Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI. / Peri and prenatal systemic lesions alter CNS development leading to motor and cognitive problems in children that might persist throughout life. A particular kind of injury, the hypoxic ischemic (HI), is characterized by a permanent or temporary blockage of blood flow. One of the proposed mechanisms downstream from a HI event is called glutamatergic excitotoxicity. The administration of glutamate inhibitors has been studied in HI models for several years. In this work, we evaluated the effects of administration of a non-competitive antagonist of glutamate receptor, NMDA, on cerebellar development and behavioral tests of HI animals. Pregnant rats in the 18th gestational day were anesthetized, the uterine horns were exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (group H). Sham controls had the uterine horns exposed, but no arteries were clamped (group S). Gestation proceeded after surgery. Only full term animals were used. One day after birth half the animals was assigned to receive either SALINE (groups SS and HS) or MK801 (groups SM and HM). Animals were anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde at 9, 23, 30 and 60 days of age. Parasagittal cerebellar sections were submitted to Calbindin, GFAP, GLAST, PDGFRα and MBP immunohistochemistry. Beginning at P45 animals were subjected to a battery of behavioral tests: elevated plus maze (EPM), hole board (HB), ROTAROD, ladder test and stride length. At P9 the dendritic tree of Purkinje cells were thinner in SM, HS/HM animals, indicating that both HI and MK801 are deleterious regarding this Purkinje cell differentiation. A lower number of PDGFRα+ cells was observed in HS/HM animals, with no effects of MK801 administration. At P23 a greater number of PDGFRα+ cells was found in HM animals when compared to the other 3 groups, demonstrating a neuroprotector effect of MK801. A lower number of myelinated fibers (MBP+) was observed in HS animals at P9, and MK801 administration reverse this effect. At P9, GLAST distribution was altered in HS animals, and MK801 partially reverse this altered distribution. No effects of HI and MK801 were observed in the EPM and ROTAROD tests. HI decreased motor performance of hind limbs in the ladder test, though no effect of MK801 was noted. In the HB test, we do not observe HI effects regarding the novelty seeking behavior and locomotor activity, otherwise the administration of MK801 decreased the number of grooming and locomotor activity. In the stride length test, we do not observed effects of HI although MK801 augmented the length variation of the fore limbs. Our results show that inhibition of NMDA receptors exerts a neuroprotector effect on oligodendrocyte progenitor cells and myelination, probably by temporarily inhibiting differentiation of those, providing more time to proliferate. NMDA activity exerts a crucial role in Purkinje cell differentiation as well as in GLAST distribution. Taken together our results lead us to conclude that NMDA receptor activity has an important role in the genesis of lesions caused by HI events.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI. / Peri and prenatal systemic lesions alter CNS development leading to motor and cognitive problems in children that might persist throughout life. A particular kind of injury, the hypoxic ischemic (HI), is characterized by a permanent or temporary blockage of blood flow. One of the proposed mechanisms downstream from a HI event is called glutamatergic excitotoxicity. The administration of glutamate inhibitors has been studied in HI models for several years. In this work, we evaluated the effects of administration of a non-competitive antagonist of glutamate receptor, NMDA, on cerebellar development and behavioral tests of HI animals. Pregnant rats in the 18th gestational day were anesthetized, the uterine horns were exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (group H). Sham controls had the uterine horns exposed, but no arteries were clamped (group S). Gestation proceeded after surgery. Only full term animals were used. One day after birth half the animals was assigned to receive either SALINE (groups SS and HS) or MK801 (groups SM and HM). Animals were anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde at 9, 23, 30 and 60 days of age. Parasagittal cerebellar sections were submitted to Calbindin, GFAP, GLAST, PDGFRα and MBP immunohistochemistry. Beginning at P45 animals were subjected to a battery of behavioral tests: elevated plus maze (EPM), hole board (HB), ROTAROD, ladder test and stride length. At P9 the dendritic tree of Purkinje cells were thinner in SM, HS/HM animals, indicating that both HI and MK801 are deleterious regarding this Purkinje cell differentiation. A lower number of PDGFRα+ cells was observed in HS/HM animals, with no effects of MK801 administration. At P23 a greater number of PDGFRα+ cells was found in HM animals when compared to the other 3 groups, demonstrating a neuroprotector effect of MK801. A lower number of myelinated fibers (MBP+) was observed in HS animals at P9, and MK801 administration reverse this effect. At P9, GLAST distribution was altered in HS animals, and MK801 partially reverse this altered distribution. No effects of HI and MK801 were observed in the EPM and ROTAROD tests. HI decreased motor performance of hind limbs in the ladder test, though no effect of MK801 was noted. In the HB test, we do not observe HI effects regarding the novelty seeking behavior and locomotor activity, otherwise the administration of MK801 decreased the number of grooming and locomotor activity. In the stride length test, we do not observed effects of HI although MK801 augmented the length variation of the fore limbs. Our results show that inhibition of NMDA receptors exerts a neuroprotector effect on oligodendrocyte progenitor cells and myelination, probably by temporarily inhibiting differentiation of those, providing more time to proliferate. NMDA activity exerts a crucial role in Purkinje cell differentiation as well as in GLAST distribution. Taken together our results lead us to conclude that NMDA receptor activity has an important role in the genesis of lesions caused by HI events.

