Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:14:32Z : No. of bitstreams: 1 borges_la_me_jabo.pdf: 248872 bytes, checksum: bb6dce02b71fa4434990be14d38d0fe8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), agente etiológico da rinotraqueite infecciosa bovina (IBR)/Vulvovaginite Pustular Bovina (IPV), tem grande importância como agente causador de problemas reprodutivos em vacas por determinar baixas taxas de concepção ou parição, acarretando consideráveis perdas econômicas para o produtor. Assim, o presente estudo conduzido em rebanhos de três fazendas (A, B e C) onde se processa a transferência de embriões (TE) no município de Prata no Estado de Minas Gerais teve como objetivo verificar as condições sorológicas de 209 animais antes do processamento biotécnico, determinar a resposta imune de esquema vacinal pré-definido e analisar a relação entre títulos médios geométricos (TMG) de anticorpos antes e depois da vacinação com os parâmetros reprodutivos de fêmeas receptoras de embriões vacinadas contra o BoHV-1. O título dos anticorpos para BoHV-1 foi determinado por meio do teste de virusneutralização (VN), conforme protocolo definido pelo Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e o quadro reprodutivo foi caracterizado por meio do exame de ultrassonografia transretal. Com isso, verificou-se que as prevalências de 39,7% (27/68) na fazenda A, 27,5% (11/40) na fazenda B e 36,6% (37/101) na fazenda C não foram estatisticamente diferentes; essa situação epidemiológica definiu o aumento de títulos de anticorpos para o BoHV-1 em 72,7% (152/209) dos animais pela vacinação com dose única; o maior sucesso de prenhez (75%) na 1ª TE foi observada nos animais que eram positivos e atingiram títulos acima de 256 após a vacinação; mesmo assim, no contexto estatístico, os índices gerais de gestação não tiveram influência significativa em decorrência da vacinação com dose única / The bovine herpesvirus type 1 (BoVH-1), which causes infectious bovine rhinotracheitis (IBR) / infectious pustular vulvovaginitis (IPV), has major importance as an agent that causes reproductive problems by determining low conception or calving rates causing significant economical losses for the producer. The present study, was carried out in the cattle of three farms (A, B and C), where the embryos transfer is processed (ET), at Prata municipality in Minas Gerais State, aiming to verify the serological conditions of 209 animals before biotechnical processing, to determine immune response to a pre defined vaccination schedule and to analyze the relationship between geometric mean titers (TMG) of antibodies before and after vaccination with the reproductive parameters in embryo recipient heifers vaccinated against BoHV-1. The antibodies titers of BoHV-1 were determined by the virusneutralization test (VN), according to the protocol established by the World Organization for Animal Health (OIE) and the reproductive performance was characterized by transrectal ultrasonography examination. Thus, it was verified that the prevalence rates of 39.7% (27/68) in farm A, 27.5% (11/40) in farm B and 36.6% (37/101) in farm C had no statistical difference; this epidemiological situation defined the increase of antibody titers for BoHV-1 in 72.7% (152/209) of the animals by vaccination with a single dose; the greater success of pregnancy (75%) in the first ET was observed in animals that were positive and reached titers higher than 256 after vaccination; in the statistical context, the single dose vaccination had no significative influence in the overall rates of pregnancy

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

