L'adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire joue un rôle clé dans leur prolifération,leur différenciation ou l'apoptose. Par conséquent ce processus est critique pour undéveloppement normal et pour l'homéostasie tissulaire. La dérégulation de ce mécanismecontribue souvent à des situations pathologiques. Ainsi, la dérégulation de nombreux gènesimpliqués dans les adhérences cellule-cellule ou cellule-matrice extracellulaire sont liés à despathologies conduisant à un défaut de développement, la progression tumorale, oul'inflammation.Les intégrines sont des récepteurs transmembranaires hétéro dimériques jouant un rôlemajeur dans les interactions cellule-matrice extracellulaire. Ce rôle n'est pas limité à unesimple interaction mécanique puisqu'elles permettent également la transduction dessignaux de la matrice extracellulaire à la cellule afin de permettre à cette dernière des'adapter à son micro environnement. Dans le but d’étudier le rôle des intégrines à chaîneβ1 dans le développement osseux, le laboratoire a mis en place un modèle murind'inactivation conditionnelle du gène Itgb1 basée sur l'expression de la recombinase Cre austade pré-ostéoblastique. Les souris mutées présentent un défaut de développementosseux, dû à une faible prolifération des ostéoblastes.Contrairement à ce qui était généralement admis, cette faible prolifération desostéoblastes est indépendante de la voie classique mettant en jeu la voie classique des MAPkinases. En revanche, elle est contrôlée par la voie Hippo: cette signalisation a étérécemment identifiée chez la Drosophile et les Mammifères comme un mécanismeinhibiteur majeur de la prolifération cellulaire. Le cofacteur de transcription YAP, effecteurfinal de cette voie, est une navette nucléo-cytoplasmique. Son expression est amplifiée dansdivers cancers dont l'ostéosarcome où cette surexpression associée à celle de l’Itgb1 est unfacteur de mauvais pronostique.Mes travaux consistent à comprendre comment les intégrines à chaîne β1 contrôlent lavoie Hippo, et donc la prolifération. Nous avons confirmé que la délétion des intégrines β16active la phosphorylation de YAP et sa séquestration dans le cytoplasme. En utilisant destechniques de Biologie Cellulaire et de Biochimie, nous avons montré que suite à la délétionde l’Itgb1, les cellules présentent un défaut de trafic vésiculaire réduisant la translocationmembranaire de Rac1. La séquestration cytoplasmique de Rac1 diminue l’activation de soneffecteur majeur la kinase PAK responsable de la dissociation d'un complexe membranaired'inactivation composé de la protéine adaptatrice NF2, la kinase LATS et de son effecteurprincipal YAP. Les intégrines en provocant la perte de ce complexe induisent ladéphosphorylation de YAP, sa translocation nucléaire et donc stimulent la proliférationcellulaire. / Cell adhesion to the extracellular matrix plays a key role in their proliferation,differentiation or apoptosis. Therefore, this process is critical for normal development andtissue homeostasis. The deregulation of this mechanism often contributes to pathologicalsituations. Thus, the deregulation of many genes involved in cell-cell or cell-extracellularmatrix adhesions are linked to pathologies leading to developmental defects, tumorprogression, or inflammation.Integrins are heterodimeric transmembrane receptors that play a major role in cellextracellularmatrix interactions. This role is not limited to a simple mechanical interactionsince integrins also allow the transduction of the signals from the extracellular matrix to thecell in order to permit the latter to adapt to its microenvironment. In order to study the roleof β1 integrins in bone development, the laboratory has implemented a mouse model withconditional inactivation of the Itgb1 gene based on the expression of recombinase Cre at thepre-osteoblastic stage. The mutated mice show a defect in bone development due to a lowproliferation rate of osteoblasts.Contrary to what was generally accepted, this reduced proliferation is independent of theclassical pathway involving the classical pathway of MAP kinases. On the other hand, it iscontrolled by Hippo: this signaling pathway has recently been identified in Drosophila andMammals as a major inhibitory mechanism of cell proliferation. The transcription cofactorYAP, the end effector of this pathway, is a nucleo-cytoplasmic shuttle. Its expression isamplified in various cancers including osteosarcoma where this overexpression associatedwith that of Itgb1 is a factor of poor prognosis.My work involves understanding how β1 integrins control the Hippo pathway, and thusproliferation. We confirmed that deletion of β1 integrins activates the phosphorylation ofYAP and its sequestration in the cytoplasm. Using Cell Biology and Biochemistry techniques,we showed that following the deletion of Itgb1, the cells exhibit a defect in vesicular trafficthat reduces the membrane translocation of Rac1. The cytoplasmic sequestration of Rac18decreases the activation of its major effector, the PAK kinase. PAK is responsible for thedissociation of an inactivating membrane complex composed of the adaptor protein NF2,the LATS kinase, and its main effector YAP. The integrins by provoking the loss of thiscomplex induce the dephosphorylation of YAP, its nuclear translocation, and thus stimulatecell proliferation.

