Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:37:40Z No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:37:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T17:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ludmila de Faro Valverde Via hedgehog....pdf: 1435521 bytes, checksum: 2442c32fdacd9e814b9e8a6035eb3bdc (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO/OBJETIVO: O Carcinoma Escamocelular de Boca (CEB) corresponde a mais de 95% dos casos de câncer diagnosticados na cavidade bucal e consiste numa neoplasia invasiva e agressiva. Sabendo-se que a via Hedgehog (HH) está envolvida na patogênese de diversos tumores, o presente trabalho propôs-se a avaliar a expressão de componentes desta via em CEB, associando a expressão destas moléculas com aspectos clínicos, angiogênese, graus de diferenciação tumoral, potencial proliferativo e macrófagos CD163+. MATERIAL E MÉTODOS: Vinte e oito casos de CEB, 9 casos de margens tumorais (MAT) e 4 casos de mucosa bucal não neoplásica (MNN) foram submetidos à reação imuno-histoquímica para as proteínas MCM3, SHH, IHH, GLI1, CD163 e CD105 utilizando o sistema polimérico AdvanceTM. A co-localização das proteínas IHH/CD163 e GLI1/CD105 foi avaliada através de dupla marcação imuno-histoquímica. As análises das proteínas MCM3, SHH, IHH e GLI1 foram realizadas em 5 áreas coincidentes de cada caso, de acordo com os parâmetros semi-quantitativos descritos por Gurgel et al. (2008). A densidade de macrófagos (DM) e microdensidade vascular (MDV) foram mensuradas considerando-se a população destas células e vasos neoformados em 5 áreas e os resultados expressos em cel/mm² e vasos/mm². A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism versão 6.03. RESULTADOS: Todos os casos de CEB foram positivos para a proteína MCM3, em citoplasma e núcleo de células do parênquima tumoral, sendo o escore 4+ predominante (n=19; 67,85%). Em parênquima tumoral, a proteína SHH estava presente no citoplasma de células neoplásicas e foi positiva em 25 casos (89,28%) de CEB, sendo o escore 4+ predominante (n=17; 68%). Vinte e dois casos (78,57%) apresentaram marcação citoplasmática da proteína IHH no parênquima tumoral, predominando os escores 4+ (n=7; 31,82%) e 3+ (n=7; 31,82%). A proteína GLI1 apresentou marcação citoplasmática e nuclear em 24 (85,72%) casos de CEB, predominando, no parênquima do tumor, o escore 4+ (n=15; 62,5%). Vinte e três casos de CEB (82,14%) apresentaram imunoexpressão de CD163, enquanto 24 (85,72%) exibiram positividade para a proteína CD105. Foi observada uma tendência de maior imunoexpressão de SHH e IHH nos grupos com alto perfil proliferativo. Foi observada uma tendência de maior expressão das proteínas MCM3 (p=0.11), SHH (p=0.21) e IHH (p=0.07) em tumores menos diferenciados. Uma forte correlação positiva foi observada entre a DM e a MDV em CEBs e correlação positiva perfeita em MATs. Quando comparado à MAT e MNN, os casos de CEB apresentaram maior imunoexpressão de MCM3 (p=0.0003), SHH (p=0.01), IHH (p=0.39), GLI1 (p=0.03), DM (p=0.0002) e MDV (p=0.0002). CONCLUSÕES: Nossos resultados sugerem a participação da via HH em CEBs, através de uma sinalização autócrina e parácrina e com participação de ambos ligantes, SHH e IHH, os quais parecem contribuir para a proliferação e diferenciação do CEB. Demonstramos que células endoteliais também exibem positividade para componentes da via HH e que essas moléculas podem contribuir na angiogênese tumoral, ao mesmo tempo que macrófagos CD163+ expressam IHH, ligante da via, e estão associados com a neo-vascularização tumoral. Em adição, nossos achados sugerem que a proteína MCM3 pode despontar como um bom marcador de proliferação celular em CEB. / INTRODUCTION/OBJETIVE: The Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) accounts for over 95% of all cancers diagnosed in the oral cavity and it consists on an invasive and aggressive type of tumor. The Hedgehog pathway (HH) has been involved in the pathogenesis of different tumors. The aim of this study was to evaluate the components of the HH pathway in OSCC, correlating the results with clinical aspects, angiogenesis, tumor differentiation, proliferative potential and macrophages CD163+. MATERIAL AND METHODS: Twenty-eight cases of OSCC, 9 cases of tumor