Infecções pelos herpesvírus bovinos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) têm sido sistematicamente detectadas em rebanhos bovinos brasileiros. Entretanto, por causa da alta similaridade antigênica entre estes dois vírus e a falta de testes sorológicos específicos, a prevalência de cada um deles é atualmente desconhecida. Com o objetivo de detectar e diferenciar infecções latentes causadas por BoHV-1 e/ou BoHV-5, gânglios trigêmeos de 200 bovinos foram coletados e analisados para a presença de DNA viral. As amostras foram coletadas em um frigorífico localizado no município de Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Uma PCR semi quantitativa foi desenvolvida, otimizada e utilizada para detectar o DNA viral em gânglios. Para diferenciar entre infecções por BoHV-1 e BoHV-5, duas nested PCR tipo-específicas foram desenvolvidas e utilizadas. Além disto, as amostras de soros obtidas foram submetidas a testes de neutralização viral (VN) para detecção de anticorpos. O DNA de BoHV-1 e/ou BoHV-5 foi detectado em 87% dos animais. Os resultados das nested PCRs revelaram que 82,8% dos animais positivos estavam latentemente infectados com BoHV-1 e 93,1%, com BoHV-5. Além disto, foi detectada uma alta proporção de animais co-infectados com os dois vírus (75,9 %). Por outro lado, os resultados das VN mostraram que somente 49,5% dos animais apresentaram anticorpos anti-virais. Este é o primeiro estudo que utiliza testes moleculares para detectar infecções latentes por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em gânglios de um grande número de animais e mostra uma alta proporção de co-infecções por estes dois vírus em bovinos. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) infections have been consistently detected in Brazilian bovine herds. However, mainly because of their high antigenic similarity and the lack of specific serologic tests for both viruses, the prevalence of each of these viruses is currently unknown. Aiming the detection and differentiation of latent infections caused by BoHV-1 and/or BoHV-5, we collected trigeminal ganglia of 200 bovines and analyzed them for the presence of viral DNA. The samples were collected in an abattoir located in Capão do Leão, Rio Grande do Sul. A semi quantitative PCR was developed, optimized and used to detect the viral DNA in ganglia. To differentiate between BoHV-1 and BoHV-5 infections, two type-specific nested PCR were developed and performed. In addition, for the detection of anti-viral antibodies, serum samples were submitted to the virus neutralizing test (VNT). DNA of BoHV-1 and/or BoHV-5 was detected in 87% of the animals. The results of the nested PCRs reveled that 82.8% of the bovines were latently infected with BoHV-1 and 93.1%, with BoHV-5. Moreover, we detected a high proportion of co-infected animals (75.9 %). On the other hand, the results of the VNT indicated that only 49.5% of the animals had anti-viral antibodies. This is the first study that applies molecular tests to detect latent infection by either BoHV-1 and/or BoHV-5 in ganglia of a high number of animals and shows such a high proportion of coinfections of these two viruses in bovines.

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar a resposta imune (RI) humoral e celular de bezerros recém-nascidos mediante imunização passiva e ativa, usando como modelo o Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) e o Herpesvírus Bovino tipo-1 (BoHV-1). Esta pesquisa foi dividida em duas etapas e seus dados estão apresentados em dois capítulos. Capítulo 1- Acompanhou-se a imunização passiva de bezerros do nascimento até os seis meses de idade e a influência da vacinação materna no período pré-parto nessa resposta. Os animais foram distribuídos em dois grupos experimentais que receberam colostro de mães não imunizadas (G1, n=4) e (G2, n=6) de mães imunizadas no período pré-parto para o BVDV e BoHV-1. A colostragem foi feita pela administração de seis litros de colostro nas primeiras doze horas de vida, distribuídas em duas mamadas. Nesta etapa foi possível verificar: (1) a presença de títulos de ACs neutralizantes apenas no grupo de bezerros que receberam colostro de mães imunizadas, obtendo soroconversão após a mamada de colostro em 2/6 (33%) bezerros para o BVDV e 6/6 (100%) para o BoHV-1; (2) manutenção dos títulos de ACs protetores até os três meses de vida. Em relação a RI celular: (3) observou-se maior proporção de células T auxiliares CD4+ (P=0,05) no grupo de bezerros que receberam colostro de mães imunizadas no período pré-parto; (4) o leucograma dos bezerros demonstrou respostas inflamatórias em alguns momentos desta pesquisa, mais intensa nos animais que ingeriram colostro proveniente de mães nãoimunizadas. Capítulo 2- Acompanhou-se a imunização de bezerros para BVDV e BoHV-1 aos seis meses de idade. Dez