Les ciliopathies sont un groupe de maladies génétiques multi-systémiques liées à un dysfonctionnement du cil primaire, une structure sensorielle présente à la surface des cellules qui régule des voies de signalisation clés au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Afin d'identifier de nouveaux gènes responsables de ciliopathies développementales sévères, ~ 500 patients / fétus ont été analysés par une approche de séquençage à haut débit de l'exome ciblant > 1 200 gènes ciliaires ("ciliome"). Nous avons identifié huit nouvelles mutations dans le gène NEK8/NPHP9 chez cinq familles dont les syndromes se chevauchent. NEK8/NPHP9 code une protéine kinase de la famille des NIMA qui se localise au niveau du compartiment Inversine du cil primaire et agit comme un régulateur de la signalisation Hippo, une voie essentielle contrôlant la taille des organes. Nous montrons pour la première fois que les mutations du gène NEK8 sont associées à une agénésie rénale et une hypodysplasie. De plus, notre travail met en évidence une corrélation génotype/phénotype: les mutations "perte de fonction" de NEK8 conduisant à reins élargies et kystiques, des kystes pancréatiques et hépatique, alors que les mutations faux-sens de NEK8 causent une hypodysplasie/agénésie rénale associée à une cardiopathie et une paucité des canaux biliaires. La première partie de mon projet de thèse porte sur l'étude de l'impact des mutations faux-sens de NEK8 sur divers processus cellulaires et des voies de signalisation dépendantes de NEK8. Nous avons démontré un effet "gain de fonction" des mutations faux-sens de NEK8 puisqu'elles affectent la ciliogenèse et la composition du compartiment Inversine (localisation ciliaire de ANKS6). De plus, ces mutations altèrent la localisation nucléaire de YAP, le principal acteur de la voie Hippo, ainsi que l'expression des gènes cibles de YAP dans les fibroblastes de patients et dans la lignée cellulaire rénale (mIMCD3) invalidée pour NEK8. De même, nous avons montré une accumulation anormale de YAP nucléaire dans les reins polykystiques de la souris Jck, porteuse d'une mutation faux-sens de Nek8. Un déséquilibre de la voie Hippo serait donc à l'origine des défauts de morphogenèses épithéliales. En effet, les cellules mIMCD3 invalidées pour NEK8 forment en culture 3D des structures anormales et/ou des sphères élargies qui s'accompagnent d'une persistance du marquage nucléaire de YAP et Ki-67 et forment de grandes sphères par rapport aux cellules contrôles. Des défauts plus sévères ont été observés pour les cellules ré-exprimant les différents mutants de NEK8, confirmant la pathogénicité de ces mutations et leur effet "gain de fonction". Enfin, le traitement par la Vertéporfine, un inhibiteur spécifique de l'activité transcriptionnelle de YAP, améliore non seulement le phénotype des fibroblastes de patients et des cellules rénales invalidées pour NEK8 en culture 3D, mais également in vivo les anomalies observées chez les embryons de poisson zèbre dues à la surexpression de la forme NEK8 humaine, confirmant ainsi l'implication d'une dérégulation de YAP dans les mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, nous avons observé que les mutants de NEK8 s'accumulent de manière anormale au niveau de l'appareil de Golgi dans les fibroblastes de patients, et que cet appareil de Golgi apparait dispersé. Nos résultats montrent que le recrutement de NEK8 au Golgi est sensible à la Brefeldine A et dépendrait donc de ARF1, une petite GTPase impliquée dans le trafic de protéines entre les compartiments du Golgi et du réticulum endoplasmique. Nous avons démontré que NEK8 interagit et co-localise préférentiellement avec la forme d'ARF1 liée au GDP, suggérant pour NEK8 une possible fonction de facteur d'échange d'ARF1 à des sites spécifiques (appareil de Golgi, membranes, cil) afin de promouvoir le trafic vésiculaire de protéines telles que les protéine ciliaires. (...) / Ciliopathies are a group of genetic multi-systemic disorders related to dysfunction of the primary cilium, a sensory organelle present at the cell surface that regulates key signaling pathways during development and tissue homeostasis. In order to identify novel genes whose mutations would cause severe developmental ciliopathies, ~500 patients/fetuses were analyzed by a targeted high throughput sequencing approach allowing exome sequencing of > 1200 ciliary genes. We have identified eight novel mutations in NEK8/NPHP9 in five independent families with severe overlapping syndromic disorders. NEK8/NPHP9 encodes a NIMA-related kinase that localizes at the inversin compartment of the primary cilium and acts as a regulator of Hippo signaling, a pathway that is essential for control of organ size during development. We show for the first time that NEK8 mutations are associated with renal agenesis and hypodysplasia, and our work highlights a genotype/phenotype correlation with NEK8 loss-of-function mutations leading to enlarged cystic kidney, pancreas and liver, whereas NEK8 gain-of-function (missense) mutations cause renal hypodysplasia, cardiopathy and paucity of bile ducts. The first part of my thesis project focuses on the study of the impact of these NEK8 missense mutations on various cellular processes and NEK8-dependent signaling pathways. We demonstrate that NEK8 missense mutations impair the Inversin (INVS) compartment composition and ciliogenesis, and also alter the nuclear localization of the main Hippo signalling effector, YAP, as well as expression of its target genes in patient fibroblasts and renal cell lines. We also demonstrated that this Hippo pathway imbalance causes epithelial morphogenesis defects in 3D matrigel culture. Indeed, mIMCD3 cells depleted for NEK8 showed persistent YAP and Ki-67 staining and formed bigger spheres compared to control cells. Abnormal sphere volume was also observed in cells re-expressing NEK8-GFP mutations, suggesting their pathogenicity. We confirm these data in vivo in Jck mice, a model of polycystic kidney disease bearing a Nek8 missense mutation. Finally, treatment with Verteporfin, a specific inhibitor of YAP transcriptional activity, improves the mutant phenotype of both cellular models and zebrafish embryos overexpressing human NEK8, further supporting the involvement of YAP dysregulation in the pathogenic cellular mechanisms. Surprisingly, in patient fibroblasts, we showed that mutated NEK8 accumulates at the Golgi that appeared dispersed. NEK8 recruitment at the Golgi apparatus is dependent on ARF1 (Brefeldin A sensitive), a small GTPase involved in protein trafficking between Golgi compartments and ER. We notably demonstrated that NEK8 mostly interacts and localizes with the dominant negative form of ARF1 (T31N), suggesting that NEK8 could act as an activator (GEF) of ARF1 to promote vesicular trafficking of ciliary proteins. The second part of my project focuses on a new candidate gene for which a missense homozygous mutation has been identified in 3 individuals presenting a late onset NPH with hepatic fibrosis. This gene encodes ANKS3, an evolutionarily conserved protein whose function is still poorly characterized. Interestingly, ANKS3 has been reported to be a partner of NEK8, even though we showed it does not localize at the INVS compartment with NEK8 but is rather present at the base of cilia in fibroblasts. We showed that the missense mutation does not affect ANKS3 localization but leads to longer cilia and abnormal accumulation of NEK8 at the cilium base in patient fibroblasts and kidney tubules. Altogether, my work focused on NEK8 and its partners, ANKS6 and ANKS3, each of whose related gene is mutated in patients presenting a broad clinical spectrum of phenotypes. (...)

