Abstract: Molecular and cellular insights into IKAP and Elongator functions As the first step in the complex process of gene expression, the transcription of genes from DNA to RNA by RNA polymerase II is subject to a multiplicity of controls and is thereby the endpoint of multiple cell regulatory pathways. We focused here on the molecular and cellular functions of IKAP and by extension of Elongator complex, initially found associated with the hyperphosphorylated RNA polymerase II during the elongation stage of transcription. IKAP is required for the assembly of Elongator subunits into a functional complex. Elongator has a histone acetyltransferase (HAT) activity associated with one of its subunits, named hELP3. In agreement with a potential role in transcript elongation, Elongator is associated with nascent RNA emanating from the elongating RNA polymerase II along the transcribed region of several yeast genes and chromatin immunoprecipitation experiments have also demonstrated an association of Elongator with genes in human cells. Different mutations in the human IKBKAP gene, encoding IKAP/hELP1, cause familial dysautonomia, a severe neurodevelopmental disease with complex clinical characteristics. Affected individuals are born with the disease and abnormally low numbers of neurons in peripheral nervous ganglions. To gain insight into the role played by IKAP and the Elongator complex in the transcription of genes and concomitantly learn about the molecular defects underlying the FD, an RNA interference approach was used to deplete the IKAP protein in human cells. In yeast, disruption of ELP1 (yeast homolog of human IKAP) is known to destabilize the ELP3 catalytic subunit, which leads to loss of Elongator integrity. Our experiments performed in human cells revealed that the levels of hELP3 protein is also affected by IKAP depletion after RNAi. We took advantage of this cellular loss-of-function model to identify genes whose transcription requires IKAP, by microarray experiments. Among the identified candidates, several were previously described to be involved in cell motility, or actin cytoskeleton remodelling. Because cell motility is of crucial importance for the developing nervous system, and therefore of obvious relevance to FD, the potential role of IKAP in cell motility was characterized at the cellular level. Several cell motility/migration assays demonstrated that the IKAP depletion has functional consequences so that IKAP-depleted cells showed defects in migration. Particularly, the reduced cell motility of neuronal-derived cell lines may be highly relevant to the neurodevelopmental disorder that affects FD patients. Whether or not the defects in cell migration resulted of impaired transcriptional elongation of the IKAP-dependent genes was investigated by chromatin immuno-precipitation technique. These experiments indicated that IKAP depletion leads to a decreased histone H3 acetylation in the transcribed region of its target genes in the context of Elongator complex. These acetylation defects are correlated with a decrease of the RNA polymerase II recruitment through the transcribed region of target genes, whereas the recruitment on the promoter is mostly unaffected. These results indicate that Elongator affects transcript elongation in vivo, but not the recruitment of the RNA polymerase II to the promoter. These very specific effects of IKAP/hELP1 depletion on histone acetylation and RNA polymerase II density across target genes are consistent with a direct effect of Elongator on transcriptional elongation in vivo and point to a function for Elongator in histone acetylation during transcript elongation. Résumé: Caractérisation des rôles biologiques de la protéine IKAP et du complexe Elongator La transcription des gènes de lADN en ARN est fondamentale pour lexpression des protéines et la capacité de nos cellules à sadapter à leur environnement. Ce processus finement régulé est catalysé par un enzyme, lARN polymérase II, vers lequel convergent une multitude de voies de signalisation. