Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi / Hematopoietic stem cells (HSC) are rare, but essential to sustain the constant production of all mature blood cells, a constantly renewing tissue. They are defined by two main characteristics; namely self-renewal (SR), or the capacity to preserve cell identity following division, and multipotency, the differentiation potential that allows them to generate all hematopoietic lineages. Given their attributes, HSC are used for cellular therapy in the transplantation field. A hierarchy in tissue organisation is also preserved in leukemia, or blood cancer, a heterogeneous tumor mass that is sustained by a subset of cells with unlimited SR potential, the leukemia stem cells (LSC). Studies presented in this manuscript aim to explore the molecular basis underlying SR, which are still poorly defined. Certain members of the HOX family of homeodomain transcription factors are involved in the regulation of normal hematopoiesis, and their deregulation can contribute to leukemia development. In particular, Hoxb4 overexpression in HSC influences cells fate, favouring SR divisions and their subsequent expansion in culture and in vivo. In general, HSC exhaust rapidly when maintained ex vivo, outside of their niche. Several factors interact with HOX and modulate their binding to DNA, including members of the TALE (Three Amino acid Loop Extension) protein family, such as MEIS1 and PBX1. Using a strategy of combined overexpression of Hoxb4 and an anti-sense to Pbx1in HSC, generating Hoxb4hiPbx1lo cells, it is possible to further impact on their SR potential and expansion in vitro. These Hoxb4hiPbx1lo cells remain functionally intact despite extreme modulation of their cell fate in culture. Levels of expression of nuclear factors, alone or in combination, can thus impact significantly on HSC fate. In order to identify other nuclear factors potentially involved in the process of HSC self-renewal, a strategy enabling simultaneous assessment several gene candidates was elaborated. To this end, progress made in terms of HSC purification and their culture in micro-wells facilitated the setup of an RNAi (RNA interference) screen, measuring the functional impact of lowering gene candidate transcript levels on HSC activity. Gene candidates selected for this study belong to the greater group of chromatin modifiers, more specifically the family of histone demethylases (HDM) containing a Jumonji catalytic domain. This choice stems from the regulatory function of several members of histone methyl-transferase complexes on HSC self-renewal, including the histone methyl-transferase MLL (Mixed Lineage Leukemia). This strategy was also used in the laboratory to study the role of asymmetry factors on HSC fate, in a collaborative study. These studies enabled identification of both positive and negative regulators of HSC activity. Among these, reduced expression of the gene coding for JARID1B, a histone 3 lysine 4 (H3K4) HDM, increased HSC activity was associated with Hox genes activation. In conclusion, several nuclear determinants, including transcription factors and chromatin modifiers, can influence HSC fate. Underlying mechanisms and identification of additional modulators of SR remain areas to explore, which could eventually contribute to HSC expansion strategies ex vivo, and identification of therapeutic targets against LSC. Keywords: hematopoietic stem cells, Hoxb4, Pbx1, self-renewal, histone demethylases, RNAi

H1 linker histone facilitates the formation of higher order chromatin structure and is essential for mammalian development. Mice have 11 H1 variants which are differentially regulated and conserved in human. Previous research indicates that H1 regulates the expression of specific genes in mouse embryonic stem cells (ESCs). However, whether individual variants have distinct functions and how H1 participates in gene regulation remain elusive. An investigation of the precise localization of individual H1 variants in vivo would facilitate the elucidation of mechanisms underlying chromatin compaction regulated gene expression, while it has been extremely difficult due to the lacking of specific antibodies toward H1 variants. In this dissertation, I have generated a knock-in system in ESCs and shown that the N-terminally tagged H1 proteins are functionally interchangeable to their endogenous counterparts in vivo. H1d and H1c are depleted from GC- and gene-rich regions and active promoters, inversely correlated with H3K4me3, but positively correlated with H3K9me3 and associated with characteristic sequence features. Surprisingly, both H1d and H1c are significantly enriched at major satellites, which display increased nucleosome spacing compared with bulk chromatin. While also depleted at active promoters and enriched at major satellites, overexpressed H10 displays differential binding patterns in specific repetitive sequences compared with H1d and H1c. Depletion of H1c, H1d ,and H1e causes pericentric chromocenter clustering and de-repression of major satellites. Collectively, these results integrate the localization of an understudied type of chromatin proteins, namely the H1 variants, into the epigenome map of mouse ESCs, and demonstrate significant changes at pericentric heterochromatin upon depletion of this epigenetic mark.