A galectina-3 (gal-3) pertence a uma família de proteínas com domínios de ligação a beta-galactosídeos e está relacionada com diversos aspectos tumorais, como proliferação e adesão celular, angiogênese e proteção contra morte celular. Estudos mostram sua relação com o fenômeno da hipóxia, característica de diversos tumores sólidos que apresentam altas taxas de proliferação celular. A adaptação à hipóxia é mediada principalmente pelo Fator Induzido por Hipóxia (HIF-1), a qual atua na indução de diversos genes de sobrevivência em ambientes com baixas concentrações de oxigênio. Além de HIF, outros fatores são importantes nesse processo, como NF-kB, por exemplo, sendo um fator de transcrição responsivo a diversos estresses celulares, entre eles, a hipóxia. Alguns modelos tumorais apresentam-se ideais para o estudo dos efeitos da hipóxia no microambiente tumoral, como os glioblastomas. Estes são tumores do sistema nervoso central com altas taxas de letalidade, são refratários aos principais métodos de tratamento por sua plasticidade, crescimento infiltrativo e heterogeneidade. Histologicamente, estes tumores apresentam atipia nuclear, altas taxas de mitose e áreas de pseudopaliçada. Postula-se que estas áreas sejam compostas por células migrantes de ambientes necróticos, os quais são também hipóxicos devido a sua distância de vasos sanguíneos e é demonstrado que estas células expressam tanto HIF-1alfa quanto gal-3. Ensaios in vitro realizados por nosso grupo demonstraram que a gal-3 é positivamente regulada pela hipóxia em uma linhagem de glioma híbrido, NG97ht, além de demonstrar que esta proteína é um fator chave na proteção destas células contra a morte celular induzida pela privação de oxigênio e nutrientes, mimetizando condições necróticas de pseudopaliçada in vivo, destacando-se as habilidades antiapoptóticas desta proteína. Embora uma de suas possíveis funções tenha sido elucidada, os mecanismos de atuação e de indução da gal-3 ainda são obscuros. Deste modo, este projeto visa explorar os papéis pró-tumorais da gal-3, podendo torná-la um possível alvo em terapias anti-neoplásicas, entendendo melhor seus mecanismos de proteção contra a morte celular e controle de expressão em ambientes hipóxicos, além de estudar suas possíveis funções in vivo no desenvolvimento de tumores, e também estendendo seus estudos para outras linhagens de glioblastoma. Nossos resultados demonstraram que a gal-3 está co-localizada com mitocôndrias nestas linhagens de glioma, podendo sofrer alterações pós-traducionais em hipóxia, como a fosforilação e que houve acúmulo de HIF-1alfa nuclear nestas células em hipóxia. Vimos também que a gal-3 na linhagem NG97ht apresentou-se proveniente de dois alelos diferentes e que fatores intermediários deveriam ser expressos previamente pela célula antes da indução de gal-3 em hipóxia. Também demonstramos que houve dependência de NF-kB na indução transcricional de gal-3 nestas condições. Estes experimentos também demonstraram que a exposição de células à hipóxia e privação de nutrientes é capaz de induzir tanto espécies reativas de oxigênio como o aumento da autofagia nestas células, fatores importantes na indução da morte celular, além de demonstrar que na linhagem NG97ht a indução da morte nestas condições ocorreu por necrose, sem apresentar apoptose celular. Expandimos esta teoria da participação da gal-3 como molécula protetora contra a morte em hipóxia e privação de nutrientes para outra linhagem de glioma humano, a T98G. E finalmente, demonstramos que a diminuição da expressão de gal-3 em células tumorais da linhagem U87MG levou a diminuição das taxas de estabelecimento e crescimento tumoral in vivo / Galectin-3 (gal-3) belongs to a family of proteins with beta-galactoside binding domains and is related to various tumoral aspects, such as cell proliferation and adhesion, angiogenesis and protection against cell death. Studies show its relationship with the hypoxia phenomenon, a characteristic of many solid tumors that have high cell proliferation rates. The adaptation to hypoxia is mainly mediated by Hypoxia Induced Factor (HIF-1), which acts in the induction of several survival genes in environments with low oxygen concentrations. In addition to HIF, other factors are important in this process, such as NF-kB, for example, which is a transcription factor responsive to various cellular stresses, including hypoxia. Some tumor models are ideal for studying the effects of hypoxia in the tumor microenvironment, e.g. glioblastomas. These central nervous system tumors with high mortality rates are refractory to the main treatment