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux fonctions moléculaires et cellulaires de la protéine IKAP et du complexe Elongator. IKAP est la protéine qui assemble les sous unités dElongator en un complexe fonctionnel. Le complexe Elongator est associé à lARN polymérase II hyper-phosphorylée pendant létape délongation de la transcription et possède une activité histone acétyltransferase associée à une de ses sous unités, appelée ELP3. Chez la levure, Elongator est recruté an niveau des ARNs naissants, qui émanent directement de lARN polymérase II au niveau de la région transcrite des gènes étudiés. De plus, des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine ont mis en évidence la présence du complexe Elongator au niveau de plusieurs gènes humains. Différentes mutations au niveau du gène IKBKAP, codant pour la protéine IKAP, sont responsables de la dysautonomie familiale, une maladie génétique qui affecte le développement du système nerveux périphérique. En effet, les individus affectés présentent une diminution de la densité de neurones au niveau des ganglions nerveux périphériques. Lobjectif de nos travaux est de comprendre davantage le rôle de la protéine IKAP et du complexe Elongator dans la transcription des gènes et ainsi, dinvestiguer les mécanismes moléculaires responsables dans la physiopathologie de la dysautonomie familiale. Un modèle de perte de fonction pour la protéine IKAP a dabord été généré par interférence dARN. Des travaux réalisés chez la levure indiquent que la protéine ELP1 (homologue de IKAP chez la levure) est essentielle pour la stabilité de la sous unité catalytique du complexe, la protéine ELP3. Les expériences réalisées sur notre modèle humain démontrent que le taux de la protéine ELP3 est également affecté par la déplétion dIKAP causée par linterférence dARN. Ce modèle de perte de fonction a été utilisé afin détablir la liste des gènes dont lexpression est contrôlée par la protéine IKAP, par des expériences de microarrays. Parmi les candidats identifiés, plusieurs ont été décrits comme impliqués dans la migration cellulaire et le remodelage du cytosquelette dactine. Le processus de migration des cellules est fondamental au cours du développement du système nerveux et par conséquent particulièrement relevant dans le contexte de la dysautonomie familiale. Limplication dIKAP dans la migration cellulaire a été investigué par différents tests de fonction qui montrent que la diminution dIKAP dans différentes lignées cellulaires entraîne une réduction significative de leur capacité migratoire. Ces résultats suggèrent que la diminution du nombre de neurones observée dans les ganglions périphériques des patients atteints de la dysautonomie familiale pourrait résulter dune altération de leur capacité à migrer au cours du développement. Enfin, des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine ont été menées en utilisant notre modèle afin de déterminer dans quelle mesure le déficit de migration observé en labsence dIKAP serait la conséquence dun défaut de la fonction dElongator au niveau de lélongation de la transcription des gènes. Les résultats nous ont montré que la diminution dexpression dIKAP entraîne une réduction de lacétylation des histones H3 dans la région transcrite de ses gènes cibles. De plus, ce déficit dacétylation est directement corrélé avec un désengagement progressif de lARN polymérase II le long de la région transcrite de ces gènes. Par conséquent, ces résultats démontrent que le complexe Elongator affecte lélongation des transcrits in vivo, mais pas le recrutement de lARN polymérase II au niveau du promoteur. Ces effets très spécifiques de labsence dIKAP sur lacétylation des histones et lengagement de la polymérase II dans la transcription des gènes cibles montrent quElongator exerce un rôle direct au niveau de lélongation de la transcription de ces gènes. De plus, ces résultats suggèrent que la fonction dElongator serait dacétyler les histones au cours de lélongation transcriptionnelle in vivo.

Les éléments transposables sont des séquences génomiques capables de se répliquer et de se déplacer dans les génomes. Leur capacité à s'insérer près des gènes et à produire des réarrangements chromosomiques par recombinaison entre copies, font des éléments transposables des agents mutagènes. Les éléments transposables sont de plus capables de modifier l'expression des gènes voisins grâce aux régions promotrices qu'ils possèdent. Les éléments transposables ont été trouvés dans la plupart des génomes dans lesquels ils ont été recherchés. Ils forment ainsi 45 % du génome de l'homme et peuvent représenter jusqu'à 90 % du génome de certaines plantes. Dans la première partie de ma thèse, je me suis penché sur les facteurs qui déterminent la distribution de ces éléments. Je me suis intéressé à un facteur particulier, qui est la fonction des gènes dans le voisinage des insertions d'éléments transposables. Dans la deuxième partie, j'ai essayé de déterminer l'impact de l'altération des modifications épigénétiques (modifications d'histones plus précisément) associées aux différents composants géniques, dont les éléments transposables, sur la variation de l'expression des gènes en condition tumorale.