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels.

Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines.

Le p300/CBP acétyltransférase est un co-activateur transcriptionnel très important qui est impliqué dans la régulation d'un grand nombre de processus biologiques, comme la transcription d'ADN, le développement et l'immunité innée. Jusqu'à présent, le rôle de p300/CBP dans la régulation de l'expression des gènes a été largement étudiée, mais les mécanismes qui régulent son activité enzymatique sont encore peu connus. Des études ont montré que le dysfonctionnement de p300/CBP est associé à plusieurs formes de cancer et de maladies neurodégénératives. Dés lors, chaque progrès concernant les mécanismes de régulation de p300/CBP est devenu primordial pour le développement de nouvelles thérapies. Le 'noyau' de p300/CBP contient deux domaines pour la reconnaissance des modifications post-traductionnelles (MPTs), un bromodomaine et un PHD finger (le module BP), adjacent à un domaine HAT (ou domaine histone acétyltransférase). Plusieurs enzymes, modifiant la chromatine, contiennent des domaines de reconnaissance des MPTs. Fréquemment des groupements particuliers de ces domaines sont très conservés et liés, au sein de la même protéine ou du même complexe protéique, suggérant qu'ils réalisent des fonctions coordonnées. Ces domaines adjacents peuvent agir en concertation dans la reconnaissance simultanée de différents MPTs ou peuvent exercer des fonctions différentes de celles qui sont effectuées par ces deux domaines particuliers, tels que les fonctions de régulation enzymatique. Plusieurs études suggèrent que les cycles acétylation/désacétylation dans la boucle d'auto-inhibition, à l'intérieur du domaine HAT, jouent un rôle important dans la régulation de l'activité enzymatique de p300/CBP. La proximité du module BP et du domaine HAT suggère que la spécificité de liaison, appartenant au module BP, peut être intrinsèquement liée à la régulation de l'activité du domaine HAT. L'objectif de ma thèse est de déterminer le rôle du module BP dans la régulation de l'activité du domaine HAT. Je propose que le module BP soit impliqué dans la régulation de p300/CBP de deux façons. La première consiste à établir un lien avec le domaine HAT qui stabilise la conformation auto-inhibée de l'enzyme. La deuxième exige que le module BP joue un rôle dans le choix des substrats de p300/CBP. J'ai été en mesure de montrer que BP peut se lier au domaine HAT et à la chromatine modifiée et qu'il peut reconnaître les modifications effectuées par p300/CBP lui-même. Les données obtenues indiquent que le module BP peut être impliqué dans la régulation de l'activité de p300/CBP et dans son ciblage à la chromatine.

Thesis (Ph.D. in Biochemistry) -- University of Colorado, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 153-171). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Une fraction non négligeable de protéines qui contrôlent la dynamique de la chromatine et la transcription est conservée au cours de l'évolution chez les eucaryotes. Ces protéines se retrouvent dérégulées dans de nombreuses maladies, dont les cancers. Dans cette étude, nous avons exploité la purification de deux protéines associées à la chromatine pour étudier de nouveaux acteurs impliqués dans la réduction au silence (ou silencing) de la transcription au sein de l'hétérochromatine et/ou de l'euchromatine chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un modèle de référence pour la biologie de la chromatine.Mmi1 est un facteur de liaison à l'ARN capable de guider la formation d'hétérochromatine facultative sur des gènes méiotiques. Parmi les protéines partenaires de Mmi1, nous nous sommes intéressés à Ccr4-Not, un complexe multifonctionnel, conservé de la levure à l'Homme, important pour la maturation de l'extrémité 3' des ARNs et pour le contrôle de l'expression des gènes. Nos travaux montrent que Ccr4-Not est également nécessaire pour le dépôt de la marque H3K9 méthylée aux gènes cibles de Mmi1, ainsi que pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive, indépendamment de Mmi1.En parallèle, nous avons étudié deux nouveaux partenaires potentiels de RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), un complexe nécessaire à la formation de l'hétérochromatine et l'inactivation de gène. Ces partenaires agiraient à l'interface entre la régulation de la chromatine et de la transcription. Le premier partenaire est l'histone chaperonne Spt6. Une caractérisation initiale entreprise sur Spt6 a montré son rôle crucial dans le silencing des gènes à