methods due to their plasticity, heterogeneity and infiltrative growth. Histologically, these tumors exhibit nuclear atypia, high mitotic rates and pseudopalisading areas. It is postulated that these areas are composed of migrating cells out of necrotic microenvironments, which are also hypoxic due to their distance from the blood vessels and it is shown that these cells express both HIF-1alfa and gal-3. In vitro assays performed by our group demonstrated that gal-3 is positively regulated by hypoxia in a hybrid glioma cell line, NG97ht, and demonstrated that this protein is a key factor in protecting these cells against cell death induced by oxygen and nutrient deprivation conditions mimicking necrotic pseudopalisading areas in vivo, highlighting the pro-survival abilities of this protein. Although one of its possible functions has been elucidated, gal-3 mechanisms of action and induction are still unclear. Thus, this project aims to explore the gal-3 pro-tumoral effects, which may make it a possible target for anti-neoplastic therapies, better understanding the mechanisms of protection against cell death and expression in hypoxic environments, and also study its possible functions in vivo, extending these studies to other glioma cell lines. Our results demonstrated that gal-3 is located within the mitochondria in these glioma cell lines and may undergo posttranslational modifications in hypoxia, such as phosphorylation and that there is accumulation of nuclear HIF-1alfa in these cells under hypoxia. We have also seen that gal-3 in the NG97ht cell line presents two different alleles and that intermediate factors must be expressed previously by the cell before gal-3 induction in hypoxia. We also demonstrated that there is dependence on the NF-kB transcriptional factor for the gal-3 induction under these conditions. These experiments also demonstrated that exposure of cells to hypoxia and nutrient deprivation is capable of inducing reactive oxygen species and increased autophagy in these cells, which are important factors in the induction of cell death. In addition, we demonstrated that the induction of the NG97ht cell death in these conditions is due to necrosis. We expanded this theory of the participation of gal-3 as a protective molecule against cell death in hypoxia and nutrient deprivation to another human glioma cell line, T98G. And finally, we demonstrated that decreased expression of gal-3 in the U87MG glioma cell line leads to lower tumor establishment rates and decreased growth in vivo

Ao longo dos últimos anos, tornou-se evidente que o início e a progressão do câncer dependem de vários componentes do microambiente tumoral, incluindo células imunes e inflamatórias, fibroblastos, células endoteliais, adipócitos e matriz extracelular. Estes componentes e as células neoplásicas interagem entre si e trocam sinais pró e antitumor. O presente estudo teve como objetivo analisar o secretoma de células neoplásicas sob estresse e seu efeito no microambiente tumoral. Para este fim, duas linhagens celulares de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço foram cultivadas em duas condições de estresse: hipóxia e radiação. Os meios condicionados por estas células (secretoma 1) e o seu controle foram utilizados para cultivar células neoplásicas e fibroblastos humanos normais da cavidade oral. Os resultados sugerem que os sinais derivados das células neoplásicas em resposta a estresse dirigem a expressão gênica e proteica, bem como o comportamento celular das células vizinhas. Foram identificadas 38 proteínas celulares e nove proteínas secretadas com expressão aumentada e 61 proteínas celulares e 70 secretadas com expressão reduzida em células neoplásicas sob estresse hipóxico. Também foram identificadas 59 proteínas celulares e 29 proteínas secretadas com expressão aumentada e 59 proteínas celulares e 19 secretadas com expressão reduzida em células neoplásicas e fibroblastos humanos normais tratados com o meio condicionado por células sob estresse hipóxico. O secretome de células sob estresse não foi capaz de induzir proliferação de células neoplásicas e fibroblastos humanos normais, mas promoveu migração e invasão. Os resultados podem contribuir para o melhor entendimento do efeito dos fatores parácrinos liberados pelas células neoplásicas sobre a expressão gênica, bem como sobre o comportamento das células tumorais e estromais / Over the past years, it has become evident that cancer initiation and progression depends on several components of the tumor microenvironment, including inflammatory and immune cells, fibroblasts, endothelial