Tip60 is a 60 kDa nuclear protein which exists in three isoforms, belongs to the MYST/HAT family of proteins and was discovered after its interaction with the Human HIV-1 Tat. As a nuclear protein, Tip60 can act as a coactivator or repressor. To understand the HAT action of Tip60, two possible catalytic models exist; the ping-pong and the ternary complex formation models. In correlation with the exploration of HAT catalytic action, mutations of a Cys to Ala and a Glu to Gln on Esa1 (yeast homolog of Tip60 and MYST/HAT prototype), was reported to show wild type-like and decreased acetylating properties, respectively. In this work, Tip60 HAT action was explored. In Tip60, the Cys in the active site is important for acetylation of the H4(1-20) substrate and the Glu showed semi loss in acetylating the H4(1-20) peptide substrate. These data highlight a unique mechanism of Tip60 catalysis.

Durant la dernière décennie, la problématique de santé liée aux perturbateurs endocriniens (PE) s'est étendue à la toxicité des mélanges. L'objectif de ce travail était de définir les conséquences d'une exposition continue à des cocktails des PE, à des doses faibles et définies comme "non nocives " par les autorités réglementaires. Des mélanges associant la génistéine, la vinclozoline, et le Bisphénol A, ont fait l'objet d'étude intégrative et multi-générationnelle chez le rat qui prend en compte le comportement maternel, le comportement alimentaire et le développement. Nos résultats montrent que ces mélanges peuvent: a) diminuer le comportement maternel, b) modifier les préférences gustatives (sucré, salé), c) affecter le développement dès la période utérine (malformations) jusqu'à l'âge adulte (surpoids), d) perturber le bilan métabolique (femelles) et l'expression par la glande salivaire de gènes codant des protéines impliquées dans la gustation, d'engendrer des effets épigénétiques sur sur la génération F2 non exposée. L'étude in vitro confirme que la Génistéine et/ou la Vinclozoline, introduites durant l'induction de la différenciation adipocytaire affectent le développement des 3T3-L1et leur activité endocrine (leptine; triglycérides), et révèle que la Vinclozoline potentialise l'effet anti-adipogénique de la Génistéine.En conclusion, ce travail montre qu'une exposition à des mélanges de PE peut altérer le comportement et le développement, et prédisposer l'organisme à développer des maladies métaboliques telles que le diabète et l'obésité, mais que les propriétés hormonales de chaque composant ne sont pas prédictives des effets cocktails

La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant l'acoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. En el decurs d'aquest treball s'ha continuat l'estudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en l'estabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava l'oligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en l'estructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de l'estructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a l'atzar (random coil). D'altra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristal·logràfiques. Un altre objectiu d'aquest treball va ser la caracterització de les interaccions de l'NP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se d'algun altre tipus d'interacció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus d'histones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol d'octàmer d'histones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç d'unir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no d'una NP-like a l'extracte d'oòcits de l'estrella de mar "Echinaster sepositus". S'ha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. D'altra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina.El darrer objectiu del treball va ser l'estudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de l'equinoderm "Holothuria tubulosa" i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristal·lització d'una molècula d'aquestes característiques aportaria informació sobre l'estructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristal·lització de les protamines i dels complexos NP-protamina. / Nucleoplasmin (NP) is the most abundant protein found in the nuclei of oocytes and nonfertilized eggs of "Xenopus laevis" and other amphibians. It is an acidic protein with three main acidic tracts (A1, A2, A3). NP is involved in the remodelation of chromatin during fecundation, facilitating nucleosome assembly as a molecular chaperone.In the present work we have continued the study of different recombinant forms of nucleoplasmin which were obtained in our lab, specially the form r-NP142 which has the main acidic tract A2 very exposed. We