Sepsis is defined as a life-threatening organ dysfunction that results in systemic activation of coagulation and inflammation in response to microbial infection. Neutrophil extracellular traps (NETs) have shown to be an important interface between innate immunity and coagulation in sepsis. The major structural components of NETs are nucleosomes (DNA-histone complexes). Although nucleosomes do not modulate coagulation, there are conditions where DNA and histones dissociate from each other in the circulation (e.g. in the presence of heparan sulfate or therapeutic heparin binding histones, or DNase digestion of DNA). In vitro, purified DNA was reported to activate coagulation, but this procoagulant activity has been questioned due to isolation methods that yield DNA that is contaminated with other procoagulant molecules. On the other hand, histones have been shown to not only activate coagulation but are cytotoxic to endothelial cells. However, their contribution to the pathogenesis of sepsis has yet to be determined in an in vivo model. Understanding the contribution of DNA, histones, and nucleosomes to the pathogenesis of sepsis may allow us to develop novel therapies that may prove targeting multiple components of NETs (i.e. DNA and histones) may be beneficial. Consequently, in this thesis, we (1) identified methods of DNA purification that produce DNA that is free of contamination and confirmed the procoagulant properties of the isolated DNA, (2) determined the harmful effects of DNA, histones, and nucleosomes cytotoxicity, coagulation, and inflammation in vitro and in vivo, (3) and then we explored the possibility of targeting both DNA and histones using a combination approach of DNase I and heparin in a mouse model of sepsis. Since heparin is administered to patients as a thromboprophylaxis and DNase I is a potential therapy in sepsis, it is important to understand any potential drug-drug interactions. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Sepsis is a type of blood poisoning that occurs when the body has an over reactive response to an infection. This can lead to tissue damage, organ failure, and death. Sepsis is recognized as a global health priority. The death rate from sepsis is high between 15% to 30%, suggesting that an improved understanding of how sepsis leads to death may develop into new therapies. Recently, it was discovered that high levels of free-floating DNA and histones in the blood can predict death in sepsis. The DNA and histones are likely released by white blood cells in response to trying to fight off the infection. In test tubes, free-floating DNA can trigger clotting of blood. DNA often exists in blood together with histones. In test tubes, histones can kill blood vessels and make blood thicker. However, no one has confirmed that DNA and/or histones are harmful to mammals and contributes to death in sepsis. Some new studies show that getting rid of DNA with injections of DNase I minimally increases survival in mice. Other studies show that removing histones with a treatment called heparin shows a small increase in survival in mice. Heparin is also a blood thinner and decreases inflammation. No one knows if these drugs used together can improve sepsis survival. Because both drugs on their own show some survival improvement in sepsis, perhaps using them together will cure sepsis. This thesis has three objectives: (1) to confirm the clotting properties of free-floating DNA, (2) to find out if DNA and/or histones contributes to death in sepsis, and (3) if using a combination of DNase I and heparin can cure sepsis in a mouse model. Finding new therapies for sepsis can save millions of people's lives and decrease the financial burden on society and healthcare systems.

Sepsis is a life-threatening condition characterized by organ dysfunction due to an uncontrolled response to infection. Despite decades of research, the mortality rate remains high, emphasizing the need for an improved understanding of sepsis pathophysiology and improvements in preclinical animal research. Recently, extracellular histones, major mediators of organ dysfunction and death, have emerged as a potential therapeutic target for sepsis. In this thesis, we reported that the ability of heparin to neutralize the cytotoxic and procoagulant effects of histones is size-dependent but independent of the antithrombin- binding pentasaccharide. In contrast, the ability of heparin to neutralize histone-mediated impairment of activated protein C generation is independent of size and anticoagulant activity. These findings suggest that heparin variants may have differential therapeutic potential in vascular disease states that are associated with elevated levels of histones. Before testing the therapeutic efficacy of the heparin variants in vivo, we aimed to develop and standardize a murine model of sepsis that can be utilized in a multi-center platform. As one of the lead sites for the National Preclinical Sepsis Platform (NPSP), we optimized a 72-hour model of abdominal sepsis using supportive treatments. As sepsis predominately impacts the elderly, we also explored the impact of aging on the host response to sepsis using our fecal induced peritonitis (FIP) model. Aged FIP mice exhibited a higher mortality rate compared to young FIP mice. The worsened organ injury and poor survival in aged mice may be attributed to heightened inflammation in aged mice. We also observed trends in increased bacterial loads, increased coagulation, elevated cell free DNA, and decreased ADAMTS13 activity in aged septic mice. These findings help to improve our understanding of how aging impacts the host response to sepsis, which may be translated into therapeutic strategies that considers advanced age as a risk factor for sepsis. / Thesis / Candidate in Philosophy

No description available.