This thesis traces the development of Augustine's paradigm of the two cities (the City of God and the earthly city) in the cultural poetics of the English Renaissance. Although scholars have studied the impact of Augustine's model on theology, historical consciousness, and political theories in the Middle Ages and Renaissance, little attention has been paid to the genealogy of the more specifically "literary" aspects of the idea of the two cities. My line of inquiry is the relationship between Augustine's model of the two cities and the idea of drama. More specifically, this project explores the ways in which the idea o f the two cities spoke to various communities—of readers, of worshippers, and ultimately, of playgoers. Augustine's view of drama is divided; on the one hand, he speaks at length about the evil influence of Roman spectacles, but on the other hand, he acknowledges that the world itself is a theatre for God's cosmic drama. However, this employment of drama is limited in Augustine's writing, because his greater commitment is to the idea of Scripture. This interplay between drama and Scripture, I suggest, is an integral part of the two-cities model that is related to his theology of history. The tension between the idea of drama and the idea o f the book is evident in English Reformation appropriations of Augustine's model, such as those of John Bale and John Foxe, who changed the terminology to "the two churches." The second section of my thesis shows how these Reformers contained their own "dramatic" adaptations of the two cities within an even narrower theatre than Augustine's—a theatre constituted and contained by the Word. Shifting the focus to secular drama, the final section concerns Shakespeare's use of some facets of the two-cities model in his Jacobean plays, and examines the effects of removing this construct from its religious context. The result, I argue, is a theatre that celebrates its own aesthetic power and flaunts its sheer physicality, resisting the presumed stability of the written word.

Les cancers gastro-intestinaux, en particulier les cancers colorectaux (CCR) et les cancers gastriques (CG), sont des pathologies agressives avec des taux de mortalité élevés dans le monde. Ces cancers sont caractérisés par la dérégulation de voies de signalisation cellulaire telles que les voies Wnt, Notch et Hippo qui jouent un rôle très important dans la tumorigenèse gastro-intestinale. L’activité des différents facteurs de transcription impliqués dans ces voies de signalisation nucléaire est contrôlée par de nombreux corégulateurs transcriptionnels. Ces travaux de thèse ont porté sur deux corégulateurs transcriptionnels initialement identifiés comme des partenaires des récepteurs nucléaires, à savoir RIP140 et LCoR. L’objectif a été d’explorer l’expression de ces deux facteurs de transcription dans les cancers gastro-intestinaux ainsi que leur rôle dans les cancers gastriques principalement au travers du dialogue avec la voie de signalisation Hippo. L’analyse par immunohistochimie de l'expression de RIP140 et LCoR dans les cancers colorectaux et gastriques a montré que les niveaux d’expression de ces deux corégulateurs transcriptionnels sont fortement corrélés. Dans les CCRs, leur expression tend à diminuer dans le tissu tumoral par rapport au tissu normal adjacent, alors que dans les CGs, les niveaux d’expression de RIP140 et LCoR sont significativement plus élevés dans la tumeur que dans l’épithélium sain. Des corrélations significatives ont été observées avec les paramètres clinicopathologiques des patients (stade TNM et différenciation tumorale) ainsi qu’avec d’autres protéines clés impliquées dans la progression et l'invasion tumorale (incluant E-cadhérine et Cox-2). L'analyse de la survie a montré que les patients atteints de CCR avec des tumeurs LCoRlow/RIP140high ont une durée de survie plus longue. Dans le CG, l'expression élevée de RIP140 ou de LCoR a été identifiée comme un marqueur de mauvais pronostic suggérant un rôle clé de ces deux gènes dans cette malignité.Pour mieux cerner le rôle de RIP140 dans le CG, nous avons utilisé les lignées cellulaires MKN45 et MKN74 de cancer de l’estomac humain avec une surexpression ectopique du gène RIP140 ou au contraire avec une diminution de son expression. Nos résultats ont montré que l'expression de RIP140 est associée à un effet anti-prolifératif à travers une régulation positive de l'expression du gène p21WAF1/CIP1. Nous avons également démontré que RIP140 réduit la migration des cellules MKN45 et MKN74 et augmente l'expression du gène E-cadhérine au niveau transcriptionnel. D’une manière intéressante, nos résultats suggèrent aussi que RIP140 régule la voie de signalisation Hippo à travers l’activation de TEAD.Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que les gènes RIP140 et LCoR participent à la régulation de la tumorigenèse gastro-intestinale et que leurs niveaux d'expression ont une valeur pronostique dans ces cancers et pourraient servir de nouveaux biomarqueurs dans la caractérisation moléculaire de ces tumeurs. / Gastrointestinal cancers, particularly colorectal cancer (CRC) and gastric cancer (GC), are aggressive pathologies with a high mortality rate worldwide. These cancers are characterized by the deregulation of cellular signaling pathways such as the Wnt, Notch and Hippo pathways which play a very important role in gastrointestinal tumorigenesis. Moreover, it’s well established that the activity of the transcriptionnel factors involved in these nuclear signaling pathways is controlled by many transcriptionnel coregulators. This work focused on two transcriptional coregulators initially identified as partners of nuclear receptors, namely RIP140 and LCoR. The objective was to explore the expression of these two transcription factors in gastrointestinal cancers and their role in gastric cancers mainly through the dialogue with the Hippo signaling pathway.Immunohistochemical analysis of RIP140 and LCoR expression in colorectal and gastric cancers showed that the expression levels of these two transcriptional regulators are strongly correlated. In CRCs, their expression tends to decrease in tumor tissue compared to adjacent normal tissue, whereas in GCs, RIP140 and LCoR expression levels are significantly higher in the tumor as compared to normal stomach. Significant correlations were observed with clinicopathological parameters (TNM stage and tumor differentiation) as well as the expression levels of key proteins involved in tumor progression and invasion (E-cadherin and Cox-2). Survival analysis showed that CRC patients with LCoRlow/RIP140high tumors have a significant prolonged OS and DFS. In GC, high RIP140 or LCoR expression was identified as an independent marker of poor prognosis suggesting a key role in this malignancy.Further, we investigated the role of RIP140 in gastric cancer cell lines using human epithelial GC cell lines overexpressing or not RIP140. In both MKN45 and MKN74 cells we showed that RIP140 exerted an anti-proliferative effect through the induction of p21WAF1/CIP1 gene expression. We also demonstrated that RIP140 reduced GC cell migration and increased E-cadherin expression at the transcriptional level. Interestingly, our results also suggest that RIP140 regulates the Hippo signaling pathway through TEAD activation.In conclusion, our findings suggest that RIP140 and LCoR genes contribute to the regulation of gastrointestinal cancers and that their expression levels have a prognostic value in these pathologies. Moreover, both RIP140 and LCoR transcriptional coregulaters could serve as novel biomarkers in the molecular characterization of colorectal and gastric cancers.