were interested in how different conditions could affect the stability and pentamerization of the molecule. In this way we studied the importance of Cys in NP pentamerization. We used site directed mutagenesis in order to change Cys for Ser. We observed that the mutation of Cys 45 favoured the monomerization of r-NP142, but this change didn't affect the oligomerization of the forms r-NP and r-NP121, which remained pentameric. These results suggest the absence of disulfide bridges in the pentameric structure of nucleoplasmin. The structural characterization of nucleoplasmin has been studied at different levels. At the secondary structure level we have used circular dichroism techniques and we have determined that the mutant r-NP142 C45S is in random coil conformation. For higher structural levels we have used electron microscopy and crystallographic techniques.Another objective of this work was the characterization of the interactions between NP and nucleosomal core histones. We were specially interested in knowing if the interaction was fundamentally electrostatic. Using analytical ultracentrifugation and sucrose gradient experiments we could determine that NP can bind the four types of nucleosomal histones. This binding would have an stoichiometry equal to 1 mol of NP pentamer per mol of histone octamer. It is important to note that NP can bind trypsinated histones (without the basic tails) maintaining the same stoichiometry as in the case of native histones. In the same way, the r-NP121 form (without the acidic tract A2) is capable of binding native histones with the same stoichiometry described for the other cases. These result indicates that the interaction NP-histones is not mainly electrostaticaly driven.Another objective of this work was the study of the presence of some NP-like proteins in oocyte extracts of the starfish "Echinaster sepositus". We have found a very abundant protein which is termoestable, acidic and partially resistant to ammonium sulphate. This protein is recognized by policlonal antinucleoplasmin antibodies which were obtained in hen eggs. However, it is not able to decondense spermatic nuclei which contain protamine.The last objective of the present work was the structural study of the protein ?0 which is specific of the nuclei of the echinoderm "Holothuria tubulosa" and has intermediate properties between histones and protamines. The crystallization of a molecule like ?0 could bring information about the structure of proteins that participate in chromatin condensation and could offer a new way for the crystallization of protamines and NP-protamine complexes.

The aim of this thesis is to study the energy fluctuations (leading to thermal fluctuations) during thermal and enzymatic denaturation of biological molecules and to study the variation in fluctuations between simple molecules like the DNA (which have only a secondary structure) to molecules with higher order structures and packaging. We have developed a new technique - Thermal Fluctuation Spectroscopy (TFS) to study these fluctuations. The technique of Thermal Fluctuation Spectroscopy (TFS) is a combination of microcalorimetry and noise measurement techniques. The combination of these two powerful techniques has never been exploited before. In this technique any energy exchange between sample and the substrate is reflected as a thermal fluctuation of the substrate. The system resolution is few parts per billion (ppb) and fluctuations in energy ~ 100nJ (which correspond to temperature fluctuations ~ K) can be measured. Chromatin is the basic building block of chromosome and this thesis focuses on the constituents this fundamental building block - DNA, histones and nucleosomes. Heteropolymeric dsDNA shows extremely large non-Gaussian fluctuation around its melting temperature. For homopolymeric DNA the fluctuations during denaturation are smaller. The thermal fluctuation during denaturation of a heteropolymer in buffer is several orders larger than when the DNA is on a substrate while that for a homopolymer is comparable in both cases. Our measurements established that heteropolymeric dsDNA denaturation occurs in two stages. Initially, at around 330 K, bubbles are formed in the AT rich regions. At higher temperatures, the GC rich regions binding them denature in a cooperative transition causing extremely large fluctuations. TFS on histone monomers showed that H1 monomer shows an increase in thermal fluctuation in the temperature range studied, while the core histones did not. We infer that this is due to the fact that the core histones may not be properly folded when they exist as monomers. It was seen that H1 crosses an energy barrier of 17 kcal/mol to go from its