bezerros foram distribuídos em dois grupos de bezerros não vacinados (VAC-, n=5) e vacinados para o BVDV e BoHV-1 (VAC+, n=5), as análises foram realizadas antes da imunização aos 180 dias (T0), após a 1°dose aos 210 dias (T1) e após a 2° dose aos 240 dias (T2). Os resultados obtidos para avaliação da RI humoral foram: (1) soroconversão de 2/5 (40%) animais no momento T1 e 3/5 (60%) no T2 para o BVDV; (2) soroconversão em 2/5 (40%) no T1 e 5/5 (100%) no T2 para o BoHV-1. Para a RI celular observou-se: (3) maior expressão de CD25+ pelas subpopulações de linfócitos T gama-delta WC1+ no VAC+, observando-se diferença estatística no momento T1 (P=0,0016). Com base nos resultados obtidos nas duas etapas experimentais desta pesquisa pode-se concluir que a vacinação materna é uma estratégia para melhorar a qualidade do colostro e as repostas imunes humoral e celular dos bezerros para BVDV e BoHV-1; a duração da imunidade materna considerando-se níveis protetores de Acs foi de três meses; os componentes do colostro influenciaram na resposta inflamatória dos bezerros à exposição natural aos patógenos; a vacinação dos bezerros aos seis meses de idade estimulou a resposta imune humoral para BoHV-1 e parcial para BVDV. / The aim of this research was to evaluate the humoral and cellular immune response (IR) of newborn calves by active and passive immunization, using by model the Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and Bovine Herpesvirus type-1 (BoHV-1). This research was divided in two stages and the datas are presented in two chapters. Chapter 1: Was followed the passive immunization of calves from birth until six months old and the maternal vaccination influence on pre-partum period on this response. The animals were divided in two experimental groups that received colostrum from unvaccinated mothers (G1, n = 4) and (G2, n=6) from immunized mothers in the pre-partum period to BVDV and BoHV-1. The calves received six liters of colostrums on the first twelve hours of life, divided in two feedings. At this stage was verified: (1) the presence of neutralizing titers antibodies (Abs) only in group of calves that received colostrum from immunized mothers, getting seroconversion after feeding in 2/6 (33%) of calves for BVDV and 6/6 (100%) for BoHV-1, (2) maintenance of Abs titers protectors up to three months of life. In relation to immune cellular response: (3) was observed higher proportion of helper T cells CD4+ (P = 0.05) in the group of calves that received colostrum from immunized mothers during pre-partum; (4) the leukogram of calves showed inflammatory responses in some moments of this research, more intense in animals that ingested colostrums from non-immunized mothers. Chapter 2: Was followed the immunization of calves for BVDV and BoHV-1 at six months old. Ten calves were divided in two groups of calves non-vaccinated (VAC-, n = 5) and vaccinated for BVDV and BoHV-1 (VAC +, n = 5). The analyzes were performed before immunization at 180 days (T0), after the 1st dose at 210 days (T1) and after the 2nd dose at 240 days (T2). The results for evaluation of immune humoral response were: (1) seroconversion 2/5 (40%) animals at the T1 moment and 3/5 (60%) of T2 for BVDV, (2) soroconversion on 2/5 (40 %) in the T1 to 5/5 (100%) at T2 for BoHV-1. For the immune cellular response was observed: (3) increased expression of CD25+ subpopulations of T lymphocytes by gamma-delta WC1+ in VAC+, observing statistical difference in T1 moment (P = 0.0016). Based on the results obtained in the two experimental stages of this research can be concluded that maternal vaccination is a strategy to improve the quality of colostrum and humoral and cellular immune response of calves to BVDV and BoHV-1, the duration of maternal immunity considering protective levels of Abs was three months. The components of colostrum influence the inflammatory response of calves to natural exposure to pathogens. The vaccination of calves at six months old stimulated the humoral immune response to BoHV-1 and partial for BVDV.