This thesis traces the development of Augustine's paradigm of the two cities (the City of God and the earthly city) in the cultural poetics of the English Renaissance. Although scholars have studied the impact of Augustine's model on theology, historical consciousness, and political theories in the Middle Ages and Renaissance, little attention has been paid to the genealogy of the more specifically "literary" aspects of the idea of the two cities. My line of inquiry is the relationship between Augustine's model of the two cities and the idea of drama. More specifically, this project explores the ways in which the idea o f the two cities spoke to various communities—of readers, of worshippers, and ultimately, of playgoers. Augustine's view of drama is divided; on the one hand, he speaks at length about the evil influence of Roman spectacles, but on the other hand, he acknowledges that the world itself is a theatre for God's cosmic drama. However, this employment of drama is limited in Augustine's writing, because his greater commitment is to the idea of Scripture. This interplay between drama and Scripture, I suggest, is an integral part of the two-cities model that is related to his theology of history. The tension between the idea of drama and the idea o f the book is evident in English Reformation appropriations of Augustine's model, such as those of John Bale and John Foxe, who changed the terminology to "the two churches." The second section of my thesis shows how these Reformers contained their own "dramatic" adaptations of the two cities within an even narrower theatre than Augustine's—a theatre constituted and contained by the Word. Shifting the focus to secular drama, the final section concerns Shakespeare's use of some facets of the two-cities model in his Jacobean plays, and examines the effects of removing this construct from its religious context. The result, I argue, is a theatre that celebrates its own aesthetic power and flaunts its sheer physicality, resisting the presumed stability of the written word. / Arts, Faculty of / English, Department of / Graduate

Les petites GTPases RAS alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Ce mécanisme permet aux protéines RAS de transmettre les signaux des récepteurs se trouvant à la surface cellulaire vers divers réseaux de signalisation en aval. La protéine RAS joue un rôle important dans plusieurs fonctions biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et même l'apoptose. Les mutations des gènes de la famille RAS sont retrouvées dans environ un tiers des tumeurs. HRAS, KRAS et NRAS, les trois principaux homologues de la protéine RAS, sont principalement mutées au niveau des codons 12, 13 ou 61. Les mutations avec un effet de gain de fonction au niveau de ces codons rendent ces protéines RAS constitutivement actives et sont à l’origine des signaux hyperprolifératifs. Depuis la découverte de la protéine RAS, de nombreuses "protéines effectrices RAS" agissant en aval ont été identifiées. Le rôle biologique de la plupart de ces effecteurs RAS est lié à la prolifération et à la survie des cellules. Cependant, au cours des deux dernières décennies une nouvelle famille d'effecteurs RAS, les protéines RASSF, a été découverte comme ayant une fonction pro-apoptotique. Les protéines suppresseures de tumeurs de la famille RASSF sont fréquemment inhibées dans les cellules cancéreuses humaines. Il existe 10 homologues de RASSF (RASSF1-10) chez humain, chacun comprenant un domaine d'association RAS (RA) impliqué dans la liaison avec les GTPases RAS. Plusieurs RASSF comportent également les domaines SARAH (Salvador-RASSF-Hippo), connus pour interagir avec les kinases Hippo contenant aussi les domaines SARAH. On ne sait toutefois pas si toutes les protéines RASSF sont de véritables effecteurs RAS. Il a été démontré qu'un seul membre de la famille RASSF, appelé RASSF5, s'associe directement à HRAS et cette interaction a été validée par des études cristallographiques à rayons X. Dans la première partie de cette thèse, je démontre qu'aucun autre membre de la famille RASSF n'interagit directement avec KRAS. En me servant de la modélisation par l'homologie du domaine RA hautement apparenté de RASSF1, j’ai identifié les acides aminés essentiels pour l’interaction avec la GTPase. Je démontre que la substitution d’un seul acide aminé dans la protéine RASSF1 permet l'interaction avec KRAS, et je pose l'hypothèse que ce résidu, ayant divergé au cours de l'évolution, a modifié la spécificité de RASSF1 pour les petites GTPases. En utilisant une approche informatique, nous avons prédit six GTPases candidates que pourraient interagir avec RASSF1 : GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS et DIRAS3. J'ai validé les interactions avec plusieurs GTPases RGK (GEM, REM1, REM2) et j’ai démontré que la co-expression des GTPases RGK avec RASSF1 active la voie Hippo. Ainsi, je propose un nouveau lien entre ces GTPases peu étudiées et la régulation de la voie de signalisation Hippo. Dans la deuxième partie de ma thèse, je tente de rediriger la signalisation de prolifération cellulaire de KRAS (RAF/MAPK) vers une signalisation impliquant les effecteurs pro-apoptotiques (RASSF-Hippo). Pour y parvenir, j'ai conçu des mutations dans KRAS dans le but d’augmenter son affinité pour RASSF5 et d’affaiblir son interaction avec BRAF. Comme deuxième stratégie, j'ai remplacé les résidus divergents de l'effecteur RASSF1 par les résidus correspondants de RASSF5 et j’ai démontré que cette variante de RASSF1 est capable de lier KRAS. Diverses approches biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour valider KRAS et RASSF1 mutés, impliquées dans cette signalisation redirigée. Les études de co-localisation montrent que ces mutants interagissent avec leurs nouveaux partenaires comme prévu. D’autre part, je démontre par les expériences intracellulaires que KRAS modifiée ne lie plus BRAF tout en interagissant fortement avec RASSF5 et RASSF1, et que les mutants établis activent la voie Hippo. Ainsi, j'ai développé deux approches qui nous aideront à étudier la signalisation de KRAS dans la voie pro-apoptotique impliquant RASSF en absence de l’activation de la voie des MAP kinases. Les données présentées ici nous permettent de mieux comprendre la manière dont les protéines RASSF ont divergé au cours de l'évolution; cette divergence leur empêchant d’interagir avec les RAS. Ces données fournissent également une stratégie innovante pour rediriger les signaux RAS vers les effecteurs RASSF, qui pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie dans les études cliniques utilisant RAS comme cible thérapeutique. / RAS small GTPases function as molecular switches to transduce signals from cell surface receptors to various downstream signalling networks. The RAS protein has roles in multiple biological functions, including cell proliferation, survival, and even