native to denatured state. The transition was kinetically driven with a fixed barrier till 352 K. At 352K, the barrier softened by ~ 1 kcal/mol leading to faster denaturation. The core histones when assembled as dimers/oligomers showed an increase in fluctuation at temperatures below 350 K. The assembling of these histones and DNA into a mononucleosome causes a very large increase in fluctuation over the entire temperature range studied. TFS showed that the fluctuation during mononucleosome denaturation was much larger than a simple sum of the fluctuations of its constituents. From the data we were able to identify that the denaturation starts with dissociation and unfolding of the core histones and the denaturation of AT rich regions of the DNA which leads to the breaking of some of the histone-DNA contacts. At higher temperatures the linker histone H1 and the GC rich regions of the DNA denature, leading to a collapse of the entire nucleosome structure. The broadness of the transition region (the fact that the fluctuation is large over the entire temperature range) was attributed to the presence of different types of contacts and interactions (with different energies) stabilizing the nucleosome structure. The nucleosome was found to favour large energy jumps over smaller ones indicating that the denaturation has an element of cooperativity involved. Using TFS we have been able to determine the fluctuations involved in the denaturation of biomolecules like DNA, histones and nucleosomes. The energy barriers to denaturation have been determined. We have also been able to give models for the denaturation of these biomolecules. We have also shown that it is possible to study enzymatic digestion using TFS. Thus, the technique of TFS is a viable tool for the study of fluctuations in reactions, in biomolecules, during transitions and in any process where there is an energy exchange involved.

Histones are chromatin-associated proteins localized to the nucleus. However, extracellular histones are present in biofluids from healthy individuals and become elevated under disease conditions, such as neurodegeneration and cancer. Hence, extracellular histones may have important biological functions in healthy and diseased states, which are not understood. Histones have been reported in the proteomes of extracellular vesicles (EVs), including microvesicles and exosomes. The main aim of this thesis was to determine whether or not extracellular histones are secreted via EVs/exosomes. In an initial study (Paper I), I optimized methods for human embryonic kidney (HEK293) cell culture, transfection and protein detection using western blotting. In the main study (Paper II), I used oligodendrocyte cell lines (rat OLN-93 and mouse Oli-neu) to investigate the localization of histones to EVs. Western blotting of EVs purified from OLN-93 cell-conditioned media confirmed the presence of linker and core histones in them. Immunolocalization and transmission electron microscopy confirmed that histones are localized to EVs, as well as intraluminal vesicles (ILVs) within multivesicular bodies (MVBs). This suggests that histones are secreted via the MVB/exosome pathway. Localization of histones in EVs was investigated by biochemical/proteolytic degradation and purification followed by western blotting. Surprisingly, histones were associated with the membrane but not the luminal fraction. Overexpression of tagged histones in HEK293 cells confirmed their conserved, membrane localization. OLN-93 cell EVs contained both double stranded and single stranded DNA but nuclease and protease digestion showed that the association of histones and DNA with EVs was not interdependent. The abundance of histones in EVs was not affected by differentiation in Oli-neu cells. However, histone release was upregulated as an early response to cellular stress in OLN-93 cells and occurred before the release of markers of stress including heat shock proteins. Interestingly, a notable upregulation in secretion of small diameter (50-100 nm) EVs was observed following heat stress, suggesting that a sub-population of vesicles may be involved specifically in histone secretion in response to stress. Proteomic analyses identified the downregulation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) as a possible mechanism underlying increased histone secretion. In Paper III, I developed methods to quantify extracellular histone proteins in human ascites samples from ovarian cancer patients.   In summary, we show for the first time that membrane-associated histones are secreted via the MVB/exosome pathway. We demonstrate a novel pathway for extracellular histone release that may have a role in both health and disease.