cells, adipocytes, and extracellular matrix. These components and the neoplastic cells interact with each other providing pro and antitumor signals. The present study aimed to analyze the secretome of cancer cells under stress and their effect on the tumor microenvironment. For this purpose, two cell lines from head and neck carcinomas were cultured in two stress conditions - hypoxia and radiation. The medium conditioned by these cells (secretome 1) and their control were used to grow untreated neoplastic cells and normal human fibroblasts from oral cavity. Our results showed that signals derived from cancer cells in response to stress drive gene and protein expression and cell behavior. Thirty-eight overexpressed cellular and 9 secreted proteins, and 61 underexpressed cellular and 70 secreted proteins were identified in neoplastic cells under hypoxic stress. Fifty-nine overexpressed cellular and 29 secreted proteins, and 59 underexpressed cellular and 19 secreted proteins were identified in neoplastic cells and normal human fibroblasts treated with the medium conditioned by cells under hypoxic stress. The secretome of cells under stress was not able to induce proliferation of cancer cells and normal human fibroblasts, but promoted migration and invasion. The results may contribute to understand the effect of paracrine factors released by neoplastic cell on gene expression as well as on stromal and tumor cells behavior

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells

A hipóxia crônica intermitente (HCI) promove hipertensão arterial e aumento da atividade simpática em ratos jovens. Nestes animais, o aumento da atividade simpática ocorre durante uma fase específica da respiração e está correlacionada com o aumento da atividade expiratória. Estas evidências mostram que, após a HCI, os ratos jovens desenvolvem alterações no acoplamento simpático-respiratório, um mecanismo que pode contribuir, pelo menos em parte, para o desenvolvimento da hipertensão observada nestes animais. Em diversos modelos experimentais de hipertensão, os níveis de pressão arterial são menores nas fêmeas do que nos machos, portanto elas são resistentes ao desenvolvimento da hipertensão. Levando em conta essas informações, a hipótese do presente projeto foi a seguinte: fêmeas submetidas à HCI seriam resistentes ao desenvolvimento da hipertensão arterial. Para tanto, ratas jovens e adultas foram submetidas à HCI e seus parâmetros cardiovasculares e respiratórios foram avaliados na condição dos animais acordados e com livre movimentação. Além disso, as alterações na atividade simpática e respiratória também foram avaliadas na preparação coração tronco-cerebral isolados. Os resultados mostram que as fêmeas desenvolvem hipertensão semelhante aos machos submetidos ao mesmo protocolo, contudo as alterações no acoplamento entre a atividade simpática e respiratória são diferentes entre os sexos. Estes dados sugerem que embora os machos e fêmeas desenvolvam um nível similar de hipertensão após a HCI, os mecanismos envolvidos na geração da atividade simpática podem ser diferentes. / Chronic intermittent hypoxia (CIH) produces hypertension and sympathetic overactivity in juvenile male rats. The increase in sympathetic activity occurs during the expiratory phase of respiration, which is correlated with an augmented expiratory activity. This information indicates that after CIH, juvenile rats develop changes in the respiratory sympathetic-coupling, which could explain, at least in part, the hypertension observed in these animals. Female rats are known to be more resistant to the development of hypertension in several experimental models of this pathology. Take in consideration these facts, we hypothesized that female rats exposed to CIH were resistant to the development of hypertension. To test this hypothesis, we studied the cardiovascular and respiratory changes in female rats after the CIH in awake freely moving condition. In another group of animals, we studied the sympathetic and respiratory activity in female rats after the CIH, using for this, the working heartbrainstem preparation. The results show that juvenile female rats develop hypertension similarly to that observed in juvenile male rats submitted to the same protocol. However, juvenile female rats presented changes in the respiratory-sympathetic coupling different from that observed in juvenile male rats. Together, these results suggest that even if the level of hypertension after CIH is similar between males and females, the mechanisms underlying the generation of sympathetic overactivity are different.

