Las plantas acuáticas del género Ruppia habitan lagunas costeras, salinas, humedales y aguas salinas interiores, jugando un papel ecológico clave. Estos sistemas se caracterizan por variaciones extremas de las condiciones ambientales tales como salinidad, temperatura e inundación. La compleja historia evolutiva del género Ruppia ha dificultado la delimitación de especies en el género. Estas especies han desarrollado una gran diversidad de estrategias biológicas para sobrevivir en estos ambientes extremos, tales como ciclos de vida anuales y perennes, reproducción sexual y propagación vegetativa, estrategias de polinización epihidrófila e hidroautogámica, así como autofecundación y fecundación cruzada. Además, existen diferentes vectores que pueden facilitar el flujo de genes entre las poblaciones, incluyendo corrientes marinas, aves acuáticas y peces. Estas características biológicas de Ruppia tienen una influencia importante en sus patrones de especiación, diversidad genotípica y genética, y su estructura poblacional. Por lo tanto, los análisis genéticos proporcionan información importante para delimitar especies y taxones dentro de este género, evaluar la diversidad e identificar procesos y flujos que actúan a distintas escalas temporales y espaciales. Los objetivos principales de esta tesis son: inferir los procesos evolutivos y biológicos de especiación y diversificación, y evaluar la prevalencia y estructura poblacional de especies Europeas del género Ruppia. Esta tesis se centra principalmente en las zonas costeras de la Península Ibérica, debido a la alta diversidad de especies de Ruppia registradas en esta zona geográfica, y al hecho de que en muchas ocasiones es posible encontrar poblaciones de diferentes especies en simpatría. Para alcanzar estos objetivos, en el Capítulo I, se desarrollaron y validaron diez nuevos marcadores moleculares polimórficos (es decir, microsatélites) para Ruppia cirrhosa. Adicionalmente se obtuvo amplificación cruzada con otros dos microsatélites descritos anteriormente para R. maritima. Estas herramientas moleculares son importantes para el estudio de plantas clonales y se han utilizado junto con secuencias nucleares y del cloroplasto en los siguientes capítulos. En el Capítulo II, se estudió la sistemática del género Ruppia en Iberia considerando criterios morfológicos, marcadores nucleares altamente variables (microsatélites) y secuencias nucleares (ITS) y del cloroplasto (psbA-trnH). Al realizar la filogenia utilizando marcadores con diferentes tiempos de mutación y mecanismos hereditarios, pudo identificarse el importante papel de la hibridación y la introgresión en la historia evolutiva de este género. De las tres especies tradicionalmente descritas en la Península Ibérica, se observó que R. drepanensis y R. cirrhosa se situaron en el mismo clado filogenético tanto para los marcadores nucleares como para los cloroplastos, por lo que pueden considerarse especies hermanas. R. maritima está incluida en un clado más distante filogenéticamente, apoyado por ambos marcadores. Además, dos nuevas entidades genéticas fueron identificadas, R. cf. maritima y "R. híbrido", las cuales mostraron algunas incongruencias entre los árboles filogenéticos del núcleo y del cloroplasto, así como una combinación de alelos de microsatélites que sugieren la existencia de efectos de hibridación y/o introgresión. En el Capítulo III, mediante el estudio de microsatélites en diferentes poblaciones de R. cirrhosa de la Península Ibérica y Sicilia, se detectó una fuerte estructura genética poblacional. En términos generales, se registró un bajo nivel de flujo génico, el cual fue más importante entre poblaciones geográficamente cercanas o ubicadas en el mismo cuerpo hidrológico. Además, se evaluaron diferentes hipótesis para explicar la conectividad entre las poblaciones a través de correlaciones entre distancias geográficas y genéticas, sugiriendo que el vector de dispersión más probable entre las poblaciones de R. cirrhosa en la Península Ibérica son las aves acuáticas. Al compilar los resultados del Capítulo II y el Capítulo III, se evaluaron los efectos de diferentes estrategias reproductivas sobre la diversidad genotípica y genética de Ruppia. Todas las entidades genéticas mostraron elevadas tasas de reproducción sexual. En R. cirrhosa, los mayores índices de reproducción sexual se detectaron en los hábitats más inestables hidrológicamente. Estas perturbaciones podrían promover la germinación y el establecimiento de semillas por una baja competencia interespecífica por el espacio, la luz y otros recursos existentes en praderas menos densas. Los mayores valores de diversidad genética detectados en los epihidrófilos R. drepanensis, R. cirrhosa y probablemente en “R. híbrido” (ésto no se ha confirmado) que en la hidroautogámica Ruppia cf. maritima, sugieren una fuerte influencia del modelo de polinización sobre los patrones de diversidad genética. En el Capítulo IV, R. maritima fue identificada por primera vez en Cabo Verde (Isla de Santiago) a partir de análisis morfológicos y filogenéticos. Esta información amplía la distribución geográfica de esta especie al África Occidental.