l'hétérochromatine constitutive et facultative. Le second partenaire est Abo1, une histone chaperonne putative et homologue à la protéine humaine ATAD2, une protéine exprimée dans de nombreuses tumeurs et considérée comme une cible prometteuse pour le traitement de certains cancers, bien qu'à ce jour il n'y ait que peu d'information disponible sur sa fonction moléculaire. Nous avons dans un premier temps montré qu'Abo1 est nécessaire pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive. Cependant, l'analyse du transcriptome des cellules abo1Δ a montré qu'Abo1 est également nécessaire au silencing transcriptionel de nombreux gènes codant et non-codant localisés dans l'euchromatine. Par la suite, nous avons purifié Abo1 et identifié par spectrométrie de masse le réseau des protéines qui lui est associé. Cette approche protéomique a montré qu'Abo1 est connectée à de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle de la transcription, comme des histones chaperonnes et des complexes de remodelage ATP-dépendant de la chromatine. Enfin, nous avons montré que le défaut de croissance sévère observé dans les cellules abo1Δ est complètement rétabli par l'expression de ATAD2 humain. Ce dernier résultat indique que la caractérisation fonctionnelle d'Abo1, entreprise dans la levure, a le potentiel de fournir des informations importantes sur la fonction moléculaire non seulement d'Abo1, mais aussi d'ATAD2 et de son lien avec les cancers.En résumé, nos résultats permettent une meilleure compréhension de la fonction de trois acteurs impliqués dans le silencing de la transcription chez la levure fissipare. De plus, la caractérisation plus approfondie d'Abo1 pourrait grandement contribuer à élucider la fonction d'ATAD2 et de son rôle dans les cancers. / A sizeable fraction of proteins controlling chromatin dynamics and transcription are conserved throughout eukaryotes and are deregulated in many diseases, including cancer. In this study, we exploited the purification of two chromatin-associated proteins to characterize new actors in the context of euchromatic and/or heterochromatic gene silencing in Schizosaccharomyces pombe, a reference model for the biology of chromatin.Mmi1 is an RNA binding factor that can guide the formation of facultative heterochromatin assembly at meiotic genes. Among new proteins interacting with Mmi1, we examined the function of Ccr4-Not, which is a conserved multifunctional complex processing 3'ends of RNAs and regulating gene expression. We found that Ccr4-Not is also required for the deposition of H3K9 methylation mark at Mmi1 target genes and for gene silencing in a Mmi1-independent manner at constitutive heterochromatin.In parallel, we studied two new potential partners of RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), a complex required for heterochromatin formation and gene silencing. Both partners are believed to act at the interface between chromatin and transcription regulation. The first one is the histone chaperone Spt6. An initial functional characterization conducted on this protein showed its implication in gene silencing, both at constitutive and facultative heterochromatin. The second one is Abo1, a putative histone chaperone which is homologue to human ATAD2 protein, a male germ factor ectopically expressed in many tumors and considered as a promising target for cancer therapy, although little is known about its molecular function. We first showed that Abo1 is necessary for proper heterochromatin gene silencing at constitutive heterochromatin. However, transcriptomic analysis of abo1∆ cells further extended Abo1's function in gene silencing to protein-coding and non-coding regions within euchromatin. In addition, we purified Abo1 and identified by mass spectrometry the network of its associated proteins. This proteomic approach showed that Abo1 is connected to several chromatin- and transcription-linked proteins, such as histone chaperones and ATP-dependent chromatin remodeling complexes. Finally, we demonstrated that the severe growth defect observed in abo1Δ is completely rescued by the expression of human ATAD2. This later finding indicates that the functional characterization of Abo1 in yeast has the potential to provide important insights into the molecular function not only of Abo1, but also of the cancer linked ATAD2 protein.Altogether, our results permitted a better understanding of three actors involved in chromatin-based gene silencing in fission yeast. In addition, a further characterization of Abo1 may contribute elucidating the function of ATAD2 and its role in cancer.

