Al nacimiento, la transición feto-neonatal involucra importantes cambios cardiorrespiratorios, lo que permite una adaptación eficiente del sistema cardiopulmonar para mantener la vida del neonato. En el Alto Andino, un escenario de hipoxia hipobárica natural, esta transición se ve comprometida debido a la menor disponibilidad de oxígeno, pudiendo generar hipertensión arterial pulmonar del neonato y falla cardíaca derecha. Sin embargo, esta transición cardiopulmonar no ha sido bien caracterizada en la etapa neonatal bajo condiciones de hipoxia crónica. Es por ello, que este estudio tiene por objetivo caracterizar los cambios ecocardiográficos y hemodinámicos de corderos recién nacidos en un periodo de treinta días, tanto en normoxia como en hipoxia hipobárica, el cual permitió determinar por primera vez y de forma no invasiva, los cambios que caracterizan la transición cardiopulmonar de la vida fetal a la neonatal. Al momento de nacer, los ejemplares de tierras altas presentaron disfunción ventricular, caracterizada por una reducción de la fracción de eyección (~23%), engrosamiento gradual del septum interventricular y de la pared del ventriculo derecho (~40%). Además, la arteria pulmonar presentó aumentados índices de resistencia y la relación S/D en tierras altas. En resumen, este estudio ha permitido conocer la función y estructura cardiopulmonar del neonato, abriendo posibilidades predecir resultados con otras especies de interés médico veterinario, estableciendo nuevas metas en el diagnostico cardiológico temprano. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1151119

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El presente estudio evaluó la hipótesis de que la gestación mellicera y la subnutrición materna en la preñez ovina generan hipoxia fetal y estrés oxidativo, afectando el normal crecimiento fetal, lo cual podría ser prevenido mediante la administración diaria de vitaminas antioxidantes, C y E. Se ocuparon ovejas de preñez única y doble, a la mitad de cada tipo de gestación se les manejó únicamente bajo pastoreo, supliendo aproximadamente un 70% de sus requerimientos nutricionales, mientras que a la otra mitad se les suplementó con un concentrado comercial para alcanzar el total de sus requerimientos nutricionales. A su vez, dentro de cada nivel nutricional, a la mitad de los animales se les administró diariamente una dosis oral de vitaminas C y E, iniciándose todos los manejos desde el día 30 de gestación. Al día 100 de gestación se midieron características de oxigenación en la sangre arterial materna y venosa umbilical, además de biomarcadores de estrés oxidativo en sangre fetal y características biométricas fetales. La gestación mellicera y la subnutrición materna afectó negativamente la oxigenación fetal y su combinación genera condiciones francamente hipóxicas a nivel fetal. Por su parte, la administración diaria de vitaminas antioxidantes mejoró el aporte de O2 a los fetos. No se evidenció modificación en los biomarcadores de estrés oxidativo (MDA y CAT fetal), por lo cual probablemente el grado de hipoxia fetal fue leve a esta edad gestacional, o bien el estatus antioxidante endógeno fue suficiente para contrarrestar los efectos de la hipoxia como inductor de estrés oxidativo. La subnutrición y la gestación mellicera disminuyeron el tamaño y el peso fetal, con máximo efecto en gestaciones melliceras bajo subnutrición. En conclusión, a los 100 días de preñez la gestación mellicera, la subnutrición y su combinación conducen a una restricción del crecimiento intrauterino, la cual se podría deber a la disminución del traspaso de otros nutrientes por sobre el efecto de la hipoxia y estrés oxidativo, razón por la cual no existiría un claro efecto benéfico de la administración de vitaminas C y E. / The present study evaluated the hypothesis that twin pregnancies and undernutrition in the sheep pregnancy generates fetal hypoxia and oxidative stress, affecting the normal fetal growth, which can be prevented by the daily administration of antioxidant vitamins, C and E. Single and twin sheep pregnancies were used, half of each type of gestation were handled only under grazing, supplying about 70% of their nutritional requirements, while the other half were supplemented with a commercial concentrate to reach the total of their nutritional requirements. Additionally, within each nutritional