apoptosis. Mutations in RAS genes are present in up to 30% of all human tumors. The three major RAS homologs HRAS, KRAS, and NRAS are each found mutated, predominantly at codons 12, 13 or 61. Gain-of-function mutations at these codons render these RAS proteins constitutively active and thereby produce hyperproliferative signals. Since the discovery of RAS, numerous downstream ‘RAS effector proteins’ have been identified. The biological role of most identified RAS effectors relates to cell proliferation and survival, however, in the past two decades a new family of RAS effectors, RASSF proteins, were discovered to have a pro-apoptotic function. The RASSF family of tumor suppressors proteins are frequently downregulated in human cancer cells. There are 10 RASSF homologs (RASSF1-10) in humans, each comprising a RAS association (RA) domain presumed to bind RAS GTPases. RASSF also encode SARAH (Salvador-RASSF-Hippo) domain, known to interact with SARAH-containing Hippo kinases. It is not clear whether all the RASSF proteins are true RAS effectors. Only a single family member, RASSF5, has been shown to directly associate with HRAS and this interaction has been completely validated by X-Ray crystallographic studies. In the first part of this thesis, I demonstrate that no other RASSF family members directly interact with KRAS. I used homology modelling of the highly related RASSF1 RA domain to identify amino acids crucial to GTPase binding. I show that a single amino acid substitution in RASSF1 enables interaction with KRAS, and hypothesize that this evolutionarily diverged residue has altered RASSF1 specificity for small GTPases. Using an informatics approach, we predicted six candidate GTPases that could interact with RASSF1: GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS and DIRAS3. I validated interactions with several RGK GTPases (GEM, REM1, REM2) and show that co-expression of RGK GTPases with RASSF1 activates the Hippo pathway. Thus, I show a novel link between these unstudied GTPases to Hippo pathway regulation. In the second part of my thesis I attempt to rewire KRAS signalling from cell proliferation pathways (RAF/MAPK) to pro-apoptotic effectors (RASSF-Hippo). To achieve this, I designed mutations in KRAS that augmented its affinity for RASSF5 and weakened interaction with BRAF. As a second strategy, I reverted evolutionarily diverged residues in the RASSF1 effector to corresponding residues in RASSF5 and demonstrate that this variant now binds KRAS. Various biophysical and biochemical approaches were used to validate both the KRAS and RASSF1 rewired mutants, and co-localization studies show that these mutants interact with their new binding partners as predicted. Further, I demonstrate that our rewired KRAS no longer binds BRAF in cells but interacts strongly with RASSF5 and rewired RASSF1, and that the rewiring mutants activate the Hippo pathway. Thus, I have developed two rewiring approaches that will help us to study KRAS signalling towards pro-apoptotic RASSF pathway in the absence of strong MAP kinase activation. The data presented here provide several novel insights into how RASSF proteins diverged through evolution and are not all direct effectors of RAS. In addition, I present an innovative rewiring strategy to couple RAS signals towards RASSF effectors which can be a clinical tactic to target RAS oncogenesis.

RAS est une GTPase qui transduit les signaux extracellulaires envers des voies de signalisation intracellulaires, en liant ses effecteurs. RAS peut activer la voie Hippo qui inhibe la croissance cellulaire et qui est souvent dérégulée dans le cancer. Les protéines RASSF suppresseurs de tumeurs relient RAS à la voie Hippo. L’expression exogène de KRASG12V avec RASSF1 ou RASSF5 conduit à l'activation de la voie Hippo, bien que KRAS et RASSF1 ne s’associent pas directement. Ce projet de maîtrise vise à identifier les protéines impliquées dans l'activation de la voie Hippo par RAS. Nous avons effectué plusieurs expériences BioID, une technique qui permet d’identifier les interacteurs proximaux d’une protéine d’intérêt, dans des lignées cellulaires U2OS stables et inductibles exprimant les protéines KRASG12V, RASSF1 ou RASSF5 seules ou coexprimées, permettant de comparer les conditions où la voie Hippo inactive ou active. Nous avons élucidé l'interactome d'un mutant de KRAS avec affinité accrue envers RASSF5 et affinité réduite envers RAF, permettant d’étudier les voies activées en aval de RASSF5, avec une activation réduite de la voie MAPK. Nos données montrent que RASSF1 et RASSF5 relâchent les kinases Hippo MST1 et MST2 lorsque la voie Hippo est active, conformément aux données in vitro démontrant un rôle inhibiteur de l'interaction RASSF/MST. De plus, nous avons démontré que KRAS est un interacteur proximal des protéines VAMP3 et SNAP23. Comprendre comment l'oncoprotéine RAS active des effecteurs et des voies de signalisation moins étudiés, en particulier ceux qui ont des fonctions suppressives de tumeurs a des implications importantes pour le développement de nouvelles thérapies ciblées pour les cancers induits par RAS. / RAS is a small GTPase that transduces signals from membrane-bound receptors to intracellular pathways, by signaling to downstream effector proteins. RAS can activate the Hippo pathway, a growth-suppressive pathway that is often dysregulated in cancer. The tumor suppressor RASSF proteins link RAS to Hippo signaling. Co-expression of KRASG12V with either RASSF1 or RASSF5 leads to Hippo pathway activation, despite KRAS and RASSF1 not being direct binding partners. This M.Sc. project aims to identify proteins that are involved in RAS-mediated activation of the Hippo pathway. We performed BioID, a proteomic technique which is used to identify the proximal interactors of a protein of interest, in stable and inducible U2OS osteosarcoma lines expressing KRASG12V, RASSF1, or RASSF5 proteins alone, as well as in lines co-expressing both KRASG12V and the RASSF proteins, allowing for a comparison between inactive and active Hippo pathway interactomes. Furthermore, we mapped the interactome of a double mutant of KRAS that displays increased affinity for RASSF5 and decreased affinity for the effector RAF, allowing us to study KRAS signaling downstream of RASSF5, with decreased activation of the MAPK pathway. Our BioID data shows that RASSF1 and RASSF5 disengage the Hippo kinases MST1 and MST2 when the Hippo pathway is active, in line with the inhibitory role of the RASSF/MST interaction observed in vitro. Furthermore, we show that KRAS is a proximal interactor of the SNARE proteins VAMP3 and SNAP23. Understanding how the oncoprotein RAS signals to less studied effectors and pathways, particularly those with tumor suppressive functions has significant implications for understanding oncogenesis, and for development of new targeted therapies for RAS-driven cancers.

