H1 linker histones are structural components of chromatin, generally implicated in the formation of “higher order” chromatin states. With eleven non-allelic subtypes in mammals, the H1 family is highly diverse. While they are commonly associated with chromatin compaction and transcription repression, these histones also play crucial roles in mouse development and stem cell differentiation. Although the prevailing belief is that H1 subtypes have redundant functions, their distinct amino acid composition and differential expression throughout development suggest subtype-specific roles. Previous studies have explored the roles and interactions of linker histones, but limitations in model systems, cell types, and subtypes studied have hindered our comprehensive understanding of the implications and synergy of multiple H1 linker histones. To gain insight into the individual and combined roles of linker histones in human embryonic stem cells (hESCs), we conducted an extensive study in which we systematically removed each somatic linker histone and looked at all potential combinations. Using RNA-seq and in-depth bioinformatic analysis, we discovered that linker histones in hESCs exhibit partial non-redundancy. We classified them into three main groups associated with distinct biological processes, particularly related to development and stem cell differentiation. We observed that depleting H1.1 or H1.5 influenced the proportion of mesodermal progenitor cells, with further impact when combined with specific H1 subtypes, resulting in changes in ectodermal progenitor cells. Additionally, we demonstrated that linker histones synergistically regulate interconnected biological pathways, potentially affecting early stem cell differentiation. Based on our findings, we propose that H1 subtypes regulate specific transcriptional programs, which in conjunction, are fundamental in the coordination of essential cellular processes involved in early human embryonic development, both in the ground state of hESCs and during stem cell differentiation. We anticipate that the generation of the H1 KO library described in our study will provide a novel tool for studying the role of linker histones in later stages of human development and will facilitate the comprehension of specific roles of these chromatin proteins in other relevant cellular processes.

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Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Chez les mammifères, le passage d’une génération à une autre nécessite la reprogrammation du génome. Cette reprogrammation nécessite la déméthylation de l’ADN parternel et maternel ainsi que celle des lysines des histones suite à la fécondation. Des familles d’enzymes ont récemment été associées à ces processus : les déaminases, notamment Aicda (activation-induced cytosine deaminase), et les Tet (Ten-eleven translocation) désoxygénase, Tet1, Tet2 et Tet3. Plusieurs déméthylases des lysines des histones (KDM) ont été identifiées au cours des dernières années mais très peu d’informations sont disponibles à leur sujet, particulièrement en ce qui a trait à l’embryon bovin. Notre étude s’est attardée à dresser un profil d’expression spatiotemporel de ces familles d’enzymes lors des différents stades embryonnaires précoces chez la vache. Nous suggérons que Tet3 participe activement à la déméthylation de l’ADN, possiblement assisté par Tet2, mais sans Tet1 ni Aicda. Nous montrons également que KDM3A, KDM4A, KDM4C et KDM5B sont présents à des stades et à des endroits précis de l’embryon suggérant ainsi un rôle dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces informations ouvrent la voie à de nouvelles recherches afin de comprendre les modifications de l’épigénome et de réduire les anomalies épigénétiques rencontrées chez les animaux issus de certains protocoles de reproduction assistée. / In mammals, the transition from one generation to the next requires genomic reprogramming. Such epigenetic change is mediated by paternal and maternal DNA demethylation as well as histone lysines demethylation after fertilization, which is a poorly understood process. Some family of enzymes have recently been associated to those process: the deaminases, like Aicda (activation-induced cytosine deaminase), and Tet (Ten-eleven translocation) dioxygenases, Tet1, Tet2 and Tet3. Many lysine specific histone demethylases (KDM) have been identified in the past few years but little is known about their roles in mammalian embryo. The objective of this study was to develop of a spatiotemporal expression profile of those proteins at different preimplantation stage of bovine embryo. We suggest an active participation of Tet3 in DNA methylation, possibly supported by Tet2 but without Tet1 or Aicda. We also demonstrate the presence and specific localization of KDM3A, KDM4A, KDM4C and KDM5B which may suggest a role during the different embryonic stages. This information opens up the possibilities for further research in order to reduce epigenetic abnormalities associated to assisted reproduction technologies.