level, half of the animals were given a daily oral dose of vitamins C and E, starting from day 30 of gestation. At day 100 of gestation, oxygenation characteristics in maternal arterial and venous umbilical blood were measured, as well as biomarkers of oxidative stress in the fetal blood and fetal biometric characteristics. Twin pregnancy and undernutrition negatively affects the conditions of fetal oxygenation, and their combination actually generates fetal hypoxia. On the other hand, the daily administration of antioxidant vitamins improve the O2 supply to the fetuses. There was no increase of oxidative stress biomarkers (MDA and fetal TAC), thus the degree of fetal hypoxia is probably slight at this gestational age, or the endogenous antioxidant status is enough to counteract the effects of hypoxia as inducer of oxidative stress. Undernutrition and twin pregnancy decreased fetal size and weight, with the maximum effect in twin pregnancies with undernutrition. In conclusion, at 100 days of gestation twin pregnancies, undernutrition and their combination lead to intrauterine growth restriction, which would be explained due to the decrease in the transfer of other nutrients over the effect of hypoxia and oxidative stress, therefore a clear beneficial effect of the vitamins C and E administration was not detected at this gestational period / Proyecto Fondecy 1160892

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Al nacimiento, la transición feto-neonatal involucra importantes cambios cardiorrespiratorios, lo que permite una adaptación eficiente del sistema cardiopulmonar para mantener la vida del neonato. En el Alto Andino, un escenario de hipoxia hipobárica natural, esta transición se ve comprometida debido a la menor disponibilidad de oxígeno, pudiendo generar hipertensión arterial pulmonar del neonato y falla cardíaca derecha. Sin embargo, esta transición cardiopulmonar no ha sido bien caracterizada en la etapa neonatal bajo condiciones de hipoxia crónica. Es por ello, que este estudio tiene por objetivo caracterizar los cambios ecocardiográficos y hemodinámicos de corderos recién nacidos en un periodo de treinta días, tanto en normoxia como en hipoxia hipobárica, el cual permitió determinar por primera vez y de forma no invasiva, los cambios que caracterizan la transición cardiopulmonar de la vida fetal a la neonatal. Al momento de nacer, los ejemplares de tierras altas presentaron disfunción ventricular, caracterizada por una reducción de la fracción de eyección (~23%), engrosamiento gradual del septum interventricular y de la pared del ventriculo derecho (~40%). Además, la arteria pulmonar presentó aumentados índices de resistencia y la relación S/D en tierras altas. En resumen, este estudio ha permitido conocer la función y estructura cardiopulmonar del neonato, abriendo posibilidades predecir resultados con otras especies de interés médico veterinario, estableciendo nuevas metas en el diagnostico cardiológico temprano. / At birth, the fetus-neonatal transition involves important cardiorespiratory changes, allowing an efficient adaptation of the cardiopulmonary system to maintain the life of the newborn. In the Andean Altiplano, a natural hypobaric hypoxia scenario, this transition is compromised due to the lower availability of oxygen, which can generate pulmonary arterial hypertension of the newborn and right heart failure. However, this cardiopulmonary transition has not been well characterized in the neonatal stage. For this reason, this study aimed to characterize the echocardiographic and hemodynamic changes of the newborn lambs in a period of thirty days in both normoxia and hypobaric hypoxia, which allowed for the first time and non-invasively to determine the changes that characterize the transition from fetal to postnatal life. At birth, the highland specimens showed ventricular dysfunction with respect to those of the lowlands, characterized by a reduction in the ejection fraction (~23%), gradual thickening of the interventricular septum and the wall of the right ventricle (~40%). In addition, the pulmonary artery presented increased resistance indices and the S/D ratio at highland. In summary, this study has allowed to know the cardiopulmonary function and structure of the neonate, opening possibilities of predicting results with other species of veterinary medical interest, establishing new goals in the early cardiological diagnosis. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1151119