No description available.

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi. / In eukaryotic cells, the lengthy DNA biopolymer is condensed into the cell nucleus with the aid of small packaging proteins called histones. In addition to their packing functions,histones are also targets of numerous post translational modifications (PTMs), especially on their N-terminus. These reversible modifications are believed to be constituents of a heritable epigenetic “histone code” that dynamically orchestrate and modulate chromatin based events such as gene activation and silencing, DNA replication and repair, and are also involved in the downstream signaling and progression of cancers, such as leukemia. Thus, the elucidation of histone PTMs is important in understanding their biological function. An analytical workflow was designed and set-up in the laboratory to isolate, detect, and quantitate histone PTM, using a two-pronged, unbiased, and rapid approach with specialized bioinformatic tools. The workflow was validated using histones from wildtype, and 2 mutants deficient in acetyltransferase activity. Between the three histone sources, the only PTM that demonstrated any change was acetylation at histone H3 lysine 56 (H3K56ac). The down-regulation and stoichiometry of this PTM was accurately assessed between wild-type and mutant cells. The versatile scan functions of a hybrid quadrupole-linear ion trap instrument were exploited to enhance the detection of intact histone proteins. The enhanced multiply charged (EMC) scan was modified in order to contain and detect intact protein ions within the linear ion trap. This targeted EMC (or tEMC) resulted in not only a 4-fold increase in signal-to-noise, but also a 5-fold increase in resolution. Furthermore, the charge separation capability of the tEMC dramatically reduced space charge effects within the linear ion trap. The superior resolution of the tEMC mode allowed for the discimination of many modified histone isoforms, especially for histone H3. Using the bottom-up strategy with multiple reaction monitoring (MRM), histone peptides were quantified and sequenced with a high degree of precision. The only PTM that was down-regulated between wild-type and DOT1L mutant histones was methylation at histone H3 lysine 79 (H3K79me1). The effects of two clinically relevant small molecule HDAC inhibitors (HDACi) on histone PTMs patterns were assessed using the analytical workflow developed. Histones derived from both normal and cancer cells were exposed to either Vorinostat (SAHA) or Entinostat (MS-275) over a 24- to 72 hour period. The two core histones primarily affected were H3 and H4. Surprisingly, the same effects were not observed when normal cells were treated with three doses of SAHA at 24-hour intervals over a 72-hour period. An absolute quantitation method using a calibration curve was developed for H3K56ac. In opposition to other published literature, our findings demonstrate that this PTM is present in very low stoichiometry (< 0.1%) in mammalian cells, and exhibits no significant up-regulation in different cell lines treated with several types of HDACi.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes found in both marine and freshwater environments. They are best known for causing toxic blooms called ‘red-tides’, for their symbiosis with corals, and for their important contribution to carbon fixation in the ocean. On a more molecular level, they are also known for their unique nuclear characteristics, as they generally have huge amount of DNA found in chromosomes that are permanently condensed and packaged into liquid crystalline forms instead of nucleosomes. Nuclear-encoded genes are often present in multiple copies and arranged in tandem, and no putative promoter elements including the conserved TATA box, have yet been observed. The unique organization of dinoflagellate chromatin suggests different strategies may be required to regulate gene expression in these organisms. In this study, I have started to address this problem using the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum as a model. L. polyedrum is of particular interest because it shows a number of circadian (daily) rhythms. To date, all circadian changes in gene expression studied are regulated at a translational level. I have used transcriptomic, proteomic and phosphoproteomic approaches along with biochemical studies to provide insight into the gene regulatory mechanisms in dinoflagellates, with particular emphasis on the importance of phosphorylation in the L. polyedrum circadian system. The absence of histone proteins and nucleosomes is a hallmark of the dinoflagellates. Using high throughput RNA-seq technology, I found complete set of sequences encoding the core histones as well as sequences encoding histone-modifying enzymes in L. polyedrum. Thus L. polyedrum expresses conserved histone transcripts, although levels of proteins are still below what can be detected using immunoblotting studies. Using the de novo assembly algorithm the RNA-seq data was used to generate a transcriptome. This transcriptome, a list of genes expressed by L. polyedrum, has been extensively characterized. First, homology based sequence searches were used to classify the transcripts in gene ontology (GO) categories, and this analysis revealed a reduced number of transcription factor types and a surprising predominance of sequences containing a cold shock domain. Alignments of reads from the RNA–seq to genomic copies of L. polyedrum tandem repeat sequences was performed to assess the possibility of polycistronic transcripts, a hypothesis proposed to explain the lack of promoter elements in the intergenic region of the tandem repeat gene sequences. This analysis also showed a surprisingly high conservation of tandemly repeated gene sequences. The transcriptome database was also used to fuel gene identification after protein sequencing by mass spectrometry, and a purified phosphoproteome fraction was found to be particularly amenable to high throughput approaches. A comparison of the phosphoproteome at two different times of day revealed that a major class of proteins whose phosphorylation state varied over time belonged to the RNA binding and translation GO category. The transcriptome was also used to define the spectrum of kinases present in L. polyedrum, which in turn was used to classify the different phosphorylated peptides as potential kinase targets. Predicted peptides of casein kinase 2 (CK2), a kinase known to be involved in the circadian clocks of other eukaryotes, were found to include many RNA binding proteins. To assess the possibility that some of the many cold shock domain proteins identified in the transcriptome might modulate gene expression in L. polyedrum, as has been observed in many other eukaryotic and prokaryotic systems, the cellular response to cold temperatures was examined. Cold temperatures were found to induce rapid encystment, a metabolically inactive cell type whose role is to combat unfavourable environmental conditions. Changes in phosphoproteome profile were found to be the major molecular correlates to cyst formation. Predicted CK2 phosphosites are the most highly reduced class of kinase targets, a finding of interest as measurements of the bioluminescence rhythm confirmed that the clock is stopped in cysts

