSBs. / The tumor suppressor gene HIC1 is located in 17p13.3, a region frequently hypermethylated or deleted in many cancers. HIC1 encodes a transcriptional repressor characterized by several functional domains. In the central region, the conserved MK314HEP motif is an Acetylation/SUMOylation switch motif centered on K314 which regulates the recruitment of MTA1, a component of NuRD repressor complexes. A regulatory feedback loop between HIC1, SIRT1 and P53 has been described. HIC1 directly represses the transcription of SIRT1, thereby modulating P53-dependent DNA damage responses. Furthermore, after induction of non-repairable DSBs (DNA Double Strand Breaks), we observed a SUMOylation increase dependant on the ATM kinase. Moreover, HIC1 also plays an important role in the repair of DSBs. Furthermore, comet assays with a non SUMOylable HIC1 point mutant (E316A) demonstrated that SUMOylation of Lysine K314 is dispensable for DNA repair. In addition, upon induction of repairable DSBs, we have identified by proteomic analyses, a potential phosphorylation site “LS694QG” for the PIKK family kinases ATM and DNA-PKcs. Moreover, we have shown that HIC1 is rapidly phosphorylated by ATM upon DNA damage induction in normal human fibroblasts (BJ-hTert). Furthermore, comet assays with a non phosphorylable HIC1 point mutant have shown that this phosphorylation is very important for the contribution of HIC1 to the repair of DSBs. Thus, HIC1 plays different role during the DNA damage response to DNA double strand breaks depending on their intensity.

Beyond its essential roles in embryonic development, the Wnt-mediated signal transduction cascade is critically implicated in homeostasis of adult tissues. In the gastrointestinal epithelium, the threshold of active Wnt signaling is kept in a physiological range by a spectrum of regulatory networks and loops, thereby balancing the opposing processes of cell fate determination, proliferation and stem cell self-renewal. Furthermore, compelling evidence undoubtedly link an aberrant Wnt activity to the onset of bowel cancer. Understanding the principle causes and effects secondary to excessive Wnt signaling can provide valuable insights into the pathology of the malignant transformation of the colorectum. The proposed thesis attempts to focus on novel modes of the Wnt pathway modulation; both general and context-specific nuances of the Wnt level adjustment are thereby delineated. The results are presented in three distinct research publications and one review article. The first study examines the contribution of the distinct post-translational modifications, which the Wnt proteins undergo, to their proper processing, secretion and signaling activity. First, we investigated the sequential order and mutual interdependence of cysteine and serine-linked fatty acylation and N-linked glycosylation of murine...