La Bruton tyrosine kinase ou Btk est une protéine dont le rôle dans la maturation des lymphocytes B est connu depuis plusieurs années. Par contre, son rôle dans le contrôle de l’immunité innée est moins établi. Nous avons montré que, en réponse à la voie des Toll like Receptors ou TLRs, Btk régule la stabilité de l’ARN messager du TNF-α par l’intermédiairede la protéine TTP ou Tristétraproline. Par ailleurs, nous avons montré que l’expression d’un microARN, le miR-346, régulait négativement la protéine Btk et donc la synthèse de TNF-α. L’amplification de l’expression de ce miR-346 par transfection permet d’avoir un effet anti-TNF-α et anti-Btk interessant notamment dans le modèle cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde. Enfin, nous avons montré que, en réponse au TLRs, la modulation de l’expression du TNF-α en fonction de l’état de méthylation de l’ADN et d’acétylation des histones dépendait directement de l’expression du couple miR-346 et Btk. Btk est donc une protéine charnière dans le contrôle de l’inflammation par les mécanismes épigénétiques que sont les miARNs, la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones. Sur le plan thérapeutique, l’inhibition de cette protéine par ces différents mécanismes de régulation semble donc être très interessante, à la fois dans les maladies inflammatoires et néoplasiques. / Bruton tyrosine kinase, or Btk, is a protein whose role in the maturation of B cells has been known for several years. However, its role in the control of innate immunity is less established. We have shown that, in response to Toll like Receptors pathway or TLRs, Btk regulates the stability of the mRNA of TNF-α via the TTP or Tristetraprolin protein. Furthermore, we showed that the expression of microRNA, the miR-346, negatively regulated the Btk protein and thus the synthesis of TNF-α. Upregulation of miR-346 by transfection act as an anti-TNF-α and anti-Btk drugs, especially in the cellular model of rheumatoid arthritis.Finally, we showed that, in response to TLRs, the modulation of the expression of TNF-α according to the state of DNA methylation and histone acetylation depended directly on crosstalk beetween miR-346 and Btk. Btk is a key protein in the control of inflammation by epigenetic mechanisms such as miRNAs, DNA methylation and histone acetylation. As therapeutic interest, inhibition of Btk by those different regulatory mechanisms seems to be very interesting, both in inflammatory and neoplastic diseases.

Chaque cellule humaine est constamment soumise à des agressions extérieures comme l'exposition aux rayons Ultra-Violets, agents chimiques, etc. ou endogènes provenant de la production de métabolites par la cellule elle-même. Ces agressions induisent des dommages dans l'ADN. Ces dommages, s'ils ne sont pas réparés correctement, peuvent induire un dérèglement des fonctions de base de la cellule qui peut alors devenir cancéreuse. Pour réparer leur ADN, les cellules activent divers mécanismes de réparation et établissent une signalisation au niveau des sites endommagés. Dans le noyau, l'ADN est associé à des protéines appelées histones pour former la chromatine. La chromatine se caractérise par différents niveaux d'organisation, aboutissant à la formation d'une structure très compacte. Cette compaction élevée de la chromatine peut représenter une barrière pour la machinerie de réparation. En effet, pour être réparé, l'ADN endommagé doit être accessible à la machinerie de réparation. Pour cela, les cellules ont développé des mécanismes permettant d'accéder à l'ADN endommagé. Ces mécanismes de réponse aux dommages à l'ADN impliquent l'activation de voies de signalisation. L'un des signaux précurseurs activés après dommage à l'ADN est la Poly-ADP-Ribosylation (PARylation). La PARylation est une modification post-traductionnelle composée d'une répétition de petites molécules appelées Poly-ADP-Riboses, qui s'accrochent notamment sur les histones pour signaler la présence de cassures dans l'ADN et permettent ainsi de recruter les protéines impliquées dans la réparation des dommages. Lorsque l'ADN est endommagé, l'activation de processus de réparation induit de manière précoce le recrutement de facteurs de remodelage de la chromatine. Le rôle exact de la signalisation via la PARylation durant les étapes précoces de la réponse aux dommages à l'ADN et plus particulièrement lors du remodelage de la chromatine reste encore mal caractérisé. Durant ma thèse, j'ai utilisé des techniques avancées en microscopie pour étudier la dynamique de la chromatine après induction de dommages à l'ADN. J'ai ainsi tenté d'élucider le rôle de la PARylation dans le mécanisme de remodelage de la chromatine au niveau des dommages dans l'ADN, en recherchant des facteurs permettant d'altérer de