Les éléments transposables sont des séquences génomiques capables de se répliquer et de se déplacer dans les génomes. Leur capacité à s’insérer près des gènes et à produire des réarrangements chromosomiques par recombinaison entre copies, font des éléments transposables des agents mutagènes. Les éléments transposables sont de plus capables de modifier l’expression des gènes voisins grâce aux régions promotrices qu’ils possèdent. Les éléments transposables ont été trouvés dans la plupart des génomes dans lesquels ils ont été recherchés. Ils forment ainsi 45 % du génome de l’homme et peuvent représenter jusqu’à 90 % du génome de certaines plantes. Dans la première partie de ma thèse, je me suis penché sur les facteurs qui déterminent la distribution de ces éléments. Je me suis intéressé à un facteur particulier, qui est la fonction des gènes dans le voisinage des insertions d’éléments transposables. Dans la deuxième partie, j’ai essayé de déterminer l’impact de l’altération des modifications épigénétiques (modifications d’histones plus précisément) associées aux différents composants géniques, dont les éléments transposables, sur la variation de l’expression des gènes en condition tumorale. / Transposable elements are genomic sequences able to replicate themselves and to move within genomes. Their ability to integrate near genes and to produce chromosomal rearrangements by recombination between copies, make transposable elements mutagens. Moreover, transposable elements are able to alter the expression of neighboring genes through their promoter regions. Transposable elements form 45% of the human genome and may represent up to 90% of certain plant genomes. In the first part of my thesis, I examined the factors that determine the distribution of these elements. I have been interested in a particular factor, which is the function of the genes in the vicinity of transposable element insertions. In the second part, I determined the impact of epigenetic modifications alterations (histone modifications) in different gene components, including transposable elements, on the variation of gene expression in tumoral conditions.

No description available.

