Le génôme des cellules eucaryotes est condensé au sein d'une structure complexe hiérarchiquement organisée : la chromatine. La chromatine est composée d'ADN, de protéines histone et non-histone. Cette thèse a pour but d'étudier le rôle de la chromatine dans la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN (DDR) par les méthodologies de génomique fonctionnelle et de protéomique. Nous avons tout d'abord analysé les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones dans le cadre des pontages inter-brins (ou "Interstrand Crosslinks", ICL), type particulier de lésions de l'ADN, en choisissant le modèle de l'Anémie de Fanconi (FA). Ceci a été réalisé grâce aux techniques de protéomique quantitative SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acid during Cell culture) et de spectrométrie de masse (MS). Nous avons ainsi réussi à identifier et à quantifier de nombreuses PTMs dans les histones H3 et H4, et à démontrer que certaines de ces PTM sont dépendantes d'une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également approfondi l'étude des DDR dans les cellules de FA par une approche de génomique fonctionnelle. Pour cela, nous avons analysé le profil l'expression d'enzymes associées à l'acétylation et à la méthylation des histones. Nos résultats suggèrent l'existence de corrélations entre le profil d'expression de ces enzymes et les PTMs des histones. Des études complémentaires sont nécessaires en vue de confirmer ces corrélations. Nous avons également comparé le transcriptome de deux lignées cellulaires de FA (mutée en FANCC et corrigée en FANCC) après induction de dommages à l'ADN. Afin de différencier les changements spécifiquement associés à la voie de signalisation de FA en réponse aux ICL de l'ADN des réponses plus générales aux dommages de l'ADN, nous avons inclus des cellules traitées par rayonnement ionisant. En réalisant une analyse d'interactions factorielles, nous avons pu identifier une réponse transcriptionnelle aux dommages de l'ADN nécessitant une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également tenté de pallier aux limitations rencontrées dans l'analyse des PTMs des histones. En effet, les PTMs des histones que nous avons identifiées représentent l'ensemble des modifications, c'est-à-dire les PTMs concernant les histones se trouvant immédiatement à proximité du site du dommage et en relation directe avec celui-ci, et les PTMs se trouvant à distance du dommage et pouvant ne pas être en relation directe avec celui-ci. Les approches courantes pour identifier les PTMs se trouvant à des loci particuliers sont basées sur l'immunoprécipitation classique de la chromatine où l'utilisation de formaldéhyde altère les protéines, ce qui en rend impossible l'analyse par MS. Nous avons proposé une nouvelle méthodologie basée sur la biotinylation expérimentale d'histones situées à proximité d'une protéine particulière, suivie de la purification des nucléosomes contenant ces histones biotinylées. Contrairement àl'immunoprécipiatation classique de la chromatine, cette méthode n'induit pas d'altération des protéines, permettant ainsi de purifier les histones à partir d'un locus spécifique et d'analyser à grande échelle leurs PTMs par MS. Cette approche permet aussi de suivre dans le temps les PTMs d'une fraction des histones juste après leur biotinylation. Enfin, elle présente l'avantage de pouvoir étudier le profil des PTMs de différents états fonctionnels de la chromatine grâce à l'utilisation de variants d'histones. / In eukaryotic cells, the genome is packed into chromatin, a hierarchically organized complex composed of DNA and histone and nonhistone proteins. In this thesis we have addressed the role of chromatin in cellular response to DNA damage (DDR) using various methodologies encompassing functional genomics and proteomics. First, we analyzed histone post-translational modifications (PTM) in the context of specific kind of DNA lesions (ICL-Interstrand Crosslinks) in Fanconi anemia using quantitative proteomics methodology, SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acids during Cell Culture). Using mass spectrometry (MS), we have successfully identified and quantified a number of histone PTM marks in histone H3 and H4, mainly acetylations and methylations,which have shown dependence upon functional FA-pathway. As a next step, we applied a functional genomics approach to study DDR in FA cells. In this analysis we first monitored the expression profile of histone modifying enzymes related to histone acetylations and methylations. Our results suggest some correlations between histone PTMs and gene expression of histone modifying enzymes, although conclusive evidence warrants further investigations. Next, we analyzed the total transcriptome after DNA damage induction in FA mutant and wild type cells. We also included in this analysis IR irradiation, in an attempt to dissociate more generic DDR from more specific changes that are associated with the role of FA pathway to the DNA ICLs. By performing a factorial interaction analysis, we were able to isolate the part of transcriptional response to DNA damage that was requiring functional FA pathway, as