manière spécifique la dynamique de la chromatine. Cette méthodologie nous a permis d'identifier différents facteurs impliqués dans le remodelage de la chromatine après dommage à l'ADN. / In each human cell, many thousands of DNA lesions arise every day, challenging continuously the genome integrity. The majority of these lesions results from byproducts of normal cell metabolism or DNA replication, but they are also induced by exposure to radiations and genotoxic chemicals. The integrity of the genome is preserved by a plethora of different DNA damage signalling and repair machinery arranged by the cells. In the cell nucleus, DNA associates with scaffolding proteins to form the chromatin. The chromatin is tightly packed in the nucleus through several levels of organization. Such high-packing state poses a significant challenge for the repair machinery. Indeed, the damaged DNA needs to be accessible to repair proteins, and for that, cells have developed several mechanisms to allow the access to the damaged chromatin. The early steps of the DNA damage response involve the activation of proteins that are part of signalling pathways. One of the proteins activated upon DNA damage is PARP1, which synthetizes long and branched chains of ADP-ribose (poly-ADP-ribose or PAR) on itself and other chromatin factors, including histones. The activation of PARP1 leads to the recruitment of several effectors involved in DNA repair and chromatin remodeling. However the exact function of the PAR-signalling during early DNA damage response and in particular during chromatin remodeling at DNA breaks remains unclear. During my PhD, I used advanced fluorescent imaging tools to study in living cells the dynamics of chromatin in the nucleus at a local scale upon DNA damage. I used these tools to study PAR-dependent chromatin relaxation after DNA damage and to screen factors that selectively alter the dynamic behaviour of the damaged chromatin. This methodology allowed us to identify PAR-dependent factors involved in the local chromatin remodeling upon DNA damage.

Global change poses new threats for life in the oceans forcing marine organisms to respond through molecular acclimatory and adaptive strategies. Although bivalve molluscs are particularly tolerant and resilient to environmental stress, they must now face the challenge of more frequent and severe Harmful Algal Blooms (HABs) episodes. These massive outbreaks of microalgae produce toxins that accumulate in the tissues of these filter-feeder organisms, causing changes in their gene expression profiles, which in turn modify their phenotype in order to maintain homeostasis. Such modifications in gene expression are modulated by epigenetic mechanisms elicited by specific environmental stimuli, laying the foundations for long-term adaptations. The present work aims to examine the links between environmental stress in bivalve molluscs (with especial emphasis on Harmful Algal Blooms) and specific epigenetic marks triggering responses through modifications in gene expression patterns. Overall, a better understanding of the molecular strategies underlying the conspicuous stress tolerance observed in bivalve molluscs will provide a framework for developing a new generation of biomonitoring strategies. In addition, this strategy will represent a valuable contribution to our knowledge in acclimatization, adaptation and survival. With that goal in mind, the present work has generated transcriptomic data using RNA-Seq and microarray technologies, facilitating the characterization and investigation of the epigenetic mechanisms used by the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis during responses to HAB exposure. That information was made publicly available through a specialized online resource (the Chromevaloa Database, chromevaloa.com) assessing the response of chromatin-associated transcripts to Okadaic Acid. Specific epigenetic marks have been assessed under lab-controlled exposure experiments simulating the natural development of the HAB Florida Red Tide (FRT). Results demonstrate a role for the phosphorylation of histone H2A.X and DNA methylation in the response to FRT in the Eastern oyster Crassostrea virginica. Lastly, the study of co-expression networks based on RNA-Seq data series from the Pacific oyster Crassostrea gigas reveals dynamic transcriptomic patterns that vary with time, stressor and tissue. However, consistent functional profiles support the existence of a core response to general conditions of environmental stress. Such response involves metabolic and transport processes, response to oxidative stress and protein repair or disposal, as well as the activation of immune mechanisms supporting a tightly intertwined neuroendocrine-immune regulatory system in bivalves.