O nucléolo é uma organela nuclear responsável pela produção dos ribossomos, através das Regiões Organizadoras do Nucléolo (NORs). Espécies que possuem mais de um par de cromossomos contendo NORs terão, obrigatoriamente, pelo menos um par ativo, sendo as demais NORs funcionais de acordo com a demanda celular. O mecanismo de compensação de dose é visualizado e bem estabelecido em híbridos interespecíficos, conhecido como dominância nucleolar, com a inativação de NORs de um dos parentais por outras homeólogas ativas que as dominam. A arquitetura da cromatina nas NORs e o controle da sua expressão foram estudados com o objetivo de se entender os mecanismos envolvidos no fenômeno da dominância nucleolar em espécies diplóides que possuem múltiplas NORs. A espécie modelo utilizada neste estudo foi Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae), caracterizada por conter 2n=2x=16, e NORs no braço curto do cromossomo 1, sendo este o principal organizador do nucléolo, e no braço longo do cromossomo 4 adjacente à heterocromatina centromérica, sendo este um sítio adicional (sítio menor) e de expressão facultativa, previamente determinada. Nas raízes de C. juncea sincronizadas, observou-se que a nucleologênese tem seu início durante o final da telófase, em que os 4 sítios de genes ribossomais podem ter atividade e formar até 4 nucléolos, os quais tendem a se fundir durante a interfase. A Hibridação in situ fluorescente (FISH) permitiu estudos da arquitetura da cromatina, com a visualização dos territórios cromossômicos, onde a cromatina não está organizada de forma aleatória dentro do núcleo, e consequentemente o rDNA 45S dentro do nucléolo. Observou-se também que todos os sítios de rDNA 45S possuem diferença no tamanho do arranjo repetitivo. Assim sendo, a hierarquia de dominância está de acordo com o tamanho de cada arranjo (sítio), e estes são ativados de acordo com a demanda celular. As análises das modificações nas histonas mostraram que a H3K9Met1 apresentou marcas fracas no nucléolo, enquanto no restante da cromatina nuclear sua marcação foi intensa. Já a H3K9Met2 apresentou marcação fortemente associada à cromatina presente no nucléolo, com alguns pequenos pontos heterocromáticos dispersos no núcleo. Pela observação entende-se que ambas metilações controlam diferentes tipos de heterocromatinas, ou seja, a H3K9Met2 controla principalmente heterocromatinas associadas aos genes ribossomais, e a H3K9Met controla heterocromatinas não associadas ao rDNA. O rDNA é hiperacetilado dentro do nucléolo para a H3K14. Não foi observada marcação nucleolar para H4K8ac, mas pôde ser observadas regiões hiperacetiladas em outras regiões da cromatina. A metilação do DNA esteve diretamente associada à diferentes níveis de organização da cromatina das NORs. As heterocromatinas adjacentes ao nucléolo apareceram fortemente metiladas, enquanto a cromatina distendida dentro do nucléolo apresentou marcação dispersa, com algumas regiões mais fortemente marcadas, onde a cromatina apresentava-se mais condensada e provavelmente não associados com a cromatina ativa. As fibras estendidas permitiram uma análise de alta resolução, onde foi possível observar que regiões não metiladas apareciam intercaladas entre grandes regiões fortemente metiladas, sugerindo que estas regiões hipometiladas estão, possivelmente, associadas com as alças de transcrição dentro do nucléolo. 12 Esses resultados contribuem para o entendimento sobre o controle genético e epigenético na arquitetura da cromatina ribossomal, bem como seu controle na expressão dos genes ribossomais no genoma das plantas. / The nucleolus is a nuclear organelle responsible for the ribosomes production, by Nucleolus Organizer Regions (NORs). Species presenting more than one chromosome pair with NORs should present, one pair expressing the genes, at least; while the other pairs expressing their genes accordingly to cellular demand. Dosage compensation mechanism is visualized and well established of interspecific hybrids as a well-described phenomena named nucleolar dominance, where a NOR from one parental could lead to inactivation of a NOR from the other parental which is dominated. The chromatin architecture and expression of the NORs were studied to address the mechanism involved in the nucleolar dominance of diploid species containing multiple sites of 45S rDNA. The model species used in the present study was the crop Crotalaria juncea (Leguminosae-Papilionoideae) characterized by 2n=2x=16 chromosomes, being the main NOR mapped into chromosome 1 short arm and presenting an additional site (minor site) in the chromosome 4 long arm adjacent to a centromeric heterochromatin and facultatively expressed. Synchronized meristematic root tip cells determined to nucleologenesis starts during the late-telophase, often expressing every ribosomal gene sites, when up to four nucleoli could be observed and these become merged during interphases. FISH allowed nucleolar chromatin architecture be accessed revealing distinct