well as the genes that were sensitized to DNA damage by the inactivation of FA pathway. In the final part of the thesis, we attempted to solve one of the limitations that we encountered in the histone PTM analysis. The current approaches used to study histone PTMs from particular loci involves classical chromatin immunoprecipitation, which due to involvement of formaldehyde crosslinking render the protein part mostly unavailable for MS-based proteomics. We have proposed a novel methodology, which is based upon the biotin tagging of histones proximal to a protein of interest and subsequent purification of nucleosomes carrying the tagged histone. This methodology does not involve any crosslinking, enabling us to purify histones from specific loci, and subject them to large scale MS-based histone PTM analysis. A time dimension can also be added to our approach, as we can follow the modification status of particular fraction of histones once they get biotinylated. Another advantage is the use of alternate variant histones, which allows us to study the PTM profile of different functional states of chromatin. This methodology certainly has an edge on current techniques to study histone PTMs pattern associated with a particular protein of interest or with particular chromatin state.

La transition épithélio-Mésenchymateuse (TEM) est un processus de plasticité cellulaire qui existe dans le développement embryonnaire et qui permet la formation des tissus et organes. Dans la cancérogénèse, ce processus est réactivé par des facteurs de transcription dont l’action implique très probablement un remodelage de la chromatine. La cartographie exacte de ces changements épigénétiques est peu connue à l’échelle du génome entier, même si il y a eu quelques études antérieures explorant les changements de quelques loci de façon bien ciblée. Ce mémoire traite du remodelage épigénétique médié par le facteur de transcription Twist1 dans un modèle de lignée mammaire immortalisée. L’architecture de ce remodelage a été cartographiée grâce à l’utilisation des techniques de haut-Débit pour analyser la méthylation de l’ADN (DREAM) et les modifications des histones (ChIPseq). Nos résultats montrent un changement majeur du méthylome pendant la TEM avec une hyperméthylation focale et une hypométhylation globale des corps des gènes prédominant au niveau des « domaines partiellement méthylés »; ces domaines sont déjà connus dans le développement pour gagner de façon concomitante à leur hypométhylation des marques d’histone répressives. Nous avons aussi observé un remodelage des domaines de l’histone répressive H3K27me3 avec une réduction de leur taille, et surtout le quasi doublement du nombre de gènes bivalents qui accompagne la transition. Le couplage de la méthylation de l’ADN avec le profil des microRNA nous a permis d’identifier le miR-203 comme l’unique microRNA régulé par méthylation de l’ADN durant la TEM; nous avons aussi montré que l’extinction épigénétique du miR-203 est requise pour la TEM et l’acquistion des propriétés de cellules souches. Enfin, nous avons réalisé une caractérisation génétique et/ou épigénétique de deux cancers rares, les carcinomes fibrolamellaires du foie et les carcinomes du rein à translocation. Pour les carcinomes fibrolamellaires du foie, nous avons décrit la nature endocrine de cette tumeur et établi une signature épigénétique basée sur la méthylation de l’ADN pouvant servir à différencier les formes histologiques appelées « pures » des formes « mixtes ». Pour les cancers du rein à translocation, nous avons montré les bases génétiques et épigénétiques de la différence entre les formes pédiatriques et adultes, avec la découverte fréquente du gain du bras chromosomique 17q dans les formes adultes. Nous avons aussi identifié une mutation récurrente dans le gène qui remodèle la chromatine INO80D appartenant à la famille INO80. En conclusion, ce travail explore le rôle de l’étude de l’épigénome pour comprendre la reprogrammation pendant les processus physiologiques comme la TEM d’une part et le cancer d’autre part. / The epithelial-Mesenchymal transition (EMT) is a process of cellular plasticity that exists in embryonic development and which allows the formation of tissues and organs. In carcinogenesis, the process is reactivated by transcription factors whose action probably involves chromatin remodeling. The exact mapping of these epigenetic changes is poorly understood genome-Wide, although there have been some previous studies exploring changes in so few well-Targeted loci. This thesis deals with the epigenetic remodeling mediated by the transcription factor Twist1 in a model of human mammary immortalized cell line. The architecture of this remodeling has been mapped through the use of high-Throughput techniques to analyze DNA methylation (DREAM) and histone modifications (ChIPseq). Our results suggest a major change in the EMT methylome with focal hypermethylation and gene body hypomethylation predominantly within "partially methylated domains"; these areas are already known in development to gain repressive histone marks concomitantly with DNA hypomethylation. We also observed landscape remodeling