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Les relations entre les histones qui composent les nucléosomes et le processus de transcription des gènes codants, sont à la fois multiples et extrêmement complexes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à deux de ces relations. Tout d’abord, une première étude a été réalisée en collaboration avec les laboratoires de Franck Holstege et de Catherine Dargemont. Ce travail permet de préciser clairement l’effet des différentes formes de méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 sur l’activité transcriptionnelle. Dans cette étude nous démontrons que la méthylation de H3K4 n’influence la transcription que d’un nombre très limité de gènes. Concernant ces gènes, un profil non conventionnel de distribution des formes de méthylation de H3K4 a été identifié par la présence inhabituelle d’un enrichissement en 3’ de ces gène des formes di- et triméthylées de H3K4.L’effet majoritaire de cette marque est d’induire une répression transcriptionnelle selon au moins deux mécanismes distincts. L’enrichissement atypique de la triméthylation de H3K4 influence négativement l’expression des gènes via la production d’ARN non codant anti-sens. Concernant l’effet répressif associé à la diméthylation de H3K4, la quantité d’ARN anti-sens ainsi que sa production ne sont pas impliquées.Dans une seconde étude réalisée en collaboration avec les laboratoires de Sebastian Chavez etd’Akash Gunjan, nous nous sommes intéressés au complexe FACT qui est impliqué dans l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes lors du passage de l’ARN polymérase II. Jusqu’alors, un défaut de croissance chez les mutants thermosensibles du complexe FACT avait pu être observé. Dans notre étude, nous montrons que l’altération de FACT conduit, lors de la transcription, à l’éviction d’histones normalement incorporées à la chromatine. L’accumulation de ces histones libres à fort potentiel toxique, induit une répression spécifique de CLN3 qui code pour la première cycline dephase G1. Pour la première fois, nous mettons en évidence dans cette étude l’existence d’un mécanisme de surveillance moléculaire du cycle cellulaire induit par l’excès d’histones non incorporées à la chromatine / Relationships between histones, components of nucleosomes, and the transcription process of coding genes are both multiple and extremely complex. During my Thesis, I looked at twoof these relationships. First, we performed a study in collaboration with the Franck Holstedge and Catherine Dargemont labs. This work has allowed us to clearly define the effect of various methylation forms of the lysine 4 of the histone 3 on gene transcription. In this study we have shownthat H3K4 methylation influences the transcription of only a very limited number of genes. For these genes, a non conventional distribution profile of H3K4 methylation forms has been identified by the presence of an unusual enrichment in di- and trimethylated H3K4 in the 3’ of these genes. The principal effect of this mark is to promote transcriptional repression by at least two distinct mechanisms. The atypical enrichment of H3K4 trimethylation negatively influences gene expressionvia the production of non coding antisense RNA. For the repressive effect associated with dimethylH3K4, the quantity of antisense RNA as well as its production are not involved. We propose severalh ypotheses that link our results to the data known on this subject. In a second study performed incollaboration with the Sebastian Chavez and Akash Gunjan labs, we concentrated on the FACT complex that is involved in the assembly and disassembly of nucleosomes as RNA polymerase IImoves past. Previously, a growth defect in thermosensitive mutants of the FACT complex had been observed. In our study, we show that FACT deterioration leads to the eviction of histones that arenormally incorporated into chromatin during transcription. The accumulation of these free histones,which have a high toxic potential, induces the specific repression of CLN3 which encodes for the firstcyclin of G1 phase. For the first time, we show in this study the existence of a cell cycle molecular surveillance mechanism that is induced by an excess of free histones

La mucoviscidose (CF) est causée par des mutations sur le gène CFTR codant pour une protéine indispensable au maintien de l'homéostasie des transports hydro-électrolytiques au sein de l'épithélium des organes cibles de la pathologie, dérivés de l'endoderme (poumon, pancréas, appareil reproducteur). Entre ces différents tissus et au cours du développement fœtal, l'expression du gène varie, particulièrement dans le tissu pulmonaire où une répression est observée à l'âge adulte.Ce travail propose dans une première partie la caractérisation des modifications épigénétiques associées à la régulation spatio-temporelle physiologique de l'expression du gène CFTR dans les tissus humains sains adultes et fœtaux. Les résultats obtenus soulignent le rôle important des modifications post-traductionnelles des histones dans la régulation in vivo. Nous avons notamment observé i) un équilibre fin entre marques d'ouverture (acétylation) et de fermeture (H3K27Me3) de la chromatine sur la région promotrice du gène CFTR et ii) l'acétylation significative de régions cis-régulatrices intragéniques.La deuxième partie de ce travail consiste en l'évaluation des effets du SAHA, un inhibiteur d'histones déacétylases (HDACi) dans un modèle ex vivo d'épithélium nasal de patients atteints de mucoviscidose. Les résultats montrent que le SAHA ne restaure pas l'adressage membranaire de la protéine CFTR en contexte pathologique mucoviscidose (mutation p.