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi. / In eukaryotic cells, the lengthy DNA biopolymer is condensed into the cell nucleus with the aid of small packaging proteins called histones. In addition to their packing functions,histones are also targets of numerous post translational modifications (PTMs), especially on their N-terminus. These reversible modifications are believed to be constituents of a heritable epigenetic “histone code” that dynamically orchestrate and modulate chromatin based events such as gene activation and silencing, DNA replication and repair, and are also involved in the downstream signaling and progression of cancers, such as leukemia. Thus, the elucidation of histone PTMs is important in understanding their biological function. An analytical workflow was designed and set-up in the laboratory to isolate, detect, and quantitate histone PTM, using a two-pronged, unbiased, and rapid approach with specialized bioinformatic tools. The workflow was validated using histones from wildtype, and 2 mutants deficient in acetyltransferase activity. Between the three histone sources, the only PTM that demonstrated any change was acetylation at histone H3 lysine 56 (H3K56ac). The down-regulation and stoichiometry of this PTM was accurately assessed between wild-type and mutant cells. The versatile scan functions of a hybrid quadrupole-linear ion trap instrument were exploited to enhance the detection of intact histone proteins. The enhanced multiply charged (EMC) scan was modified in order to contain and detect intact protein ions within the linear ion trap. This targeted EMC (or tEMC) resulted in not only a 4-fold increase in signal-to-noise, but also a 5-fold increase in resolution. Furthermore, the charge separation capability of the tEMC dramatically reduced space charge effects within the linear ion trap. The superior resolution of the tEMC mode allowed for the discimination of many modified histone isoforms, especially for histone H3. Using the bottom-up strategy with multiple reaction monitoring (MRM), histone peptides were quantified and sequenced with a high degree of precision. The only PTM that was down-regulated between wild-type and DOT1L mutant histones was methylation at histone H3 lysine 79 (H3K79me1). The effects of two clinically relevant small molecule HDAC inhibitors (HDACi) on histone PTMs patterns were assessed using the analytical workflow developed. Histones derived from both normal and cancer cells were exposed to either Vorinostat (SAHA) or Entinostat (MS-275) over a 24- to 72 hour period. The two core histones primarily affected were H3 and H4. Surprisingly, the same effects were not observed when normal cells were treated with three doses of SAHA at 24-hour intervals over a 72-hour period. An absolute quantitation method using a calibration curve was developed for H3K56ac. In opposition to other published literature, our findings demonstrate that this PTM is present in very low stoichiometry (< 0.1%) in mammalian cells, and exhibits no significant up-regulation in different cell lines treated with several types of HDACi.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes found in both marine and freshwater environments. They are best known for causing toxic blooms called ‘red-tides’, for their symbiosis with corals, and for their important contribution to carbon fixation in the ocean. On a more molecular level, they are also known for their unique nuclear characteristics, as they generally have huge amount of DNA found in chromosomes that are permanently condensed and packaged into liquid crystalline forms instead of nucleosomes. Nuclear-encoded genes are often present in multiple copies and arranged in tandem, and no putative promoter elements including the conserved TATA box, have yet been observed. The unique organization of dinoflagellate chromatin suggests different strategies may be required to regulate gene expression in these organisms. In this study, I have started to address this problem using the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum as a model. L. polyedrum is of particular interest because it shows a number of circadian (daily) rhythms. To date, all circadian changes in gene expression studied are regulated at a translational level. I have used transcriptomic, proteomic and phosphoproteomic approaches along with biochemical studies to provide insight into the gene regulatory mechanisms in dinoflagellates, with particular emphasis on the importance of phosphorylation in the L. polyedrum circadian system. The absence of histone proteins and nucleosomes is a hallmark of the dinoflagellates. Using high throughput RNA-seq technology, I found complete set of sequences encoding the core histones as well as sequences encoding histone-modifying enzymes in L. polyedrum. Thus L. polyedrum expresses conserved histone transcripts, although levels of proteins are still below what can be detected using immunoblotting studies. Using the de novo assembly algorithm the RNA-seq data was used to generate a transcriptome. This transcriptome, a list of genes expressed by L. polyedrum, has been extensively characterized. First, homology based sequence searches were used to classify the transcripts in gene ontology (GO) categories, and this analysis revealed a reduced number of transcription factor types and a surprising predominance of sequences containing a cold shock domain. Alignments of reads from the RNA–seq to genomic copies of L. polyedrum tandem repeat sequences was performed to assess the possibility of polycistronic transcripts, a hypothesis proposed to explain the lack of promoter elements in the intergenic region of the tandem repeat gene sequences. This analysis also showed a surprisingly high conservation of tandemly repeated gene sequences. The transcriptome database was also used to fuel gene identification after protein sequencing by mass spectrometry, and a purified phosphoproteome fraction was found to be particularly amenable to high throughput approaches. A comparison of the phosphoproteome at two different times of day revealed that a major class of proteins whose phosphorylation state varied over time belonged to the RNA binding and translation GO category. The transcriptome was also used to define the spectrum of kinases present in L. polyedrum, which in turn was used to classify the different phosphorylated peptides as potential kinase targets. Predicted peptides of casein kinase 2 (CK2), a kinase known to be involved in the circadian clocks of other eukaryotes, were found to include many RNA binding proteins. To assess the possibility that some of the many cold shock domain proteins identified in the transcriptome might modulate gene expression in L. polyedrum, as has been observed in many other eukaryotic and prokaryotic systems, the cellular response to cold temperatures was examined. Cold temperatures were found to induce rapid encystment, a metabolically inactive cell type whose role is to combat unfavourable environmental conditions. Changes in phosphoproteome profile were found to be the major molecular correlates to cyst formation. Predicted CK2 phosphosites are the most highly reduced class of kinase targets, a finding of interest as measurements of the bioluminescence rhythm confirmed that the clock is stopped in cysts