Les multi-thérapies actuelles permettent de maintenir l’infection au VIH-1 sous contrôle, mais malheureusement n’entraînent pas l’éradication du virus du fait de l’existence de réservoirs cellulaires, où le virus est intégré de façon latente. Les cellules microgliales, cibles privilégiées du VIH-1 dans le cerveau, sont les macrophages résidents du système nerveux central et ont été décrites comme un réservoir cellulaire avec une longue durée de vie. Ce genre de cellule, infectée de façon latente, apparaît comme un des principaux obstacles à l’éradication. Ainsi, la compréhension des mécanismes sous-jacents impliqués dans l’extinction de la transcription virale, semble une étape cruciale afin de parvenir à purger ces réservoirs. Notre laboratoire à déjà montré l’importance du répresseur transcriptionnel CTIP2 dans l’établissement et le maintien de la latence dans ces cellules. Dans le cadre de ma thèse je me suis intéressé à deux autres facteurs cellulaires, LSD1 et HIC1. Au cours de mes travaux, j’ai mis en évidence le rôle répresseur de ces protéines sur la transcription virale dans les microglies. LSD1 coopère avec CTIP2 pour promouvoir l’établissement de marques épigénétiques au niveau du promoteur viral pour induire la mise en place d’hétérochromatine. LSD1 est à l’origine du recrutement de CTIP2, mais aussi d’un autre complexe multiprotéique, COMPASS. A la différence de CTIP2 et LSD1, le suppresseur de tumeur HIC1 est un perturbateur du transactivateur viral TAT. HIC1 est préalablement modifié post-traductionnellement par la déacétylase SIRT1 et va ensuite contrecarrer l’activité de TAT afin d’empêcher la réactivation de la transcription du virus. Ainsi, tandis que LSD1 et CTIP2 favorise l’établissement de la latence, HIC1 permet quant à lui d’entretenir cet état du provirus dans les cellules microgliales. Les travaux présentés ici mettent en évidence deux nouveaux facteurs de la restriction de l’expression virale et permettent de définir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les stratégies de purge des réservoirs. / Even though current multitherapies maintain HIV infection under control, they unfortunately do not achieve viral eradication due to the existence of latently infected cell reservoirs. Microglial cells are resident macrophages and the main HIV-1 target in brain. They have been described as a long-lived HIV-1 cell reservoir, and so appear as a one of the main obstacle to viral clearance. Thus, understanding of the mechanisms implicated in the establishment and maintaining of viral latency in these cells is a critical step on the way towards an HIV cure. Our team already demonstrated the implication of the cellular transcription factor CTIP2 in the establishment of HIV-1 silencing. In this work, I present two other cellular factors, LSD1 and HIC1 as new HIV-1 transcriptionnal expression inhibitors in microglial cells. LSD1 cooperates with CTIP2 to promote the establishment of epigenetic marks associated to heterochromatin structure at the viral promoter. LSD1 act as an anchoring plateform for CTIP2, and so the CTIP2-associated mutli-enzymatic chromatin remodeling complex, but also recruits the COMPASS methyltransferase complex. Unlike CTIP2 and LSD1, the tumor suppressor HIC1 disrupts the TAT-mediated transactivation cycle. HIC1 is beforehand modified post-translationnaly by the deacetylase SIRT1 and then counteracts TAT activity in order to limit viral transcription reactivation. Thus, while CTIP2 and LSD1 favour latency establishment, HIC1 maintains provirus silencing in microglial cells. All together, the results presented in this work introduce two new viral expression restriction factors and new potential therapeutic targets in reservoir purge strategies.

The Wnt signaling pathway represents the principal evolutionarily conserved signaling cascade found in all multicellular organisms. It plays a key role not only in many processes during embryogenesis, but also in maintaining tissue homeostasis and regeneration. By contrast, mutations in genes encoding components of the pathway often result in increased activation of Wnt signaling and underlie onset of many human diseases, particularly cancer. The canonical Wnt signaling pathway is essential for proliferation and maintenance of the pluripotent state of intestinal stem cells and thus for homeostatic renewal of the intestinal epithelium. However, aberrant (hyper)activation of the Wnt signaling pathway is the initial step in development of intestinal neoplasia. Understanding the causes and identifying the consequences of the Wnt signaling hyperactivation is crucial for deciphering mechanisms leading to malignant transformation. Although the canonical Wnt signaling pathway has been the subject of scientific studies for several decades, all regulatory mechanisms and consequences of its hyperactivation have not been completely elucidated yet. During my PhD studies, I focused on understanding function(s) of some components and target genes of this signaling cascade. In this theses, results of my first...

The tumor suppressor gene HIC1 encodes a BTB/POZ transcription repressor. Its promotor is frequently hypermetylated in large numbers of tumors. HIC1 also functions as a negative modulator of the Wnt signalling pathway, which fundamentally participates in regulation of stem cell renewal of the intestinal epithelium. Thanks to its structural features the intestinal epithelium represents a convenient model tissue to study stem cells and their pathology. To overcome the embryonic lethality of the complete Hic1 "knock-out" the conditional deletion of the gene in adult mouse tissue was chosen to evaluate the Hic1 biological aktivity. By the chip expression analysis of mouse embryonic fibroblasts we discovered a number of new target genes of Hic1, the most interesting of them - in respect to cancer - we considered the Toll-like receptor 2 gene. The expression of Hic1 target genes is likely to be co-regulated by p53 although the direct regulation wasn't proved. Hic1 affects the proportion of the differentiated intestinal epithelial cells types possibly via regulation of Atoh1. After conditional deletion of Hic1 in the intestinal epithelium we observed and quantitatively confirmed a significant increase of the amounts of goblet cells. We concluded that Hic1 affects differentiation pathways in intestinal...