chromosomal domains (territories), suggesting a non-random distribution of the 45S rDNA, even between homologous chromosomes, into the nucleolus. The 45S rDNA sites from both chromosome pairs 1 and 4 of C. juncea showed differences in their array sizes. The differences in the 45S rDNA array sizes and the order of loci expression suggest a hierarchy of dominance, a feature of nucleolar dominance; being the small RONs activated only on demand. Immunodetection of histone modifications showed different patterns to methylation distribution across the chromatin as a whole; where H3K9Met1 was found mainly distributed along the nuclear chromatin without an evident signal into nucleolus, while H3K9Met2 was detected as conspicuous dots in the nuclear chromatin and highly accumulated into the nucleolus. The results indicate different control on heterochromatin establishment and maintenance, being the modifications specific to certain chromosomal regions. Indeed, H3K9Met is a key component in the nucleolus chromatin architecture and expression. The chromatin inside the nucleolus showed a high accumulation of H3K14ac, with a weak fluorescent signal along the nucleus; on the other hand H4K8ac showed a strong signal homogenously distributed across the nuclear chromatin, but without evident signals inside the nucleolus. DNA methylation was directly associated with different levels of chromatin organization of the NORs. The heterochromatic regions associated to RON are highly methylated, while the chromatin inside the nucleolus showed weaker signals, with some bright spots probably in condensed regions and related to chromatin inactivity. Extended DNA fiber allowed a higher resolution mapping that revealed long methylated regions intermingled by nomethylated ones, being the last probably associated to transcriptional loops of rRNA genes into the nucleolus. The results presented herein contributes to a better understand about the nucleolar chromatin architecture and the genetic and epigenetic control of the ribosomal genes expression on plant genomes.

A proteína dermicidina (DCD) é codificada por um gene localizado na porção 12q13 do cromossomo 12, presente apenas em primatas e humanos. A proteína é secretada por células de glândulas da pele, melanócitos, neurônios e células epiteliais da mama normal. Alguns estudos inciais revelaram a participação da proteína DCD em processos oncogênicos nos carcinomas de mama, próstata e melanoma pela sua capacidade de atuar como um fator de crescimento e sobrevivência celular. Nos estudos realizados no nosso laboratório mostramos que a DCD é expressa em células normais da pele, placenta, cérebro e em vários tumores, incluindo os carcinomas de mama e melanoma maligno. Ensaios biológicos e bioquímicos mostraram que o \"knockdown\" da expressão de DCD no melanoma maligno G-361 via RNA de interferência (RNAi) diminuiu significativamente o crescimento in vitro em cultura celular e a formação de tumores em camundongos Nude. Resultados similares foram obtidos quando camundongos Nude transplantados com células de melanoma G-361 foram tratados com anticorpos policlonais de coelhos contra a proteína DCD. Para compreender melhor o papel da proteína DCD na transformação de células de melanoma G-361 foram feitos ensaios de microarranjo de DNA para identificar os genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens pLKO (controle) e IBC-I que expressa o shRNA para o mRNA da DCD. Entre os 374 genes alterados pelo silenciamento, encontramos 162 com expressão aumentada e 212 com a expressão reduzida. Os estudos de bioinformática pelo software MetaCore mostraram que o silenciamento do gene DNA modula as vias canônicas e redes de sinalização mediadas pelo receptores e ligantes da família BAFF/APRIL que contralam a ativação do fator de transcrição NF-kB, bem como para histonas envolvidas na remodelação da cromatina. Os níveis de expressão de mRNA de 9 genes de interesse foram validados por ensaios de RT-qPCR. Em uma segunda fase do estudo, foram analisadas as proteínas presentes em extratos nuclares dos clones pLKO e IBC-I de melanoma maligno G-361 por espectrometria de massas. Nos extratos proteicos da sublinhagem pLKO foram identificadas 74 proteínas nucleares, enquanto que na sublinhagem IBC-I foram identificadas 31 proteínas. Um grupo de 21 proteínas foi identificado em ambas sublinhagens. Estudos de bioinformática pelo programa STRING revelou que 14 das proteínas identificadas na sublinagem G-361-pLKO faziam interações diretas ou indiretas com a DCD. A rede formada por estas proteínas tem como centro a proteína p53, uma proteína chave na regulação do programa de morte celular e sobrevivência ao estresse oxidativo. Por outro lado, notou-se que a maioria das proteínas identificadas no extrato nuclear da sublinhagem IBC-I é da família das histonas e que poderiam atuar em complexos de remodelação da cromatina nas células G-361-IBC-I. Nossos resultados nos possibilitaram sugerir que futuros estudos sobre a expressão das