Thesis (MPhil (Ancient Studies))--University of Stellenbosch, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: Although St Augustine of Hippo (354–430 C.E.) was raised as a Christian, he refuted Catholicism as a youth in his search for divine wisdom and truth. Like the biblical prodigal son, he first had to realise the error of his aversion (turning away from the Catholic Church) before he could experience conversion (returning to the Catholic faith). Augustine narrates certain central events of his life in the Confessiones as a series of conversions, leading him from his native Roman North Africa to his conversion to Catholic Christianity in the Imperial City of Milan. Philosophy, especially Neo-Platonic thought, played a crucial role in his conversion process, as did the influence of St Ambrose, Bishop of Milan, and other Neo-Platonic intellectuals in Milan. Neo- Platonism also influenced Augustine's conception of the imago Dei (image of God). Although Augustine’s teaching of the concept of the imago Dei is found in all his works (but mainly in De Trinitate), a survey of the literature has shown that the way in which this concept is used to inform, structure and advance his conversion narrative in the Confessions, has not yet been investigated in a structured manner. In order to address this gap in scholarly knowledge, the thesis attempts to answer the following research question: How did the concept of the imago Dei inform and structure Augustine's conversion narrative, as recounted in his Confessiones, taking into account the theological and philosophical influences of Ambrose and the Neo-Platonists of Milan on his spiritual development? The investigation was conducted by an in-depth study and analysis of the Confessiones and relevant secondary literature within the historical, philosophical and religious framework of the work. An empirical approach, by means of textual analysis and hermeneutics, was used to answer the research question. The analysis of the Confessions is limited to its autobiographical part (Books 1 to 9). In order to carry out the analysis, a theoretical and conceptual framework was posited in Chapters 1 to 4, discussing the key concepts of conversion and of the imago Dei, as well as explaining the influence of Neo-Platonism and Ambrose on Augustine. In Chapter 5, this conceptual framework of the nature of the imago Dei is complemented by a literary framework for the Confessions to form a metaframework. The textual analysis was done within the meta-framework with reference to certain endowments (attributes) imprinted in the image, namely personality, spirituality, rationality, morality, authority, and creativity. The main conclusion is that Augustine's personal relationship with God had been harmed by the negative impact of sin on these endowments of the divine image in him. His gradual realisation that God is Spirit, his growth in faith, and his eventual acceptance of the authority of Scripture and of the Catholic Church, brought about the healing of the broken image of God in Augustine and also the restoration of God’s likeness in him. This enabled Augustine to be reconciled to God through Christ, who is the perfect Image of God, and helped to convert him to the Catholic Church, which is the Body of Christ. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Alhoewel die Heilige Augustinus, Biskop van Hippo (354–430 n.C.), as Christen grootgemaak is, het hy as jong man die Katolisisme verwerp in sy soektog na goddelike wysheid en waarheid. Soos die verlore seun van die Bybel, moes hy eers die fout van sy afkerigheid (wegdraai van die Katolieke Kerk) insien voordat hy tot bekering (terugkeer tot die Katolieke geloof) kon kom. Augustine vertel sekere kerngebeure van sy lewe in die Confessiones (Belydenisse) as ‘n reeks van bekeringe, wat hom gelei het van sy geboorteplek in Romeins-Noord-Afrika tot sy bekering tot die Katolieke Christendom in die Keiserstad Milaan. Filosofie, veral Neo-Platoniese denke, het ‘n deurslaggewende rol gespeel in sy bekeringsproses, soos ook die invloed van die Heilige Ambrosius, Biskop van Milaan, en ander Neo- Platoniese intellektuele in Milaan. Neo-Platonisme het ook Augustine se begrip van die imago Dei (Godsbeeld) beïnvloed. Alhoewel Augustinus se leer oor die begrip imago Dei in al sy werke aangetref word (maar veral in De Trinitate), het ‘n literatuurstudie uitgewys dat die manier waarop hierdie begrip gebruik word om sy bekeringsverhaal in die Confessions toe te lig, vorm te gee en te bevorder, nog nie op gestruktureerde wyse ondersoek is nie. Om hierdie leemte in vakkundige kennis te vul, poog hierdie tesis om die volgende navorsingsvraag te beantwoord: Hoe het die begrip imago Dei Augustinus se bekeringsverhaal toegelig en vorm gegee, soos vertel in sy Confessiones, met inagneming van die teologiese en filosofiese invloede van Ambrosius en die Neo-Platoniste van Milaan op sy geestelike ontwikkeling? Die ondersoek is uitgevoer deur middel van ‘n grondige studie en ontleding van die Confessiones en toepaslike sekondêre literatuur binne die historiese, filosofiese en godsdienste raamwerk van die werk. ’n Empiriese benadering, by wyse van teksontleding en hermeneutika, is gebruik om die navorsingsvraag te beantwoord. Die ontleding van die Confessiones is beperk tot die outobiografiese deel (Boeke 1 tot 9). Om die ontleding uit te voer, is ’n teoretiese en konseptuele raamwerk vooropgestel in Hoofstukke 1 tot 4, waar die sleutelbegrippe bekering en imago Dei bespreek is, asook die invloed van Neo-Platonisme en Ambrosius op Augustinus. In Hoofstuk 5 word hierdie konseptuele raamwerk vir die aard van die imago Dei aangevul deur ’n literêre raamwerk vir die Confessions om sodoende ‘n metaraamwerk te vorm. Die teksontleding is gedoen binne die metaraamwerk met verwysing na sekere geestesgawes (eienskappe) wat in die beeld neerslag vind, naamlik persoonlikheid, spiritualiteit, rasionaliteit, moraliteit, outoriteit, en kreatiwiteit. Die hoofgevoltrekking is dat Augustinus se persoonlike verhouding met God geskaad is deur die negatiewe impak van sonde op hierdie geestesgawes van die Godsbeeld in hom. Sy geleidelike besef dat God Gees is, sy groei in sy geloof, asook sy uiteindelike aanvaarding van die gesag van die Bybel en van die Katolieke Kerk, het meegebring dat Augustinus se gebroke Godsbeeld en -gelykenis herstel is. Daardeur is Augustinus met God versoen deur Christus, wat die volmaakte Godsbeeld is, en sodoende is hy bekeer tot die Katolieke Kerk, wat die Liggaam van Christus is.