4 Abstract The Wnt pathway is one of the major signaling cascades contributing to multiple cellular processes during embryogenesis, and adult tissue homeostasis and regeneration. Moreover, aberrant activation of the Wnt signaling pathway is connected with development of neoplasia, notably colorectal cancer. The aim of the thesis was to identify new ways of the Wnt pathway regulation to understand better physiological as well as non-physiological mechanisms of Wnt signaling. The results are summarized in four publications. The first article deals with TROY, a member of tumor necrosis factor receptor family. We identified TROY as a Wnt target gene during our search for Wnt responsive genes in colorectal cancer cell lines. Additionally, we detected expression of Troy in tumors of two mouse models of intestinal cancer. In the healthy gut, Troy is produced in fast cycling intestinal stem cells where negatively regulates the Wnt pathway. The second study focuses on processing and posttranslational modification of murine Wnt1 and Wnt3a. Wnts are glycosylated and double acetylated by lipid adducts and our results revealed that O-linked acylation of serine is required for the subsequent S-palmitoylation of cysteine. Moreover, acylation of Wnts is connected with their signaling activity which is related to Wnt1 and...

Les multi-thérapies actuelles permettent de maintenir l'infection au VIH-1 sous contrôle, mais malheureusement n'entraînent pas l'éradication du virus du fait de l'existence de réservoirs cellulaires, où le virus est intégré de façon latente. Les cellules microgliales, cibles privilégiées du VIH-1 dans le cerveau, sont les macrophages résidents du système nerveux central et ont été décrites comme un réservoir cellulaire avec une longue durée de vie. Ce genre de cellule, infectée de façon latente, apparaît comme un des principaux obstacles à l'éradication. Ainsi, la compréhension des mécanismes sous-jacents impliqués dans l'extinction de la transcription virale, semble une étape cruciale afin de parvenir à purger ces réservoirs. Notre laboratoire à déjà montré l'importance du répresseur transcriptionnel CTIP2 dans l'établissement et le maintien de la latence dans ces cellules. Dans le cadre de ma thèse je me suis intéressé à deux autres facteurs cellulaires, LSD1 et HIC1. Au cours de mes travaux, j'ai mis en évidence le rôle répresseur de ces protéines sur la transcription virale dans les microglies. LSD1 coopère avec CTIP2 pour promouvoir l'établissement de marques épigénétiques au niveau du promoteur viral pour induire la mise en place d'hétérochromatine. LSD1 est à l'origine du recrutement de CTIP2, mais aussi d'un autre complexe multiprotéique, COMPASS. A la différence de CTIP2 et LSD1, le suppresseur de tumeur HIC1 est un perturbateur du transactivateur viral TAT. HIC1 est préalablement modifié post-traductionnellement par la déacétylase SIRT1 et va ensuite contrecarrer l'activité de TAT afin d'empêcher la réactivation de la transcription du virus. Ainsi, tandis que LSD1 et CTIP2 favorise l'établissement de la latence, HIC1 permet quant à lui d'entretenir cet état du provirus dans les cellules microgliales. Les travaux présentés ici mettent en évidence deux nouveaux facteurs de la restriction de l'expression virale et permettent de définir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les stratégies de purge des réservoirs.

AB T mu hom dise β sign mu liga stab tran sign T the focu disc cate of t cell targ the inte con sec I sign BSTRACT The Wnt si lticellular o meostasis. A eases, most β-catenin is nalling). In ltiprotein c ands when t bilized and nscription f nalling is tig This thesis knowledge uses on seq cusses the enin signall the Wnt pa ls of intest geted mous thesis des eraction wit nditional Hi retory cell t In conclusi nalling path T ignalling pa organisms Accordingly notably can s a central m n unstimula complex and they engage d transloca factors and ghtly regula is based on e of the reg quential po positive ro ling outcom athway whic tinal epithe e strains th scribes unp th members ic1 deletion types and en ion, our fin hway in dev athway is o ensuring s y, mutations ncer. mediator of ated cells d degraded e their recep tes to the to drive th ated at vario n four origin gulation of sttranslation ole of nucle me. The third ch reduces lium. Final at enable st ublished da s of the Wn n in the inte nhanced tum ndings contr velopment an one of the m successful s in the pat f canonical W β-catenin d in the pro ptors, degrad nucleus t he transcrip ous levels b nal articles f the Wnt s nal process ear protein d study repo the levels o lly, the las tudying the ata on the nt pathway, estinal epith mourigenesi ributed to t...