(Phe508del)) dans des cellules CF différenciées en épithélium ex vivo. De plus, le SAHA induit une modification du profil inflammatoire des épithélia et une dé-différenciation épithéliale dans le modèle ex vivo montrant que les mécanismes d'action de cette molécule sont multiples et réversibles.Ce travail souligne la nécessité d'analyser in vivo les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la mucoviscidose et d'évaluer l'impact des molécules thérapeutiques sur les protéines endogènes dans un modèle d'épithélium différencié. / Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the CFTR gene encoding for a protein essential to maintain the homeostasis of fluid and electrolyte transport in the epithelium of endoderm-derived organs (lung, pancreas, reproductive tract) that are affected in CF patients. CFTR expression greatly varies between these tissues and during fetal development, particularly in the lung where repression is observed in adulthood .In the first part of this work, we characterized epigenetic modifications associated with the spatio-temporal regulation of CFTR gene expression in healthy human adult and fetal tissues. Our results emphasize the important role of histone post-translational modifications in this regulation in vivo. Specifically, we observed i) a fine balance between active (acetylation) and repressive (H3K27Me3) marks in the promoter region and ii) significant acetylation in intragenic cis-regulatory regions.In the second part of this work, we evaluated the effects of SAHA, a histone deacetylase inhibitor (HDACi) in an ex vivo model of nasal epithelium of CF patients. Our results show that SAHA can not restore CFTR protein to the apical membrane in a p.(Phe508del)-CFTR context in ex vivo CF differentiated epithelial cells. In addition, SAHA induces a change in the inflammatory profile of epithelia and epithelial dedifferentiation in the ex vivo model showing that the mechanisms of action of this molecule are multiple and reversible.This work highlights the need to analyze in vivo the pathophysiological mechanisms involved in Cystic Fibrosis and to evaluate the impact of therapeutic molecules on the endogenous proteins in a differentiated epithelium model.

Les modifications post-traductionnelles (MPTs) d’histones sont apparues comme un acteur majeur de la régulation de l’expression des gènes. Cependant peu de choses sont connues sur le réel impact des MPTs sur la chromatine. Il a été suggéré que les MPTs d’histones (H2A, H2B, H3 et H4) ont le potentiel de moduler la fonction chromatinienne selon un « codehistone » en recrutant des protéines spécifiques de liaison. L’objectif de mon projet est d’approfondir la fonction de l’acétylation du domaine globulaire de l’histone H3 et de comparer cette modification avec celles des queues N-terminale in vivo sur une lignée ES cellulaire. Pour étudier l’impact de ces MPTs in vivo, toutes les copies endogènes du gène H3 sauvage (WT) doivent être remplacées par des copies mutées. Ainsi la première étape de mon projet est d’établir une lignée cellulaire exprimant seulement H3 mutée (e.g reproduisant une acétylation permanente) afin d’étudier les effets des modifications sur le domaine globulaire de H3 sur (a) l’expression génique, (b) l’architecture chromatinienne mais également pour étudier (c) les effets réciproques et synergiques entre les différentes modifications du domaine globulaire et (d) comparer ces effets avec les modifications sur la queue N-terminale dans un système in vivo. / Post-translational modifications (PTMs) of histones have emerged as key players in the regulation of gene expression. However, little is known to what extent PTMs can directly impact chromatin. It has been suggested that PTMs of core histones (H2A, H2B, H3 and H4) have the potential to govern chromatin function according to the so called ‘‘histone code’’ hypothesis by recruiting specific binding proteins. The goal of my project is to gain insight in the function acetylation within the globular domain of H3 and to compare these modifications with histone tail modifications, in vivo by using the CRISPR in mouse embryonic stem cells (ES). To study the impact of PTMs in vivo, all endogenous wild type (WT) H3 gene copies have to be replaced with mutant copies. Hence, the primary focus of my project is to establish cell lines that exclusively express mutated H3 (e.g. mimicking acetylation) in order to study effects of H3 globular domain modifications on (a) gene expression (b) chromatin architecture as well as to study (c) cross talks and synergisms between globular domain modifications and (d) compare the effects with tail modifications in an vivo system.