of repressive histone mark H3K27me3 with a reduction in domains size, and especially the almost doubling of the number of bivalent genes. The coupling of DNA methylation with the profile of microRNA has allowed us to identify miR-203 as single microRNA regulated by DNA methylation during EMT; we have also shown that epigenetic suppression of miR-203 is both required for EMT and acquisition of stem cell properties. Finally, we performed a genetic and/or epigenetic characterization of two rare cancers, named fibrolamellar hepatocellular carcinomas and translocation renal cell carcinomas. In fibrolamellar hepatocellular carcinoma, we described the endocrine nature of this tumor and established a signature based on DNA methylation which can be used to distinguish histological forms called "pure" from "mixed" fibrolamellar hepatocellular carcinomas. Regarding translocation renal cell carcinomas, we established the genetic and epigenetic basis of differences between pediatric and adult forms, characterized by frequent gain of 17q gain chromosomal arm in adults. We also identified recurrent mutations in the chromatin remodeling gene INO80D which belongs to INO80 family. In conclusion, this work explores the impact of analyzing the epigenome to understand reprogramming during physiological processes such as EMT and cancer.

Les modifications post-traductionelles des histones contribuent à l’expression génique et à la stabilité du génome. La méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), une marque associée aux promoteurs de gènes transcrits, est déposé par les methyltransferases hautement conservées de la famille SET1, dans le contexte du complexe COMPASS. SET-2, l’homologue de SET1 chez Caenorhabditis elegans, est responsable de la déposition de H3K4me dans la lignée germinale, et son inactivation provoque une perte progressive de la fertilité. Le but de mon travail de thèse a été d’étudier comment SET-2 et la méthylation de H3K4 contribuent au maintien de la lignée germinale. J’ai montré que l’absence de SET-2 provoque une sensibilité accrue aux dommages à l’ADN. Cependant, les voies de signalisation et de réparation de ces dommages sont fonctionnelles dans le mutant set-2. Par séquençage de l’ADN, j’ai par ailleurs montré que la stérilité progressive observée en l’absence de set-2 n’est pas due à une capacité de réparation réduite. L’ensemble de mes résultats suggère que H3K4me pourrait agir en aval de la signalisation de dommages à l’ADN, en influençant l’organisation de la chromatine aux sites des cassures double brin. J’ai d’autre part mis en évidence une nouvelle fonction pour la méthylation de H3K4 dans l’organisation de la chromatine en montrant que set-2 interagit génétiquement avec le complexe Condensine II et la Topoisomérase II, facteurs clefs de l’organisation mitotique des chromosomes. Des expériences de microscopie par FLIM-FRET ont d’ailleurs validé une fonction de H3K4 méthylée dans l’organisation de la chromatine dans la lignée germinale. Enfin, j’ai montré par analyses transcriptomiques que la protéine CFP-1 du complexe COMPASS est impliquée dans la régulation du programme transcriptionnel de la lignée germinale et que cette fonction est indépendante de SET-2. L’ensemble de mes résultats montre comment la régulation chromatinienne impacte le maintien d’une lignée germinale fonctionnelle à plusieurs niveaux. / Post-translational modifications of histones contribute to gene expression and genome stability. Methylation of lysine 4 of histone H3 (H3K4me), a mark associated with actively transcribed genes, is deposited by the highly conserved SET1 family methyltransferases acting in COMPASS related complexes. SET-2, the SET1 homologue in Caenorhabditis elegans, is responsible for the deposition of H3K4me in the germ line, and its inactivation causes progressive loss of fertility. The purpose of my PhD work was to study how SET-2 and the methylation of H3K4 contribute to the maintenance of the germ line. I have shown that the absence of SET-2 causes increased sensitivity to DNA damage. However, the DNA damage-induced signaling and repair pathways are functional in the set-2 mutant. By DNA sequencing, I have also shown that the progressive sterility observed in the absence of set-2 is not due to a reduced repair capacity. Together, my results suggest that H3K4 methylation may act downstream of DNA damage signaling, potentially by influencing the organization of chromatin at the sites of double-strand breaks. I have also described a new function for H3K4 methylation in the organization of chromatin by showing that set-2 genetically interacts with the Condensitin II complex and Topoisomerase II, key factors in mitotic chromosome organization. Moreover, FLIM-FRET microscopy experiments have validated a role for H3K4 methylation in germline chromatin organization. Finally, using transcriptomic analyses, I have described a function for CFP-1, a component of the COMPASS complex, in the regulation of the germline transcriptional program independent of SET-2. Altogether, my results show how chromatin regulation affects the maintenance of a functional germline through multiple mechanisms.