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são alfaherpesvírus freqüentemente associados a meningoencefalites. Por outro lado, o vírus da raiva é o agente mais frequentemente identificado como causador de encefalites virais em bovinos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi examinar a ocorrência de infecções por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em amostras de tecido encefálico bovino submetidas ao diagnóstico de raiva e avaliar seu possível envolvimento nos quadros de encefalite que originaram a suspeita de raiva. Para tanto, 101 amostras desses tecidos, sendo 39 positivas para raiva e 62 negativas, recebidas pelo órgão oficial responsável pelo diagnóstico de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (IPVDF) no período de 2009- 2010, foram submetidas a exames buscando o isolamento viral e amplificação de genomas de herpesvírus bovinos. Ao isolamento viral, todas as amostras foram negativas para vírus infeccioso após a realização de três passagens cegas em células MDBK. As mesmas foram submetidas à amplificação por “nested PCR” (nPCR) para a pesquisa de genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Das 101 amostras totais analisadas esta técnica revelou que 25,7% (26/101) continham genomas de BoHV-1 e 21,8% (22/101) continham genomas de BoHV-5. Genomas de ambos os tipos foram identificadas em 30 (29,7%) amostras. Entre as amostras que foram também positivas para raiva em 23% (9/39) foram detectados genomas de BoHV-1 e em 15,4% (6/39) continham genomas de BoHV-5. Em 16 destas 39 amostras (41%) foram detectados genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Em contrapartida, nas amostras negativas para o vírus rábico, 27,4% (17/62) também foram positivas para BoHV-1, 25,8% (16/62) foram positivas para BoHV-5. Detectaram-se os genomas de ambos BoHVs em 22,6% (14/62) dos animais. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas, indicando não haver correlação entre a ocorrência de raiva e infecções por herpesvírus na amostragem realizada. Estes resultados indicam que, embora as infecções por BoHV-1 e BoHV-5 tenham apresentado elevada incidência nessas amostras, não havia vírus infeccioso nas mesmas, sugerindo infecções latentes sem envolvimento aparente nos quadros de encefalite que originaram a suspeita inicial de raiva. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are alphaherpesviruses associated with a number of clinical manifestations in cattle, including encephalitis. On the other hand, rabies virus is the agent most frequently identified as cause of viral encephalitis in cattle in Brazil. The aim of this study was to examine the occurrence of BoHV-1 and / or BoHV-5 in bovine brain tissue samples submitted to rabies diagnosis. The search was carried out by virus isolation and nested polymerase chain reaction (PCR) in brain tissues of cattle submitted to rabies diagnosis in the state of Rio Grande do Sul in the period 2009-2010. One hundred and one brain samples from cattle with signs of neurological disease, of which 39 were positive and 62 negative for rabies, were used in this study. At virus isolation, all samples were negative for the presence of infectious herpesviruses after three successive passages in MDBK cells. Of the 101 total samples analyzed, this test revealed that 25.7% (26/101) of cattle were infected with BoHV-1 and 21.8% (22/101) were infected with BoHV-5. Genomes of both types were detected in 29.7% (30/101) samples. With the 39 samples positive for rabies virus, BoHV-1 genome was detected in 23% (9/39) and 15.4% (6/39) were positive for BoHV-5 as well as in 41% (16/39) of these samples, which were positive for both BoHVs. On the other hand, the negative samples for rabies virus, 27.4% (17/62) also were positive for BoHV-1, as well and 25.8% (16/62) were positive for BoHV-5. Genomes of both BoHVs were detected in 22.6% (14/62) of the specimens. These differences were not statistically significant indicating no correlation between the occurrence of rabies and herpesvirus infections in the animals. These results do not imply that the herpesviruses detected, even showing a high incidence, were the causative agents of meningoencephalitis in the samples tested, once it was not possible to isolate virus in its infectious form, however it suggests a latent infection in the animals involved with neurological signs of meningoencephalitis whose primary suspicion was rabies.