Crohn's disease (CD) is a chronic granulomatous inflammatory bowel disease involving Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). Other microorganisms such as adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) have also been proposed in CD association. To date, only one study investigated both MAP and AIEC simultaneously using peripheral blood but not in affected intestinal tissues. A standardized and effective antibiotic therapy against MAP and/or AIEC is needed for better treatment. Three antibiotic drugs – Clarithromycin (CLA), Rifabutin (RIF), and Clofazimine (CLO) have been used to treat CD patients suspected with MAP infection. However, the outcome has been controversial. The treatment dosage is high, the duration is long, and the reported drug side effects resulted in patient non-compliance; therefore, a lower and effective drug dosage is needed. In this study, we developed two aims 1) to evaluate RHB 104, a drug formula comprised of low dosages of CLA, RIF, and CLO, against clinical MAP strains in-vitro using fluorescence quenching method, and 2) to develop a fluorescence in-situ hybridization method to detect both MAP and AIEC simultaneously in intestinal tissues of CD patients. A total of 16 clinical MAP strains and 19 non-MAP strains were tested against varied concentrations of RHB 104, CLA, RIF, and CLO. Although the MIC for all drugs ranged between 0.5-20 ?g/ml, the MIC for RHB 104 was significantly lower against most MAP strains. The effect of RHB 104 against MAP was bactericidal. Unlike RHB-104 formula, CLA, CLO, and RIF dosage similar to those in RHB-104 did not inhibit MAP growth when trialed individually and in dual-drug combinations. The data illustrated the presence of synergistic anti-MAP activity of low dosage of the three antibiotics in RHB-104. We also developed a rapid and sensitive multicolor in-situ hybridization technique that can detect MAP and AIEC using tagged-oligonucleotide probes. Non-pathogenic Escherichia coli (npEC) was used as a control for the study. Specifically, cultured MAP and npEC were fixed and hybridized with MAP488 and EC647 probes, respectively. Confocal laser scanning microscope (CLSM) revealed specific signals at 488nm for MAP and 647nm for npEC, indicating probe binding to each bacteria. This was confirmed with hybridization of MAP with EC647 and npEC with MAP488 resulting in absence of signals. Intestinal tissue samples from 9 CD patients were then analyzed using our technique. Preliminary data indicated positive results in 6/6 samples for MAP, 6/6 for npEC, 3/3 for AIEC, and 2/2 for both MAP and AIEC with MAP being more dominant. This protocol shortened the FISH procedure from multiple days to short-hours. The protocol allows the investigation of more than one pathogen simultaneously in the same clinical sample. A quantitative measurement of the signals is needed.

Epigenetic regulatory mechanisms play important roles in the control of lineage-specific differentiation during development. However, mechanisms that regulate higher-order chromatin remodelling and transcription of keratinocyte-specific genes that are clustered in the genome into three distinct loci (Keratin type I/II loci and Epidermal Differentiation Complex (EDC) during differentiation of the epidermis are poorly understood. By using 3D-Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), we determined that in the epidermal keratinocytes, the KtyII and EDC loci are located closely to each other in the nuclear compartment enriched by the nuclear speckles. However, in KtyII locus knockout mice, EDC locus moved away from the KtyII locus flanking regions and nuclear speckles towards the nuclear periphery, which is associated with marked changes in gene expression described previously. Chromatin architectural protein Ctcf has previously been implicated in the control of long-range enhancer-promoter contacts and inter-chromosomal interactions. Ctcf is broadly expressed in the skin including epidermal keratinocytes and hair follicles. Conditional Keratin 14-driven Ctcf ablation in mice results in the increase of the epidermal thickness, proliferation, alterations of the epidermal barrier and the development of epidermal pro-inflammatory response. Epidermal barrier defects in Krt14CreER/Ctcf fl/fl mice are associated with marked changes in gene expression in the EDC and KtyII loci, which become topologically segregated in the nucleus upon Ctcf ablation. Therefore, these data suggest that Ctcf serves as critical determinant regulating higher-order chromatin organization in lineage-specific gene loci in epidermal keratinocytes, which is required for the proper control of gene expression, maintenance of the epidermal barrier and its function.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

DNA is the substance that encodes the genetic information that cells need to replicate and to produce proteins. The detection of DNA sequences is of great importance in a broad range of areas including genetics, pathology, criminology, pharmacogenetics, public health, food safety, civil defense, and environmental monitoring. However, the established techniques suffer from a number of problems such as the bulky size, high equipment costs, and time-consuming algorithms so that they are limited to research laboratories and cannot be applied for in-vivo situations. In our research, we developed a novel sensing scheme for DNA sequence detection, featuring sequence specificity, cost efficiency, speed, and ease of use. Without the need for labels or indicators, it may be ideal for direct in-cell application. The principle is simple. With capture DNA immobilized onto the probe by layer-by-layer selfassembly, the hybridization of a complementary strand of target DNA increases the optical thickness of the probe. Three kinds of sensors were developed. The optical fiber tip sensor has been demonstrated with good specificity and high sensitivity for target DNA quantities as small as 1.7 ng. To demonstrate the potential of this structure for practical applications, tularemia bacteria were tested. Two other micrometric structures were designed with specific advantages for different applications. The micro-fiber Bragg grating interferometer (Micro-FBGI) has the intrinsic temperature compensation capability. The micro-intrinsic Fabry-Perot interferometer (Micro-IFPI)features simple signal processing due to its simple configuration. Successful DNA immobilization and hybridization have been demonstrated onto the 25μm Micro-IFPI. Both structures have great potential for nanometric protrusion, allowing future in-cell DNA direct detection. In addition, its quick response time leads to the potential for express diagnosis. What's more, the idea of nanoscale probe has a broad impact in scanning near-field optical microscopy (SNOM), intracellular surgery in cell sensing, manipulation, and injection. / Ph. D.