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Preñeces ovinas en condiciones de hipoxia hipobárica resultan en fetos de menor tamaño, además de una serie de modificaciones placentarias, tales como en su vascularización, número y tamaño de los placentomas, entre otras. La hipoxia hipobárica se manifiesta como un estado de estrés oxidativo en estos animales, lo cual es factible de atenuar con un tratamiento antioxidante. En este trabajo se determinó la expresión y actividad de la isoenzima endotelial de la óxido nítrico sintasa (eNOS), molécula involucrada en la angiogénesis y vasodilatación, eventos necesarios para que una gestación llegue a término. Se utilizaron ovejas criollas nativas de una condición de alta altitud, provenientes de Caquena, a 4.200 m.s.n.m. (HL) y ovejas criollas nativas de una condición cercana a nivel del mar (LL). Ambos grupos se mantienen en una condición de aproximadamente 500 m.s.n.m. donde cursan su gestación. La mitad de cada grupo fue suplementada, junto a la ración diaria de heno, con 500 mg de vitamina C y 350 UI de vitamina E por animal, hasta la recolección de muestras. Al término de los 100 días de gestación se determinó la expresión y actividad de eNOS en placentomas, separando la porción materna de la fetal, en todos los grupos. Se detectó la presencia de eNOS en todas las muestras analizadas mediante la técnica de Dot blot; esta característica no presentó cambios significativos ni por origen de las ovejas ni por compartimento analizado, materno o fetal. La actividad de eNOS tuvo un comportamiento similar, ya que no varió significativamente entre los grupos en estudio. El tratamiento con vitaminas C+E, no generó un cambio considerable en la presencia y actividad de eNOS en ovejas que gestan a una altura cercana a nivel del mar, ya sean nativas de alta altitud o de una condición cercana a nivel del mar. Esto no excluye un efecto beneficioso de las vitaminas antioxidantes en ovejas que cursan su gestación en alta altitud / Proyecto FONDECYT 1070405

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los efectos de un ambiente hipóxico sobre la gestación son conocidos. Sin embargo, existe poca información sobre como el ambiente normóxico afectaría la gestación de individuos adaptados a la vida en altura. Este estudio se basa en la consideración que individuos adaptados a un ambiente hipóxico han desarrollado mecanismos que les permite transportar y utilizar el oxígeno más eficientemente en esas condiciones, por lo que frente a un aumento de la presión parcial de oxígeno ambiental éstos pueden desarrollar estrés oxidativo, tal como se observa en hiperoxia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto del ambiente normóxico y de la administración de vitaminas C y E sobre las características placentarias, en ovejas originarias de la altura que cursan su gestación a nivel del mar. Se utilizaron 10 ovejas provenientes de la altura (HL) y 10 del nivel del mar (LL), las que desarrollaron su gestación a 500 msnm. La mitad de cada grupo fue suplementado diariamente con 500 mg de vitamina C y 350 UI de vitamina E. Entre los 96 y 100 días de gestación se evaluaron las características placentarias y la presencia de los factores angiogénicos VEGF y leptina, mediante la técnica de Western Blot. El peso de la placenta fue mayor en el grupo LL en comparación con HL. Las características número de placentomas y superficie de placentomas no mostraron diferencias significativas, mientras que la suplementación con antioxidantes no evidenció cambios significativos para las características antes mencionadas. La expresión de VEGF no reflejó cambios significativos entre los grupos, sin embargo en la porción fetal del placentoma, la expresión de VEGF en los animales LL, tiende a ser mayor. La terapia antioxidante pareció disminuir la expresión de VEGF, aunque esta diferencia no fue significativa. La expresión de leptina disminuyó en los grupos suplementados con vitaminas, siendo esta diferencia significativa en la porción fetal del placentoma. El HL muestra la mayor superficie vascular por placentoma, la que disminuyó al suplementar con vitaminas. De los resultados obtenidos se desprende que la exposición a la normoxia en ovejas gestantes adaptadas a la vida en altura, no produciría cambios placentarios compatibles con un estado de estrés oxidativo. Sin embargo, quedan muchas preguntas sin responder que requerirán estudios posteriores