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa resultante da expansão clonal de células mielóides positivas para o cromossomo Philadelphia. A patogênese da LMC está associada à expressão do oncogene BCR-ABL1, que codifica a proteína Bcr-Abl com constitutiva atividade da tirosina quinase, promovendo a mieloproliferação exacerbada e a resistência à apoptose das células leucêmicas. Os pacientes com LMC são tratados principalmente com inibidores de tirosina quinase (TKI), mas a resistência aos inibidores e a refratariedade tem sido relatada em alguns pacientes na fase crônica e na maioria dos pacientes em fases avançadas da doença. Assim sendo, continua a ser de suma importância a elucidação da patogênese da LMC e a busca de novos alvos terapêuticos, como os membros da via de sinalização Hippo e reguladores do ciclo celular, da família Aurora quinase. O presente estudo quantificou o nível de expressão de genes que codificam componentes da via de sinalização Hippo (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP e TAZ) e Aurora quinases A e B em: 1) pacientes com LMC em diferentes fases da doença, resistentes ou sensíveis à terapia com mesilato de imatinibe (MI), em indivíduos saudáveis e 2) linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr- Abl tratadas com TKI (imatinibe, dasatinibe e nilotinibe), KCL22 e LAMA84 resistentes e sensíveis ao MI. Os níveis de expressão dos genes alvo foram correlacionados com o índice de prognóstico de Sokal. Os principais resultados revelaram que há alteração nos genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA e AURKB em pacientes com LMC em relação aos controles. Não houve correlação entre o índice de Sokal e a expressão gênica dos genes da via Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 e TAZ, assim como os genes Aurora quinases A e B. Pacientes com LMC em fases avançadas apresentaram maiores valores de expressão dos genes TAZ e AURKB, comparado aos pacientes na fase crônica. Os pacientes resistentes ao TKI apresentaram as expressões dos genes MST1, TAZ e AURKB, significativamente mais elevadas, comparado aos pacientes sensíveis ao MI. Os resultados dos estudos em linhagens celulares indicaram principalmente que a expressão do gene LATS1 pode ser modulada pela atividade de tirosina quinase Bcr-abl e que o oncogene BCR-ABL1 induz a expressão de AURKA, AURKB, LATS1 e TAZ. Em conjunto os dados obtidos revelam que a alteração da expressão dos genes da família Aurora quinase, A e B, e dos genes que codificam proteínas da via Hippo contribui para a patogênese e progressão da LMC. O desenvolvimento de fármacos e/ou a identificação de marcadores tumorais para a via de sinalização Hippo e família Aurora quinase, podem otimizar o tratamento da LMC, aumentando a susceptibilidade das células leucêmicas a apoptose e levando a um melhor prognóstico da doença / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm resulting from clonal expansion of myeloid cells positive for the Philadelphia chromosome. The CML pathogenesis is associated with BCR-ABL1 oncogene expression, which encodes the Bcr-Abl protein with a constitutive tyrosine kinase activity, leading to leukemic cell high proliferation and resistance to apoptosis. CML patients are mainly treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI), but some of CML patients in chronic phase are resistant and in advanced phases are refractory to TKI. Thus, it is still relevant to elucidate the CML pathogenesis and seek to new therapeutic targets, including the Hippo signaling pathway members and cell cycle regulatory genes such as those encoding the Aurora kinase family. The present study quantified the RNA expression level of genes encoding components from the Hippo cell signaling pathway (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP, and TAZ) and Aurora kinase A and B in: 1) CML patients at different stages of the disease, in CML patients resistant or sensitive to imatinib mesylate therapy, healthy individuals and 2) in cell lines HL-60, HL-60.Bcr-Abl treated with TKI (imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib), KCL22 and LAMA84 resistant and sensitive to IM. The RNA expression levels of the target genes were also correlated to the CML Sokal\'s prognostic score values. The main results revealed that there are alterations in the genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA and AURKB in patients with CML in relation to the controls. There was no correlation between the Sokal index and the gene expression of the Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 and TAZ genes, as well as the Aurora kinase genes A and B. Patients with advanced phase CML had higher values of expression of the TAZ and AURKB genes, compared to the patients in the chronic phase. Patients resistant to TKI had significantly higher MST1, TAZ and AURKB gene expression compared to MI-sensitive patients. The results of the studies in cell lines indicated primarily that the expression of the LATS1 gene can be modulated by the Bcr-abl tyrosine kinase activity and the BCR-ABL1 oncogene induces the expression of AURKA, AURKB, LATS1 and TAZ. Together, the data show that altered expression of Aurora kinase family genes, A and B, and genes coding for Hippo pathway proteins contribute to the pathogenesis and progression of CML. The development of drugs and/or identification of tumor markers for the Hippo signaling pathway and the Aurora kinase family can optimize CML treatment by enhancing the susceptibility of leukemic cells to apoptosis and leading to a better disease prognosis