La méiose est une étape de la différenciation germinale qui permet la formation des gamètes. Elle est composée de deux divisions successives. La ségrégation des chromosomes homologues à la première division nécessite des connexions entre homologues, mises en place par des événements de crossing-over (CO). Les CO augmentent également la diversité génétique, et leur fréquence et leur distribution sont étroitement régulées. Ils sont générés par un mécanisme de formation et réparation de cassures double brins de l'ADN (CDBs), catalysées par la protéine SPO11 et préférentiellement localisées dans des régions de 1-2 kb appelées points chauds de recombinaison méiotique. Une question majeure est de comprendre comment sont régulés ces CO, ce qui détermine leur fréquence et leur distribution, car toute altération de cette régulation peut conduire à des anomalies chromosomiques graves.Dans ce travail de thèse, pour la première fois chez les mammifères, nous avons montré que des modifications de la chromatine sont associées à l'initiation de la recombinaison méiotique (formation des CDBs par SPO11). Ces résultats ont été obtenus par des analyses d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sur des spermatocytes purifiés ou non, isolés de différentes lignées de souris. Une des modifications associées à l'activité de deux points chauds testés est la triméthylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4Me3). Une analyse fonctionnelle et temporelle de cette modification a permis de montrer qu'elle ne dépend pas de SPO11 et apparaît avant la formation de CDBs. Nous avons montré ici que c'est la protéine PRDM9, récemment identifiée comme un déterminant majeur des points chauds de recombinaison chez les mammifères et possédant une activité méthyltransférase, qui appose H3K4Me3. Nous proposons un modèle où H3K4Me3 et d'autres caractéristiques inconnues constitueraient un substrat pour la machinerie d'initiation et recruteraient SPO11 en des points précis du génome, qui deviendront des points chauds. / Meiosis is a specialized cell division to produce haploid gametes from a diploid cell. It segregates parental genomes by two successive divisions. The faithful segregation of homologous chromosomes is achieved during the first unique division via formation of crossovers (COs). COs establish physical connections between homologs by the reciprocal exchange of genetic material and require the formation and subsequent repair of SPO11-dependent DNA double-strand breaks (DSBs). Studies in many organisms revealed that COs are distributed in highly localized regions (1-2Kb) of genomes called recombination hotspots. The mechanisms of COs regulation are elusive and a main question in the field is to understand how the frequency and distribution of CO are regulated, because either absence or defects of recombination can lead to aneuploidy or reduced fertility. In the present study, for the very first time in mammals, we investigate whether recombination hotspots are associated with any chromatin modifications. We performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) on spermatocytes isolated from different mice strains harbouring either active or inactive hotspots. Comparison of hot and cold spots revealed that a specific histone modification i.e. trimethylation of the lysine 4 of histone H3 (H3K4Me3) is enriched at two tested hotspots in mice. Temporal and functional analysis show that H3K4Me3 is not dependent on SPO11 and appears before DSBs formation. Furthermore, we demonstrate here that H3K4Me3 is methylated via the histone methyltransferase activity of PRDM9, recently identified as a major determinant of recombination hotspots in mammals. We propose a model that H3K4Me3 and other unknown chromatin features may specify recruitment of SPO11 initiation machinery to initiate meiotic recombination at the hotspots.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2007. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.