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La exposición de ovejas a la altura disminuye la fertilidad. Esto se asocia a la hipoxia hipobárica y al estrés oxidativo secundario a la hipoxia. Este fenómeno ha sido estudiado en ovejas gestantes situadas a 3.600 m.s.n.m, a las que se les ha suministrado antioxidantes, observándose un efecto beneficioso tanto en la madre como en las crías, cuyos resultados varían según el tiempo de residencia en altura. En este trabajo se evaluó la expresión inmunohistoquímica de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y el factor de crecimiento fibroblástico tipo 2 (FGF-2) en folículos ováricos y cuerpos lúteos, en respuesta a la exposición por largo o corto tiempo a la altura, así como el efecto de la administración de vitaminas antioxidantes, en ciclos estrales sin concepción en ovejas. A nivel folicular la expresión de la eNOS fue mayor en los animales mantenidos a baja altura y solo se observó un efecto significativo de las vitaminas en este mismo grupo de animales, provocando una disminución de la expresión del péptido. El FGF-2 en folículos no varió significativamente. La expresión de eNOS en cuerpo lúteo, aumentó significativamente (p< 0,05) en ovejas expuestas recientemente a la altura, lo que no se observó en ovejas bajo estas mismas condiciones, con suministro de vitaminas. FGF-2 fue menor en ovejas recientemente expuestas a la hipoxia. La administración de vitaminas antioxidantes disminuyó su expresión en ovejas nativas de altura, pero lo incrementó en las recién expuestas. En conclusión, la expresión inmunohistoquímica de eNOS y FGF-2 en respuesta a la hipoxia/estrés oxidativo difiere entre las diferentes estructuras ováricas / Proyecto FONDECYT 1100189

Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2018 / El cáncer es la 2° causa de muerte en Chile. El desarrollo del cáncer se ha propuesto que es consecuencia de la pérdida de función de los genes supresores de tumores beneficiando la acción de los oncogenes (genes que promueven el crecimiento de tumores). La activación del Factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) en un ambiente reducido en oxígeno (hipoxia) o por óxido nítrico (NO), permiten la proliferación y adaptación metabólica de las células tumorales. Por otro lado, Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, que ha sido descrita como un supresor de tumores y promotor de metástasis. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que E-Cadherina y Caveolina-1 actúan cooperativamente en supresión de tumores in vivo. Sin embargo, Caveolina-1 suprime el crecimiento de tumores incluso en células carentes de E-Cadherina, de un modo menos eficiente. La isoforma endotelial de la sintasa de óxido nítrico (NOS3), es uno de los blancos inhibidos por Caveolina-1 más ampliamente descritos en la literatura, que recientemente ha sido implicado en mantenimiento tumoral. Cómo la inhibición de NOS mediada por Caveolina-1 afecta la activación de HIF1α contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina, aún no ha sido evaluado. En este trabajo, evaluamos la posibilidad que la inhibición de NOS por Caveolina-1 pueda reducir la transcripción dependiente de HIF1α y contribuir así a la función supresora de tumores de Caveolina-1. Líneas celulares transfectadas con un plasmidio que codifica para Caveolina-1 [HT29(US), B16F10 y HEK293T] o células en que la expresión endógena de Caveolina-1 fue disminuida utilizando un shRNA [MDA-MB231], fueron tratadas en hipoxia (1% O2, 4-24 h). La actividad transcripcional de HIF, la expresión de genes blanco de HIF1α, la distribución subcelular de HIF1α, Caveolina-1 y NOS3, fueron evaluados mediante ensayos de gen reportero, RT-PCR/qPCR, Western Blot y microscopía confocal, respectivamente. Además, se realizaron ensayos de formación de tumores en ratones inmunosuprimidos SCID-Beige y en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Los principales hallazgos de este trabajo fueron, que Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de VEGF en hipoxia en las líneas celulares analizadas. Además, la reducción del crecimiento tumoral de células de melanoma murino B16F10(Cav-1) fue coincidente con la reducción