No presente estudo, buscou-se avaliar quais seriam as cepas de herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) seriam mais adequadas para uso como vírus de confrontação em testes de soroneurtralização (SN). Oitocentas e dez amostras de soros de duas regiões geograficamente distintas foram avaliadas à SN frente a seis diferentes cepas virais, incluindo tipos e subtipos diversos (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO95/97). A maior sensibilidade foi revelada pelo somatório de soropositivos identificados com as seis cepas utilizadas no estudo. Uma combinação de quatro vírus (BoHV-1.1: LA e EVI123/98, BoHV-5a: EVI88/95 e BoHV-5b: A663) foi capaz de detectar 99,1% das amostras soropositivas. Estes quatro vírus foram selecionados para serem utilizados em um levantamento soroepidemiológico com o intuito de estimar a prevalência das infecções causadas pelos BoHV-1 e BoHV-5 no Estado do Rio Grande do Sul. Para tanto, soros de 2200 fêmeas bovinas adultas (>24 meses), representativos da população bovina do Rio Grande do Sul, foram submetidos à SN frente às quatro cepas virais escolhidas. om esta combinação, a soroprevalência média das infecções por BoHV-1 e BoHV-5 encontrada foi de 29,2%. Além disso, analisando outros fatores que pudessem influenciar a prevalência das infecções, foram considerados fatores de risco o tipo de exploração corte, a ausência da prática de ordenha, o contato dos bovinos com ovinos/caprinos e animais silvestres, a venda de animais de reprodução, o uso de piquetes de parto/pós-parto, o uso de assistência veterinária privada e a criação de animais de raças européias de corte. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que, para que a SN seja capaz de detectar animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5 com a máxima sensibilidade, o teste deve ser realizado com várias amostras de BoHV-1 e BoHV-5, não necessariamente de tipos ou subtipos diferentes, pois amostras do mesmo tipo de vírus apresentarrm diferentes sensibilidades. Além disso, as amostras de confrontação podem variar de acordo com a região geográfica de origem dos soros. Os resultados obtidos nesse levantamento revelam que anticorpos anti-BoHV-1 e anti-BoHV-5 encontram-se amplamente distribuidos nos rebanhos gaúchos. No entanto, não foi possível determinar a prevalência tipo-específica destas infecções com os testes realizados. Assim, a proporção de animais que estão infectados com o BoHV-1 ou com o BoHV-5 (ou ambos) na região examinada permanece desconhecida. / In this study a search was carried out to determine which of a number of available strains/isolates of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) would be more suitable for use as challenge virus in serum neutralization (SN) tests. Eight hundred and ten bovine serum samples collected from two geographically distinct regions were evaluated in SN tests against six BoHVs of different types and subtypes (BoHV-1.1: EVI123/98 and Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 and BoHV-5c: ISO95/97). The highest sensitivity was achieved when the SN-positive sera obtained with the six different viruses were added. A combination of four viruses (BoHV-1.1 LA, and EVI123/98, BoHV-5a EVI88/95 and BoHV-5b A663), was able to detect 99.1% of the seropositive samples. These four viruses were selected to carry out a seroepidemiological survey to estimate BoHV-1 and BoHV-5 prevalence in the state of Rio Grande do Sul. In order to achieve that, sera from 2,200 bovine female cows (>24 months-old), representative of the bovine population of Rio Grande do Sul state were tested on SN tests against the four selected viruses. With such combination, seroprevalence of BoHV-1 and BoHV-5 infections was 29.2%. After examining potential factors that might affect the prevalence of such infections, the following were considered as significant risk factors: the type of exploitation (beef cattle > dairy), use of milking procedures, concomitant presence of sheep, goats or wild animals in farm; sale of animals for reproductive purposes; use of pre and postparturition paddocks; use of private veterinary assistance and farming of European beef breeds. The results obtained here indicate that for the SN test to provide the highest sensitivity in detecting BoHV-1 and BoHV-5 seroposivive animals, it must be performed against a number of BoHV-1 and BoHV-5 strains, though not necessarily of different types and subtypes as viruses within a same subtype may display different sensitivities. Besides, challenge viruses may vary for geographically distinct areas. The serological survey performed with four distinct bovine herpesviruses reveal that antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 are widely distributed among cattle flocks in Rio Grande do Sul. However, it was not possible to determine type-specific prevalence with the tests performed. Thus, the proportion of cattle actually infected with either BoHV-1 or BoHV-5 (or both) in the examined region remains undetermined.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.