O tecido cerebral é altamente dependente de uma complexa rede vascular e um suprimento adequado de oxigênio, uma vez que o metabolismo oxidativo é a principal via de produção de ATP. Entretanto, durante o aumento da atividade neuronal existe uma relação não linear entre fluxo sanguíneo cerebral e consumo de oxigênio, verificado por tomografia de emissão de pósitrons e posteriormente por técnicas quantitativas de ressonância magnética nuclear. O aumento mais pronunciado do fluxo sanguíneo em comparação com o consumo de oxigênio levanta questões sobre a possibilidade de o oxigênio atuar como um fator limitante. Apesar dos efeitos devastadores da privação completa de oxigênio ao tecido cerebral dentro de minutos, a redução da disponibilidade de oxigênio por curtos períodos de tempo é comum em pacientes com apneia do sono e está associada como fator de risco à hipertensão e acidentes vasculares. Acreditamos que a obtenção de novas informações sobre o efeito da disponibilidade de oxigênio na regulação da resposta vascular e do metabolismo energético no cérebro humano in vivo é crucial para um melhor entendimento de aspectos básicos do metabolismo energético cerebral e sua relação com o sistema neurovascular. Nesta tese foi avaliado o impacto da redução da disponibilidade de oxigênio no acoplamento neurovascular e metabólico do cérebro humano saudável. Dois estudos foram realizados na presença de hipóxia moderada, com saturação sanguínea entre 80 a 85%, e normóxia como condição de controle. O primeiro utilizou técnicas quantitativas de ressonância magnética funcional (fMRI) em 3T para caracterizar a resposta vascular evocada de 9 sujeitos saudáveis perante a estimulação visual. O segundo visou caracterizar as concentrações metabólicas em repouso e também as alterações induzidas pela estimulação visual em 11 sujeitos, utilizando a técnica de espectroscopia de ressonância magnética funcional (fMRS) em 7T. Os dados de fMRI mostraram reduções significativas das áreas corticais recrutadas durante a hipóxia moderada, embora as áreas comuns às três técnicas que continuaram ativas demonstraram respostas com amplitude de fluxo e volume sanguíneos similares a normoxia. Além disto, a variação de consumo de oxigênio devido à estimulação visual foi menor durante a hipóxia. Tais achados potencialmente poderiam indicar diminuição da extensão do recrutamento neuronal, porém um novo desacoplamento entre atividade neuronal e a resposta vascular, ou seja, aumento da atividade neuronal sem uma mesma resposta vascular durante a hipóxia moderada não poderia ser descartado. O estudo de fMRS demonstrou alterações metabólicas (glutamato e lactato) induzidas pela estimulação similares em ambas as condições gasosas. Entretanto, alterações significativas nas concentrações de aspartato, glutamato e glutamina foram observadas entre as condições no repouso. A combinação dos achados de ambos os estudos aqui apresentados sugere que a hipóxia moderada não resulta na diminuição do recrutamento neuronal, pois variações similares de glutamato e lactato, considerados fortes marcadores do aumento de atividade neuronal, foram observadas durante hipóxia moderada. Entretanto, há evidências de que a disponibilidade reduzida de oxigênio leva a alterações no mecanismo do acoplamento vascular e também no metabolismo basal. Análises futuras serão necessárias para verificar se existe um mecanismo fisiológico que explica as alterações vasculares e metabólicas aqui observadas. / The cerebral tissue is highly dependent on a complex vascular network and a tight regulated supply of oxygen, since oxidative metabolism is the primary source of ATP synthesis. Increased neuronal activity leads to a well-established mismatch between CBF and CMRO2, measured by PET and nuclear magnetic resonance techniques. The much larger CBF evoked response as compared to CMRO2 response raises questions about the role played by oxygen as a potential limiting factor. Despite the devastating effects of intense hypoxia to cerebral tissue, moderate oxygen deprivation through short periods of time is frequent in chronic disorders such as obstructive sleep apnea and has been suggested to be a risk factor for morbidities such as hypertension and stroke. Identifying the impact of mild hypoxia on functional brain metabolism in the healthy human brain is a crucial step for understanding basics aspects of cerebral bioenergetics and its relationship with the neurovascular system. In this thesis we evaluate the impact of reduced oxygen availability in the neurovascular and metabolic coupling of the healthy human brain. Two studies were performed in the presence of mild hypoxia, with 80 to 85% arterial blood oxygen saturation, and normoxia as the control condition. The first study utilized functional Magnetic Resonance Imaging techniques (fMRI) at 3T to characterize the vascular response to visual stimulation in 9 subjects. The second study aimed at characterizing the neurochemical profile of the human brain and quantifying the stimulus-induced metabolic changes as measured by fMRS at 7T in 11 subjects. The fMRI data showed significant reductions in the recruited cortical areas during mild hypoxia, although activated areas in all three imaging modalities showed responses with similar amplitude of blood flow and volume from normoxia. In addition, the variation of oxygen consumption due to stimulation was smaller during mild hypoxia. These findings could potentially suggest decreased neuronal recruitment, although a new decoupling between neuronal activity and vascular response (i.e. similar neuronal recruitment with different vascular response) could not be discarded. The fMRS study showed similar stimulus-induced glutamate and lactate changes during both gas conditions. However, significant concentration differences were observed in aspartate, glutamate and glutamine during rest conditions. Finally, the combination of the data from the two studies herein presented suggests that mild hypoxia does not result in reduced neuronal recruitment despite the altered vascular response, as shown by the similar glutamate and lactate stimulus-induced responses, known to be strong markers of increased neuronal activity. However, there are evidences that support altered neurovascular coupling and metabolic concentrations during reduced oxygen availability at rest. Further analysis will be necessary to elucidate how the new steady state concentrations of aspartate, glutamate and glutamine could be linked to physiological mechanism that potentially alters the neurovascular response.