de la expresión del mRNA de vegf in vivo. El tratamiento de las células con el dador de NO (DETA/NO) o el inhibidor de arginasa BEC, previnieron la inhibición de la actividad transcripcional de HIF1α mediada por Caveolina-1. Además, la inhibición de NOS con L-NAME o con el inhibidor selectivo de NOS3, L-NIO, reducen el incremento en la actividad transcripcional de HIF en hipoxia. In vivo, la sobreexpresión de HIF1α en células HT29(US)(Cav-1) revierte la supresión de tumores mediada por Caveolina-1 en ratones SCID-Beige. Finalmente, el tratamiento sistémico de ratones C57BL/6 con L-NAME, reduce el volumen tumoral a niveles comparables con los observados en los tumores formados por células B16F10(Cav-1). En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de NOS3 mediada por Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de sus genes blanco, in vitro e in vivo, contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina / Cancer, the 2nd most important cause of death in Chile, is thought to develop due to loss of tumor suppressor and gain of oncogene function. Activation of Hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) in the low oxygen environment (hypoxia) present in tumors or by nitric oxide (NO), favors cancer cell proliferation and metabolic adaptation. Caveolin-1 is a scaffolding protein that reportedly functions both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. Results from this laboratory have shown that E-cadherin and Caveolin-1 cooperate in tumor suppression in vivo. However, Caveolin-1 expression suppresses tumor growth even in cancer cells lacking E-cadherin, albeit less efficiently. The endothelial isoform of nitric oxide synthase (NOS3), one of the best-established targets for inhibition by Caveolin-1, has recently been implicated in maintence of tumor growth. Whether, Caveolin-1-mediated NOS inhibition may impact on HIF1α activation and account for tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin has not been yet assessed. Here, we evaluated the possibility that NOS inhibition by Caveolin-1 may reduce HIF1α - dependent transcription and thereby contribute to the tumor suppressor function of Caveolin-1. Cell lines transfected with a Caveolin-1-encoding plasmid [HT29(US), B16F10 and HEK293T] or cells where endogenous Caveolin-1 protein levels [MDA-MB231] were reduced using shRNA-technology, were exposed to hypoxia (1% O2, 4-24 h). In these cells, HIF transcriptional activity, HIF1α target-gene expression, HIF1α, Caveolin-1 and NOS3 protein levels and subcellular localization were evaluated by gene reporter assays, RT-PCR/qPCR, Western Blot and confocal microscopy, respectively. Tumor forming capacity was evaluated in immunodeficient SCID-Beige and immunocompetent C57BL/6 mouse strains. The main findings of this study are that Caveolin-1 reduced HIF1α transcriptional activity and VEGF expression in hypoxia in vitro in all cell lines. Also, reduced tumor growth of B16F10(Cav-1) melanoma cells in C57BL/6 mice correlated with reduced vegf gene expression in vivo. Treatment of cells with the NO donor (DETA/NO) o arginase inhibition with BEC, prevented Caveolin-1-mediated inhibition of HIF1α transcriptional activity. Furthermore, NOS inhibition with L-NAME or selective NOS3 inhibition with L-NIO, reduced hypoxia-enhanced HIF transcriptional activity. In vivo HIF1α overexpression in HT29(US)(Cav-1) cells reversed tumor suppression due to Caveolin-1 in SCID-Beige mice. Finally, systemic treatment of C57BL/6 mice with L-NAME, reduced tumor volumes to levels comparable to those observed for tumors formed by B16F10(Cav-1) cells. In summary, our observations suggest that Caveolin-1-mediated inhibition of NOS3 activity reduces HIF1α transcriptional activity and target gene expression, both in vitro and in vivo, and that this ability contributes to tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin / CONICYT, FONDECYT, FONDAP, MECESUP