No presente estudo, buscou-se avaliar quais seriam as cepas de herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) seriam mais adequadas para uso como vírus de confrontação em testes de soroneurtralização (SN). Oitocentas e dez amostras de soros de duas regiões geograficamente distintas foram avaliadas à SN frente a seis diferentes cepas virais, incluindo tipos e subtipos diversos (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO95/97). A maior sensibilidade foi revelada pelo somatório de soropositivos identificados com as seis cepas utilizadas no estudo. Uma combinação de quatro vírus (BoHV-1.1: LA e EVI123/98, BoHV-5a: EVI88/95 e BoHV-5b: A663) foi capaz de detectar 99,1% das amostras soropositivas. Estes quatro vírus foram selecionados para serem utilizados em um levantamento soroepidemiológico com o intuito de estimar a prevalência das infecções causadas pelos BoHV-1 e BoHV-5 no Estado do Rio Grande do Sul. Para tanto, soros de 2200 fêmeas bovinas adultas (>24 meses), representativos da população bovina do Rio Grande do Sul, foram submetidos à SN frente às quatro cepas virais escolhidas. om esta combinação, a soroprevalência média das infecções por BoHV-1 e BoHV-5 encontrada foi de 29,2%. Além disso, analisando outros fatores que pudessem influenciar a prevalência das infecções, foram considerados fatores de risco o tipo de exploração corte, a ausência da prática de ordenha, o contato dos bovinos com ovinos/caprinos e animais silvestres, a venda de animais de reprodução, o uso de piquetes de parto/pós-parto, o uso de assistência veterinária privada e a criação de animais de raças européias de corte. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que, para que a SN seja capaz de detectar animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5 com a máxima sensibilidade, o teste deve ser realizado com várias amostras de BoHV-1 e BoHV-5, não necessariamente de tipos ou subtipos diferentes, pois amostras do mesmo tipo de vírus apresentarrm diferentes sensibilidades. Além disso, as amostras de confrontação podem variar de acordo com a região geográfica de origem dos soros. Os resultados obtidos nesse levantamento revelam que anticorpos anti-BoHV-1 e anti-BoHV-5 encontram-se amplamente distribuidos nos rebanhos gaúchos. No entanto, não foi possível determinar a prevalência tipo-específica destas infecções com os testes realizados. Assim, a proporção de animais que estão infectados com o BoHV-1 ou com o BoHV-5 (ou ambos) na região examinada permanece desconhecida. / In this study a search was carried out to determine which of a number of available strains/isolates of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) would be more suitable for use as challenge virus in serum neutralization (SN) tests. Eight hundred and ten bovine serum samples collected from two geographically distinct regions were evaluated in SN tests against six BoHVs of different types and subtypes (BoHV-1.1: EVI123/98 and Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 and BoHV-5c: ISO95/97). The highest sensitivity was achieved when the SN-positive sera obtained with the six different viruses were added. A combination of four viruses (BoHV-1.1 LA, and EVI123/98, BoHV-5a EVI88/95 and BoHV-5b A663), was able to detect 99.1% of the seropositive samples. These four viruses were selected to carry out a seroepidemiological survey to estimate BoHV-1 and BoHV-5 prevalence in the state of Rio Grande do Sul. In order to achieve that, sera from 2,200 bovine female cows (>24 months-old), representative of the bovine population of Rio Grande do Sul state were tested on SN tests against the four selected viruses. With such combination, seroprevalence of BoHV-1 and BoHV-5 infections was 29.2%. After examining potential factors that might affect the prevalence of such infections, the following were considered as significant risk factors: the type of exploitation (beef cattle > dairy), use of milking procedures, concomitant presence of sheep, goats or wild animals in farm; sale of animals for reproductive purposes; use of pre and postparturition paddocks; use of private veterinary assistance and farming of European beef breeds. The results obtained here indicate that for the SN test to provide the highest sensitivity in detecting BoHV-1 and BoHV-5 seroposivive animals, it must be performed against a number of BoHV-1 and BoHV-5 strains, though not necessarily of different types and subtypes as viruses within a same subtype may display different sensitivities. Besides, challenge viruses may vary for geographically distinct areas. The serological survey performed with four distinct bovine herpesviruses reveal that antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 are widely distributed among cattle flocks in Rio Grande do Sul. However, it was not possible to determine type-specific prevalence with the tests performed. Thus, the proportion of cattle actually infected with either BoHV-1 or BoHV-5 (or both) in the examined region remains undetermined.