Introdução: A hipóxia tumoral tem papel de fator prognóstico independente, estando relacionado a fenótipo mais agressivo, com maior capacidade de proliferação, invasão e disseminação metastática, além de maior resistência ao tratamento sistêmico e à radioterapia. As alterações do microambiente decorrente do baixo nível de oxigênio pode levar a formação de células tronco tumorais (CTTs) em células de câncer de mama, que são identificadas através da expressão de aldeído desidrogenase (ALDH1A1). Modelos experimentais para estudo da influência da hipóxia no desenvolvimento e progressão do câncer demonstram dados inconclusivos e controversos e estão limitados a modelos in vitro e modelos in vivo que submetem os camundongos a estado de hipóxia sistêmica. Em nosso estudo, desenvolvemos um modelo in vivo para estudar se o estado de hipóxia controlado, direcionado ao local do tumor, pode induzir a formação de CTT em câncer de mama de camundongos. Métodos: células da linhagem 67 NR foram introduzidas dentro do córtex renal de fêmeas de camundongos BALB/c. Foi colocado um clipe de aneurisma no hilo renal por 60 minutos para provocar hipóxia direcionada ao local do tumor. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas ou 7 dias da hipóxia e foi realizada análise histológica para confirmar as mudanças induzidas pela isquemia na córtex renal e tumoral. Realizada dissecção tumoral microscópica e RT-PCR para análise da expressão CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, SOX 9 e ALDHA1(TaqMan® Gene Expression Assay) no grupo controle e da hipóxia. TBP e HPRT foram os genes housekeeping e o crescimento in vitro de linhagem de células 67NR, usado como referência. Resultados: Todos os camundongos enxertados com células 67NR no cortex renal desenvolveram tumores locais. Foi observada necrose tubular aguda (NTA), decorrente da hipóxia tecidual direcionada. Os genes foram diferentemente expressos, comparando com as linhagens celulares. Notamos aumento significativo da ativação da via da hipóxia por aumento da expressão gênica de CA9, HIF1A e HIF2A. Ocorreu uma modulação para formação de CTTs. Obervamos aumento de 2,9 e de 5,7 respectivamente, na expressão de SLUG, relação SLUG/SOX9 após 24 horas de hipóxia, redução de 2,7 vezes na expressão de SOX9 e não houve aumento na expressão de ALDH1. Entretanto, houve aumento de 2,1 vezes na expressão de ALDH1 7 dias após a hipóxia. Conclusão: Houve aumento da expressão de Slug e Slug/SOX9 precocemente ao aumento da expressão de ALDH1, em ambiente de hipóxia tumoral, o que sugere que há probabilidade de participação de Slug e SOX9 na formação de CTTs / The tumoral hypoxia is an independent prognostic factor in many solid malignat tumors. Low oxygen tension has been related to more aggressive phenotype, greater proliferation capacity, increased invasiveness and metastatic dissemination, and resistance to systemic treatment and radiotherapy. Changes in the microenvironment due low oxygen level lead to cancer stem cells formation (CSC) in breast câncer. The aldehyde dehydrogenase (ALDH1) cellular expression has been decribed as a CSC marker. Experimental models to study the influence of hypoxia on the development and progression of cancer have shown inconclusive and controversial data and are restricted to models in vitro and in vivo models in mice undergoing a state of systemic hypoxia. In our study, we developed an in vivo model to study whether the state of hypoxia controlled targeted to the tumor site may induce the formation of CSC in breast cancer in mice. Methods: 67 NR lineage cells were engrafted into the renal cortex of female BALB / c mice. Aneurysm clip was placed in the renal hilum for 60 minutes to induce hypoxia targeted to the tumor site. Mice were sacrificed after 24 hours or 7 days of hypoxia, and histological analysis was performed to confirm ischemia-induced renal cortex changes. Tumors were microdissected and RT-PCR was carried out to analyze the expression of CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, Sox 9 and ALDHA1 genes (TaqMan® Gene Expression Assay) in the control and hypoxia groups. TBP and HPRT were used as housekeeping genes and the cell lines 67NR gowing in culture plate was used as reference. Results: All mice engrafted with cells in the renal cortex 67NR developed local tumors. Acute