Les schwannomes sont des tumeurs bénignes se développant à partir d’une hyper-prolifération des cellules de Schwann suite à l’inactivation bi-allélique du gène NF2. Signe pathogonomique d’une pathologie rare et héréditaire, la Neurofibromatose de type 2 (NF2), ils peuvent aussi apparaître de façon sporadique. Hormis la chirurgie ou la radiothérapie, peu d’options pharmacologiques sont proposées aux patients porteurs de schwannomes, principalement à cause du peu de cibles thérapeutiques identifiées. Dans les cellules de Schwann, le phénotype cellulaire associé à la perte NF2 est une perte d’inhibition de la prolifération par le contact. Deux fonctions majeures de Merlin, produit de NF2, ont émergé au cours de ces dix dernières années. La première, démontrée par notre groupe, concerne la régulation de l’expression membranaire des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) qui s’accumulent à la membrane plasmique des schwannomes humains. Le second implique Merlin dans la régulation de la voie de signalisation Hippo. Cette dernière, activée par le contact cellulaire réprime l’activité de deux co-facteurs de transcription, Yap et Taz, et régule ainsi et aussi l’inhibition de contact. Les mécanismes moléculaires par lesquels Merlin inhibe l’activité de Yap/Taz sont toutefois méconnus. Le but de nos études a été de déterminer une signature moléculaire associée à la croissance des schwannomes humains et l’importance relative de Yap/Taz. Dans une analyse protéomique à grande échelle sur des biopsies humaines, nous avons identifié à la fois l’activation spécifique de cinq RTKs que sont le PDGFRβ, Her2, Her3, Axl et Tie2 ainsi qu’une accumulation nucléaire spécifique de Yap. Nous montrons que sur la totalité des protéines étudiées, seules Yap, le PDGFRβ et P-Her3 corrèlent avec la prolifération des cellules de schwannomes humain. De plus, Yap induit la transcription des RTK activés (à l’exception de Tie2). Nous plaçons donc Yap au centre des mécanismes de régulation de la croissance des schwannomes humains et proposons que son inhibition pourrait représenter une nouvelle et prometteuse stratégie thérapeutique pour réduire la croissance de ces tumeurs. Nous apportons une nouvelle lecture des fonctions de Merlin, qui, par une potentielle interaction directe avec Yap, inhibe spécifiquement sa translocation dans le noyau indépendamment d’une régulation par la densité cellulaire ou par la voie Hippo. Par ailleurs, Merlin ne semble pas essentiel à l’activation de la voie Hippo dans les cellules de Schwann soulignant une fonction nouvelle et inattendue de Merlin dans la régulation de Yap et de la voie Hippo. Enfin nous avons étudié le rôle d’AmotL1, un puissant partenaire de Merlin et membre de la voie Hippo, dans la migration et la progression des cancers du sein. Nous mettons en évidence une fonction antagoniste de Merlin et AmotL1 dans la promotion de ces mécanismes soulignant une autre fonction nouvelle de Merlin en tant que suppresseur de la progression de cancers non associés à NF2. / Schwannomas are benign tumors arising from Schwann cell hyper-proliferation under NF2 bi-allelic inactivation. They appear in the context of a rare hereditary disease called Neurofibromatosis type 2 (NF2) or in sporadic cases. To this day, surgery and radiotherapy remain the only options to treat these patients, mainly due to the lack of therapeutical targets identified. The NF2 loss associated cellular phenotype is the loss of cell contact inhibition. Two main functions of Merlin, the NF2 product, have emerged in the last decade. The first was shown by our group and consists in the accumulation of tyrosine kinase receptors (RTK) at the plasma membrane in schwannomas. The second involves Merlin in the regulation of the Hippo signaling pathway. This pathway is activated by cell contact and inactivates a couple of transcription co-factors, Yap and Taz, then participating in cell contact inhibition of proliferation. However, the mechanisms by which Merlin inactivates Yap and Taz remain unknown. In our studies, we aimed to determine both the molecular signature of human schwannomas taking advantage of a large proteomic study, and the relative importance of Yap in the tumor suppressor function of Merlin. We could show both a specific activation of five RTKs : PDGFRβ, Her 3, Her2, Axl and Tie2 and a specific nuclear accumulation of Yap in human schwannoma. Among all the protein studied, Yap, PDGFRβ and P-Her3 are the only ones to correlate with the proliferation of human schwannoma cells. Furthermore, the activated RTK (excepted Tie2) are transcriptional targets of Yap. Hence, we found Yap as a pivotal regulator of schwannoma growth and proposed its inhibition as a new and promising therapeutical target to reduce human schwannoma growth. In addition, we show that Merlin specifically inhibits Yap nuclear translocation into the nucleus of Schwann cells by a direct interaction which is independent from the regulation by cell density and by the Hippo pathway. Moreover, Merlin expression seems not to be essential for Hippo activation in Schwann cells which brings a new and unexpected role of Merlin in Yap and Hippo regulation. In the end, we studied the role of AmotL1, a strong Hippo partner of Merlin in the migration and progression of breast cancer. We could show an antagonist function of Merlin and AmotL1 in the promotion of these mechanisms highlighting a new progression suppressor function of Merlin in cancer which are not linked to NF2 mutations.