Mammals have two orthologs, Mll and Trx2, for the Drososphila protein Trithorax (TRX), which is the founding member of the trithorax group (TrxG) of epigenetic regulators. TrxG proteins are characterized by an evolutionary conserved SET domain. A major function of all SET domain- containing proteins is to modulate gene activity, but the underlying mechanisms are poorly understood. Apparently TRX, Mll and Trx2 are histone H3 lysine 4 specific methyltransferases. So far all evidence points to roles in expression of specific target genes. However, target genes and function of the epigenetic regulator Trx2 were still unknown. Homozygous trx2 mutant embryos arrest in development because of severe and widespread defects {Glaser, 2005 #296}. Thus mouse embryonic stem (ES) cells carrying a null mutation of trx2 were used as an alternative model system to address the implication of Trx2 in differentiation. This study showed that Trx2 is redundant for ES cell self-renewal. Homozygous trx2 knockout ES cells did not exhibit cell cycle defects. However, loss of Trx2 resulted in reduced proliferation and increased apoptosis rates in trx2-/- ES cells. Due to the fact that differentiation requires an appropriate rate of population growth, trx2-/- cells were affected adversely upon in vitro differentiation. Neurogeneic differentiation of trx2 mutant cells generated fewer mature neurons than wild type cells. Moreover a temporal delay in the developmental progression to differentiation became apparent. Cardiac differentiation of trx2-/- cells confirmed the developmental defect and temporal delay. Notably differentiation of trx2-/- cells was merely delayed or impaired but it was not absent, implying that Trx2 is not required for gene expression programs specific for neurons or cardiac myocytes. We propose that differentiation of trx2-/- ES cells is impaired because apoptosis is disturbing differentiation. Apart from analyzing the phenotype of trx2 mutant cells, this work was focused on the identification of Trx2 target genes. Oligonucleotide expression arrays were used to identify genes whose expression levels were affected by the absence of Trx2. In general, loss of Trx2 function resulted in more genes with decreased than increased expression levels. This is consistent with the hypothesis that Trx2 functions as a transcriptional activator. Comparison of gene expression profiles for constitutive and conditional trx2 mutant cells enabled a distinction between direct and indirect target genes for Trx2. As a result Magoh2 was identified as the key candidate target gene for Trx2. Interaction between Trx2 and Magoh2 suggested a potential regulatory role for Trx2 in alternative splicing. Furthermore this work provided evidence that Trx2 could be involved in the maintenance of CpG island promoter gene expression, thus providing a potent regulatory mechanism for ubiquitously expressed genes.

No description available.