tubular necrosis (ATN) was observed, resulting from the targeted tissue hypoxia. The genes were expressed differently, compared with cell lines. We notice a significant increase in activation of the hypoxia by increased gene expression of CA9, HIF1A and HIF2A, 24 hours after renal tumor ischemia. There was increased by 2.9 and 5.7 fold, respectively, in the expression of SLUG and SLUG/SOX9, no difference in ALDH1 and reduced by 2.7 fold in the expression of SOX 9, 24 hours after ischemia.There was increased by 2.1 fold in ALDH1 expression 7 days after ischemia. Conclusion: There was increased in expression of SLUG and SLUG/SOX9 early expression of ALDH1 in tumor hypoxia environment. This suggests are likely SLUG and SOX9 have role in cancer stem cell transformation

O glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor mais agressivo do Sistema Nervoso Central (SNC) e caracteriza-se por um alto poder angiogênico que está diretamente relacionado com a capacidade invasiva e inversamente com o prognóstico. A angiogênese contribui para a malignidade por prover a oxigenação e o suprimento nutricional necessários para o crescimento e invasão do tumor. O GBM prolifera sob um ambiente de hipóxia e o fator induzido por hipóxia (HIF-1) apresenta um papel fundamental na ativação da transcrição de genes alvo que favorecem a angiogênese e evitam a morte celular. O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e o fator de crescimento derivado da plaqueta C (PDGF-C) são agentes de grande interesse na angiogênese tumoral e que podem ser modulados pelo HIF-1. Foi realizado tissue microarray(TMA) de 208 casos de GBM e estudados pelo método de imunoistoquímica os marcadores HIF-1, VEGF e PDGFC. Os resultados foram correlacionados com a angiogênese avaliada através da densidade microvascular (DMV) pelo CD34, CD105, VEGF e PDGF-C, com a proliferação celular endotelial através da marcação nuclear pelo KI-67 e também com a sobrevida. A expressão tumoral do HIF-1 foi observada em 184 casos (88,5%), a do VEGF em 131 (63%) e a do PDGF-C em 160 (77%). As DMVs medianas pelo CD34, PDGF-C, VEGF e CD105 foram, respectivamente, 20, 16, 5 e 6. Os GBMs com marcação positiva pelo HIF-1 tiveram uma DMV mediana pelo CD34 de 30, enquanto que nos negativos a DMV mediana foi 14 (p<0,001). A expressão tumoral positiva pelo HIF-1 teve correlação com a marcação tumoral pelo VEGF e PDGF-C (p<0,001). Houve também uma correlação entre a marcação do VEGF e do PDGF-C tanto no tumor (p=0,001) como na célula endotelial (p<0,001). A expressão do VEGF no tumor teve correlação com a sua expressão no vaso (p<0,001). Células endoteliais marcadas pelo PDGF-C e pelo VEGF também foram marcadas pelo CD105 e seus núcleos pelo KI-67 confirmando seu padrão neoangiogênico e proliferativo. A marcação nuclear das células tumorais pelo VEGF teve impacto na sobrevida (p=0,002), bem como as marcações nucleares pelo HIF-1 e VEGF (p=0,005). Em conclusão, este estudo mostrou que a expressão do HIF-1 está associada com as expressões do VEGF e do PDGF-C e que houve uma correlação desses marcadores com a angiogênese no GBM. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive tumour of the central nervous system (CNS) and is characterized by a high angiogenic power that is directly related to the invasiveness and inversely to the prognosis. Angiogenesis contributes to malignancy by providing the necessary oxygenation and nutritional supplement for the tumour\'s growth and invasion. GBM proliferates under a hypoxia environment and the hypoxia-inducible factor (HIF-1) plays a key role on the transcription of essential genes which promote angiogenesis and prevent cellular death. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and the platelet-derived growth factor C (PDGF-C) are agents of great interest on tumour angiogenesis and may be modulated by the HIF-1. Tissue micro-array (TMA) was conducted on 208 cases of GBM and the HIF-1, VEGF and PDGF-C markers were studied under immunohistochemistry method. The results were correlated with angiogenesis assessed by micro-vessel density (MVD) for CD34, CD105, VEGF and PDGF-C, with endothelial cell proliferation by nuclear staining for KI-67, and also with survival. The tumour expression by HIF-1 was observed in 184 cases (88.5%), by VEGF in 131 (63%) and by PDGF-C in 160 (77%). The