histonas e suas modificações pós-traducionais poderão ajudar a desvendar o possível papel da DCD na regulação epigenética do melanoma e em outros tipos de cânceres / Dermcidin (DCD) is a human gene mapped to chromosome 12q13 region, only identified in primates and humans, and normally expressed in the eccrine glands of skin and brain. Several studies have confirmed that DCD-derived peptides contribute to innate and immune surveillance and in the oncogenic processes of breast, prostate and skin cancers, as revealed by its role as a growth factor and cell survival. We have further explored DCD function and its tumorigenic potential on skin melanocytes by specifically knocking down its expression in G-361 malignant melanoma cells via expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. Biological and biochemical assays showed that the \"knockdown\" in the expression of DCD in G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA decreased significantly the in vitro growth in cell culture and tumor formation in nude mice. Similar results were obtained treating nude mice bearing G-361 melanoma xenografts with rabbit polyclonal antibodies against DCD protein. Here, we present a DNA microarray-based study that identified the genes that are up- and down-regulated in a G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. A total of 372 genes differentially expressed were identified; being 162 genes up-regulated and 212 genes down-regulated. Bioinformatic studies showed that DCD gene silencing modulates canonical pathways and signaling networks mediated APRIL/BAFF receptors and ligands and NF-kB signaling pathway as well as chromatin remodeling mediated by histone family. The mRNA expression levels of 9 genes of interest were validated by RT-qPCR assays. Next we analyzed the proteins present in nuclear extracts from G-361- pLKO and G-361-IBC-I clones by mass spectrometry. We identified 74 proteins in the G-361-pLKO clone and 31 proteins in the G-361-IBC-I. A group of 21 proteins was identified in both sublineages. Bioinformatics analyses by STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) platform showed that a small portion of the proteins identified only in G-361- pLKO cells was predicted to interact directly with DCD. The network formed by these proteins is centered in the p53 protein, a key regulator of survival and cell death program in response to DNA damage and oxidative stress. On the other hand, this network was completed abrogated using the nuclear protein from G-361-IBC-I because of absence of DCD protein. Since most of the proteins identified in nuclear extracts are of the histone family, it is likely that they are acting in the chromatin-remodeling complexes which are important to remodel nucleosomes of the G-361-IBC-I cells. Our results allowed us to suggest that future studies on the expression of histones and their posttranslational modifications may help to unravel the possible role of DCD in the epigenetic regulation of melanoma and other cancers

L’initiation de la transcription chez les eucaryotes nécessite le recrutement de l'ARN polymérase II (Pol II) et des facteurs de transcription généraux sur les promoteurs de gènes formant le complexe de préinitiation (PIC). Des activateurs se lient en amont du promoteur et stimulent l’ouverture de la chromatine et la formation du PIC en recrutant des complexes coactivateurs. SAGA est un tel coactivateur, conservé chez les eucaryotes, connu pour modifier les histones de tous les gènes et impliqué dans la transcription par Pol II. Dans ce travail, j’ai analysé l'organisation moléculaire de SAGA par microscopie électronique. J'ai (i) étudié l'architecture et les interactions des sous unités du module d’acétylation des histones et l’ai localisé dans SAGA; (ii) obtenu la première carte cryo-EM du complexe SAGA chez la levure et analysé sa flexibilité; (iii) défini le site d'interaction entre TBP et SAGA et montré que le complexe subit un changement conformationnel lors de cette liaison. / Transcription initiation in eukaryotes requires the recruitment of RNA polymerase II (Pol II) and general transcription factors to the promoters of protein coding genes in order to form a PreInitiation Complex (PIC). Sequence specific activators bind up stream of the promoter, stimulating chromatin opening and PIC formation via recruitment of coactivator complexes. SAGA is such a coactivator, conserved in all eukaryotes, known to modify the histones on all expressed genes in yeast and human and involved in Pol II transcription. In this work I have analyzed SAGA’s molecular organization mostly by electron microscopy. I have (i) studied the architecture and sub unit interactions of SAGA histone acetylation (HAT) module and localized it in the full SAGA complex; (ii) obtained the first cryo-EM map of yeast SAGA and analyzed its flexibility; (iii) defined the interaction site of SAGA with TBP protein and shown that the complex under goes a large conformational change upon TBP binding.