La Bruton tyrosine kinase ou Btk est une protéine dont le rôle dans la maturation des lymphocytes B est connu depuis plusieurs années. Par contre, son rôle dans le contrôle de l'immunité innée est moins établi. Nous avons montré que, en réponse à la voie des Toll like Receptors ou TLRs, Btk régule la stabilité de l'ARN messager du TNF-α par l'intermédiairede la protéine TTP ou Tristétraproline. Par ailleurs, nous avons montré que l'expression d'un microARN, le miR-346, régulait négativement la protéine Btk et donc la synthèse de TNF-α. L'amplification de l'expression de ce miR-346 par transfection permet d'avoir un effet anti-TNF-α et anti-Btk interessant notamment dans le modèle cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde. Enfin, nous avons montré que, en réponse au TLRs, la modulation de l'expression du TNF-α en fonction de l'état de méthylation de l'ADN et d'acétylation des histones dépendait directement de l'expression du couple miR-346 et Btk. Btk est donc une protéine charnière dans le contrôle de l'inflammation par les mécanismes épigénétiques que sont les miARNs, la méthylation de l'ADN et l'acétylation des histones. Sur le plan thérapeutique, l'inhibition de cette protéine par ces différents mécanismes de régulation semble donc être très interessante, à la fois dans les maladies inflammatoires et néoplasiques.

L’altération de l’environnement périnatal peut impacter à long terme l’expression des gènes notamment par le biais de modifications épigénétiques. Une stratégie pour accroitre la thermotolérance des poulets de chair, sensibles à la chaleur en fin d’élevage (J35) est la thermo-manipulation embryonnaire (TM). Lors d’un coup de chaleur à J35, les modifications d’expression de gènes observées chez les poulets TM pourraient être liées à une altération de l’épigénome induite lors de l’embryogenèse et persistante au cours du développement. Cette thèse s’intéresse à deux modifications post-traductionnelles des histones (MPTH) décrites pour être modulées par des variations thermiques : H3K27Me3 et H3K4Me3. Afin d’étudier ces MPTH sans a priori à J35, nous avons mis au point les techniques d’immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage à haut débit dans deux tissus : l’hypothalamus et le muscle. Nos travaux montrent que le traitement semble impacter principalement l’épigénome de l’hypothalamus, en particulier au niveau de la marque H3K4me3, en modulant des voies liées à la morphogenèse et la réponse hormonale. / Perinatal environment changes may alter gene expression throughout life via epigenetic modifications. A strategy to improve thermal tolerance of heat-sensitive chickens is a thermalmanipulation during embryogenesis (TM). During a heat challenge at the end of the rearing period (D35), modifications of gene expression have been reported in thermally-manipulated chickens. These alterations could be linked to epigenetic modifications induced during the TM that persist throughout life. This work focused on two histone post-translational modifications (HPTM): H3K27me3 and H3K4me3. We adjusted two methods of chromatin immunoprecipitation to conduct a whole genome study of these HPTM at D35, in the hypothalamus and skeletal muscle. We demonstrated that the TM has a major impact in the hypothalamus, especially on H3K4me3. These alterations seem to modulate the hypothalamic morphogenesis and its response to hormones, therefore possibly contributing to better adaptive capacities of TM chickens.

No description available.

La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte progressive des capacités mnésiques et des fonctions cognitives accompagnée du développement de dégénérescences neurofibrillaires (DNFs) et de plaque séniles dans le parenchyme cérébral. La découverte de perturbations épigénétiques dans des cerveaux de patients Alzheimer ont mené la communauté scientifique à se tourner vers de nouvelles voies thérapeutiques. De telles altérations, notamment au niveau de l’acétylation des histones de la chromatine, pourraient rendre compte de dysfonctionnements dans l’expression des programmes génétiques. En utilisant les souris THY-Tau22 (développement progressif de DNFs), nous avons évalué l’efficacité de deux stratégies visant à augmenter l’acétylation des histones : activer les HATs et inhiber les HDACs. Ces deux stratégies permettent une récupération des performances en mémoire spatiale chez les souris THY-Tau22, ouvrant ainsi de nouveaux axes thérapeutiques et de recherches dans la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a progressive loss of memory and cognitive functions associated with the development of neurofibrillary tangles (NFTs) and amyloid plaques in the brain. Nowadays, there is no satisfactory cure for AD. The discovery of epigenetic alterations in AD brain led the scientist community to think about new therapeutic options. Such modifications, and notably those on histone acetylation of the chromatin, could be associated with the genetic dysfunctions observed in AD. The reestablishment of proper epigenetic regulations, and thus gene expression, appears as an original therapeutic option. Using THY-Tau22 mice, we assessed the effect of two strategies aimed at increasing histone acetylation with a HAT activator (CSP-TTK21) or an HDAC inhibitor (phenylbutyrate). We show that both therapeutic strategies allow the rescue of spatial memory performances in the THY-Tau22 mouse model. These results open new leads for AD therapeutics and research.