median MVD for CD34, PDGF-C, VEGF and CD105 was respectively 20, 16, 5 and 6.The GBMs which stained positive for HIF-1 showed a median MVD of 30 for CD34, whereas in negative ones, median MVD was 14 (p <0.001). The positive tumour expression for HIF-1 was correlated with tumour markings for VEGF and PDGF-C (p <0.001). There was also a correlation between the markings for VEGF and PDGF-C in both the tumour (p = 0.001) and endothelial cell (p <0.001). VEGF expression in the tumour was correlated with its expression in the blood vessel (p <0.001). Endothelial cells marked for the PDGF-C and VEGF were also marked for CD105 and their nuclei for KI-67 confirming its neoangiogenic and proliferative pattern. The nuclear staining on tumour cells for VEGF had an impact on survival (p = 0.002), as well as the cases with nuclear staining for HIF-1 and VEGF (p = 0.005). In conclusion, this study showed that HIF-1 expression is associated with VEGF and PDGF-C and correlated with angiogenesis on GBM.

A heterogeneidade intratumoral é um fenômeno extremamente importante para entender a progressão tumoral e a resposta à intervenção terapêutica. A galectina-3 pertence à família das lectinas, possuem a função de reconhecimento e ligação à ?-galactosídeos ramificados de glicolipídeos e glicoproteínas, e está envolvida em processos fisiológicos e patológicos como o câncer. Nesse trabalho, a heterogeneidade intratumoral em relação à expressão de galectina-3 foi observada em amostras de diferentes lesões melanocíticas de pacientes. Além disso, o inóculo de células de melanoma murino negativas para galectina-3 em animais gal3-/- gerou tumores constituídos por uma fração de células tumorais que passaram a expressar de novo galectina-3, sugerindo que pressões do microambiente tumoral modulam a expressão dessa lectina em melanomas. A acidose extracelular atuou como regulador negativo de galectina-3 in vitro, diminuindo a expressão dessa lectina tanto em células de melanoma murino e humano quanto em melanócito murino. Entretanto, a hipóxia, seja pela exposição aguda ou intermitente, não alterou a expressão in vitro de galectina-3 em células de melanoma humano. Por fim, tumores originados pelo inóculo de células tumorais positivas e negativas para galectina-3 (mimetizando tumores heterogêneos) obtiveram a maior taxa de crescimento tumoral comparados aos tumores constituídos por uma única população de células, seja positiva ou negativa para galectina-3. Portanto, foram apresentadas evidências de que a heterogeneidade intratumoral em relação à galectina-3 parece estar envolvida com o sucesso evolutivo do melanoma e que a acidose é indicada como uma das pressões microambientais que contribuem para o estabelecimento e manutenção da fração de células tumorais negativas para galectina-3 dentro da massa tumoral / The intratumoral heterogeneity observed in human tumors is extremely important to understand tumor progression and its therapeutic response. Galectin-3 belongs to animal lectin family and it is a ?-galactosidase binding protein which is involved in physiological and pathological processes, including cancer. In this work, an intratumor heterogeneous galectin-3 expression was observed in tissue sessions containing different human melanocytic lesions. Moreover, negative galectin-3 murine cells injected into gal3-/- mice were able to generate tumors composed of a positive galectin-3 cell fraction, suggesting that selective forces in tumor microenvironment modulate galectin-3 expression in melanoma. Extracellular acidosis acts as a negative regulator to galectin-3 in vitro, decreasing its expression in murine and human melanoma cells and even in murine melanocytes. However, intermittent or acute hypoxia exposure did not alter galectin-3 expression in human melanoma cells in vitro. In addition, tumors originated from a mixture of positive and negative galectin-3 cells (mimicking heterogeneous tumors) showed higher growth rate compared to those derived from only galectin-3 positive or negative cells. Therefore, we showed evidences that galectin-3 intratumoral heterogeneity seems to be involved with the evolutionary success of melanoma and that acidosis may be the microenvironmental pressure responsible for the establishment and maintenance of galectin-3 negative cell fraction into the tumor bulk