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie. / When the esterases acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE) and carboxylesterase (CarbE) hydrolyze phosphate esters their active sites undergo inhibition by phosphorylation. Therefore, such phosphorylation may protect living beings against the spreading of organophosphates xenobiotics into their bodies, since these enzymes are capable of collecting organophosphate pesticide molecules stoichiometrically. Terrestrial organisms live in an environmental with more oxygen than aquatics organisms. In water, once the level of oxygen reaches 2.6 mg/mL, the environment is a hypoxic one. This occurrence affects aquatic ecosystem, as many organisms cannot adapt to low oxygen availability. We have been studying fish exposed to hypoxia and hyperoxia in order to understand better the biochemistry of enzymes capable of picking up organophosphates when fish are exposed to changes in the physical-chemistry of their habitats. Two groups of at least six pacus (Piaractus mesopotamicus), six goldfishes (Carassius auratus auratus), six tilapias (Oreochromis niloticus niloticus), six piavussus (Leporinus macrocephalus), six oscars (Astronotus ocellatus) or six carps (Cyprinus carpio carpio) were acclimated in two aquariums of 250 L. In separate aquaria, at least three assay animals of each species suffered hypoxia by decreasing the concentration of oxygen up to 0.5 mg/mL by bubbling nitrogen in the water. Once these animals reached hypoxia they were maintained at 0.5 mg/mL of oxygen for 6, 8, 24 or no more than 42 hours. Three control fish of each species were kept in normoxia (4.5 to 7 mg/mL of oxygen). Then, 3.5 mL of blood were withdrawn, fishes were sacrificed and their liver removed. After clotting, blood was centrifuged to remove the supernatant serum, which was used as a sample for assaying esterase activities. Livers were stored at -70 C and, at the time of the enzyme assays, homogenized and centrifuged to obtain the cytosolic and microsomal fractions. Esterase activities were assayed using a spectrophotometer with the substrates acetylthiocholine, butyrylthiocholine or p-nitrophenylacetate. The serum and liver activities with p-nitrophenylacetate fell in all specimens subjected to hypoxia. Typically, in pacu kept for 42 h below 1.0 mg of oxygen per liter this activity dropped about 50%. The time required for the drop on enzyme activities varied from species to species.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención en Patología Animal / El presente estudio se fundamenta en la hipótesis que la prevención del estrés oxidativo en gestaciones ovinas que cursan en un ambiente de altura, también previene la sobreexpresión de HIF-1 que induce la angiogénesis placentaria. Cuarenta ovejas criollas de segundo parto fueron separadas en cuatro grupos: originarias de baja altura que gestaron en su ambiente (BB), originarias de baja altura que gestaron en la altura (BA), originarias de la altura que gestaron a nivel del mar (AB), originarias de la altura que gestaron en su ambiente (AA). La mitad de cada grupo fue suplementado diariamente vía oral con 500 mg de vitamina C y 350 UI de vitamina E. A los 100 días de gestación se midieron gases sanguíneos y se extrajeron placentomas a fin de determinar la expresión y localización inmunohistoquímica del factor inducido por hipoxia (HIF-1 ). Los resultados indicaron la presencia de inmunoreactividad a HIF-1 en los grupos de animales tratados y no tratados con terapia antioxidante, con menor intensidad de expresión en el grupo tratado, sin modificar la localización de éste. Los controles negativos de la técnica no mostraron inmunoreactividad al factor. Los gases sanguíneos evidenciaron la presencia de un estado hipoxémico en los grupos de gestación en altura. Cada variable analizada en forma individual (origen, altura de gestación y administración de vitaminas), mostró diferencias significativas entre los grupos tratados y no tratados, siendo la administración de antioxidantes la variable que mostró las diferencias más significativas (p 0,001). Los animales que presentaron la menor expresión del factor fueron los pertenecientes a los grupos con tratamiento antioxidante BAV y ABV, mientras que los grupos que presentaron la mayor expresión fueron animales sin tratamiento antioxidante BA y AB. En el grupo de corta exposición a la altura (BA) se observó el mayor efecto de la terapia antioxidante (BAV) en relación a la expresión de HIF-1 , mientras que el grupo originario de baja altura no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados (BBV) y los no tratados (BB). En conclusión, la administración de vitaminas antioxidantes disminuye la expresión de HIF-1 , ayudando a contrarrestar los efectos del daño oxidativo producido por la exposición