Les modifications post-traductionnelles des histones jouent un rôle majeur dans la régulation de l’expression de gènes impliqués dans la plasticité et la mémoire. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones permet le maintien de la chromatine dans un état « permissif », accessible pour la transcription. Nos travaux visent à identifier le rôle joué par l’acétylation de deux histones, H3 et H4, dans la formation de différentes formes de mémoire mettant en jeu les systèmes hippocampique et striatal chez la souris. Nous avons également recherché si des perturbations d’acétylation des histones sont responsables des déficits mnésiques observés au cours du vieillissement. Nous avons utilisé deux types d’apprentissage en piscine de Morris permettant de dissocier la mémoire spatiale, impliquant principalement l’hippocampe et la mémoire procédurale/indicée, impliquant le striatum. Nos résultats mettent en lumière une régulation différentielle de l’acétylation des histones dans l’hippocampe et le striatum selon la nature de la tâche et l’âge des animaux. L’apprentissage spatial induit une augmentation de l’acétylation des histones sélectivement dans l’hippocampe (CA1 et gyrus denté) alors que la tâche indicée augmente l’acétylation des histones spécifiquement dans le striatum. Nous montrons également que des changements opposés de l’acétylation de H3 (augmentation) et de H4 (diminution) dans l’hippocampe pourraient contribuer aux déficits de mémoire spatiale observés chez les souris âgées. Lors d’un test de compétition en piscine de Morris, durant lequel les souris ont le choix entre les stratégies spatiale et indicée pour résoudre la tâche, l’injection intra-hippocampique de Trichostatine A (TSA), un inhibiteur des histones déacétylases, immédiatement après l’apprentissage, perturbe la fonction striatale et favorise l’utilisation préférentielle de la stratégie spatiale hippocampique. Cependant, cet effet de la TSA est absent chez les souris âgées dont la fonction hippocampique est altérée. Dans une dernière série d’expérience, l’analyse des effets d’une injection intra-hippocampique de TSA, après un apprentissage spatial, a permis de préciser les contributions respectives des histones H3/H4 et du facteur de transcription CREB dans les déficits mnésiques associés au vieillissement. Dans leur ensemble, nos travaux apportent des éléments importants concernant l’importance de l’acétylation des histones dans la modulation des interactions entre systèmes de mémoire hippocampique et striatal. / Post-translational modifications of histone proteins play a crucial role in regulating plasticity and memory-related gene expression. Among these modifications, histone acetylation leads to a relaxed or “opened” chromatin state, permissive for transcription. Our work aims to identify the role played by histone H3 and H4 acetylation in the formation of different forms of memory involving hippocampal and striatal systems in mice. We also examined whether alterations of histone acetylation are responsible for age-associated memory deficits. We used two versions of the Morris water maze learning task to dissociate a spatial form of memory that relies on the hippocampus and a procedural/cued memory supported by the striatum. Our results highlight a differential regulation of histone acetylation within the hippocampus and striatum depending on the nature of the task and age of animals. Spatial and cued learning elicited histone acetylation selectively in the hippocampus (CA1 region and dentate gyrus) and the striatum, respectively. Age-related spatial memory deficits were associated with opposite changes in H3 acetylation (increase) and H4 (decrease) selectively in the hippocampus. During a water maze competition task in which mice can choose between spatial and cue-guided strategies, intra-hippocampal injection of Trichostatin A (TSA), an histone deacetylase inhibitor, immediately post-acquisition, impaired striatal function and promoted the use of a hippocampus-based spatial strategy. However, this effect of TSA was absent in old mice in which hippocampal function is impaired. In a final series of experiments, analysis of the effects of intra-hippocampal TSA injection immediately after a spatial training helped to clarify the respective contributions of histone H3/H4 and the transcription factor CREB in spatial memory deficits associated with aging. Taken together, our work provides important information regarding the importance of histone acetylation in modulating interactions between hippocampal and striatal memory systems.