a hipoxia hipobárica de altura en gestaciones ovinas. / The present study evaluated the hypothesis that oxidative stress in ovine pregnancy at high altitudes can be prevented and also the overexpression of HIF-1 as inductor of placentary angiogenesis. Fourty creole ewes were divided in four groups according to the altitude in which gestation occured: low-native ewes maintained at low altitude (BB), low-native ewes maintained at high altitude (BA), high-native ewes maintained at low altitude (AB), high-native ewes maintained at high altitude (AA). Half of each group received daily oral supplements of vitamin C (500 mg) and E (350 UI). At 100 days of gestation blood gases were measured and plancentomes were recovered for immunohistochemical evaluation of hipoxia inducible factor HIF- 1 . Our results show positive immunoreactivity in all groups, with a lesser expression in the treated group and without changing the factor location. Controls were negative to the immunoreaction. Blood gases showed the presence of a hypoxemic state in the high altitude groups. The origin of the animals as well as the altitude in which gestation was carried out and the vitamin administration showed statistical differences in all groups, but the antioxidant therapy registered the most meaningful differences (p 0,001). The BAV and ABV groups exhibit the lesser expression of HIF-1 , whereas the respectively non treated groups (BA-AB) showed the mayor expression. In the new-coming altitude group (BA) we observed the mayor antioxidant therapy effect (BAV), whereas the low native group did not show any difference between the treated (BBV) and no treated animals (BB). In conclusion, antioxidant supplementation diminishes the HIF-1 expression helping to counteract the effects produced by oxidative damage in high altitude hypobaric hypoxia sheep pregnancy. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1070405.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie. / When the esterases acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE) and carboxylesterase (CarbE) hydrolyze phosphate esters their active sites undergo inhibition by phosphorylation. Therefore, such phosphorylation may protect living beings against the spreading of organophosphates xenobiotics into their bodies, since these enzymes are capable of collecting organophosphate pesticide molecules stoichiometrically. Terrestrial organisms live in an environmental with more oxygen than aquatics organisms. In water, once the level of oxygen reaches 2.6 mg/mL, the environment is a hypoxic one. This occurrence affects aquatic ecosystem, as many organisms cannot adapt to low oxygen availability. We have been studying fish exposed to hypoxia and hyperoxia in order to understand better the biochemistry of enzymes capable of picking up organophosphates when fish are exposed to changes in the physical-chemistry of their habitats. Two groups of at least six pacus (Piaractus mesopotamicus), six goldfishes (Carassius auratus auratus), six tilapias (Oreochromis niloticus niloticus), six piavussus (Leporinus macrocephalus), six oscars (Astronotus ocellatus) or six carps (Cyprinus carpio carpio) were acclimated in two aquariums of 250 L. In separate aquaria, at least three assay animals of each species suffered hypoxia by decreasing the concentration of oxygen up to 0.5 mg/mL by bubbling nitrogen in the water. Once these animals reached hypoxia they were maintained at 0.5 mg/mL of oxygen for 6, 8, 24 or no more than 42 hours. Three control fish of each species were kept in normoxia (4.5 to 7 mg/mL of oxygen). Then, 3.5 mL of blood were withdrawn, fishes were sacrificed and their liver removed. After clotting, blood was centrifuged to remove the supernatant serum, which was used as a sample for assaying esterase activities. Livers were stored at -70 C and, at the time of the enzyme assays, homogenized and centrifuged to obtain the cytosolic and microsomal fractions. Esterase activities were assayed using a spectrophotometer with the substrates acetylthiocholine, butyrylthiocholine or p-nitrophenylacetate. The serum and liver activities with p-nitrophenylacetate fell in all specimens subjected to hypoxia. Typically, in pacu kept for 42 h below 1.0 mg of oxygen per liter this activity dropped about 50%. The time required for the drop on enzyme activities varied from species to species.