margins (TM) and 4 cases of non-neoplastic oral mucosa (NNM) were submitted to immunohistochemical reaction for MCM3, SHH, IHH, GLI1, CD163 and CD105 proteins using the AdvanceTM polymer system. Co-localization for IHH/GLI1 and CD163/CD105 proteins was evaluated using double staining method. The analysis of MCM3, SHH, IHH and GLI1 proteins were conducted in 5-matching areas and data described using the semi-quantitative parameters described by Gurgel et al. (2008). The density of macrophages (MD) and microvessel density (MVD) were measured considering the population of these cells and newly formed vessels in 5-matching areas and the results expressed in cells/mm² and vessels/mm², respectively. Statistical analysis were performed using GraphPad Prism v. 6.03. RESULTS: All cases of OSCC were positive for MCM3 protein on the cytoplasm and nucleus of tumor cells, and 4+ was the main score (n= 19; 67.85%). In tumor cells, the SHH protein was observed in the cytoplasm and it was positive in 25 OSCC cases (89.28%), with a 4+ score predominant (n= 17; 68%). Twenty-two cases (78.57%) presented with cytoplasmic IHH protein in tumor cells and scores 4+ (n=7; 31.82%) and 3+ (n=7; 31.82%) were more common. The GLI1 protein was positive in 24 OSCC cases (85.72%) and detected in tumor cells on cytoplasmic and nuclear patterns, with score 4+ (n=15; 62.5%). Positive staining for CD163 and CD105 were described in 23 (82.14%) and 24 OSCC, respectively. In groups with high proliferative profile, we observed a larger amount of SHH and IHH proteins. In addition, on OSCC with a lower differentiation, we observed a tendency to increased levels of MCM3 (p=0.11), SHH (p=0.21) and IHH (p=0.07) proteins. A strong and a perfect positive correlation was observed between MD and the MVD in OSCC and TMs, respectively. A higher expression of MCM3 (p=0.0003), SHH (p=0.01), IHH (p=0.39), GLI1 (p=0.03), MD (p=0.0002) and MVD (p=0.0002) were founded in OSCC by comparing to TM and NNM. CONCLUSIONS: Our results suggest that the HH pathway may participate in OSCC through an autocrine and paracrine mechanisms, with parcipation of both ligands, SHH and IHH. These ligands seem to contribute to the proliferation and differentiation of the OSCC. We demonstrate that endothelial cells also display positivity for HH pathway components, which may contribute to the tumor angiogenesis. Moreover, CD163+ macrophages are positives for IHH ligand and highly associated with tumor-vessels. Additionally, our findings suggest that MCM3 protein could emerge as a good marker for cell proliferation in OSCC.

A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii que acomete seres humanos e animais, principalmente os gatos. Desde 1998 o Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz no Rio de Janeiro vem acompanhando uma epidemia dessa doença envolvendo seres humanos, cães e gatos, onde as principais formas de transmissão são arranhadura, mordedura e/ou contato com o exsudato das lesões cutâneas de gatos doentes. O diagnóstico definitivo da esporotricose felina é obtido a partir do isolamento do Sporothrix sp. em meios de cultura, entretanto, o resultado desse exame pode demorar até quatro semanas, o que em algumas situações pode retardar o início do tratamento antifúngico. Os exames citopatológico, histológico e imuno-histoquímico são opções viáveis e mais rápidas para o diagnóstico dessa micose em gatos, principalmente em situações quando não é possível realizar o isolamento fúngico. O diagnóstico precoce da esporotricose felina é importante na implementação rápida do tratamento antifúngico, melhorando o prognóstico na maioria dos casos. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar as diferentes técnicas utilizadas no diagnóstico da esporotricose felina antes e durante o tratamento antifúngico. Na primeira etapa do estudo foram comparados os exames citopatológico (coloração pelo método panótico rápido), histológico (impregnação pela prata de Grocott) e imuno-histoquímico de 184 gatos no diagnóstico da esporotricose sem tratamento antifúngico prévio utilizando o cultivo fúngico como teste padrão de referência. Estruturas leveduriformes foram observadas em 160 (87,0%) casos no exame citopatológico, 168 (91,3%) na histopatologia e 163 (88,3%) na imunohistoquímica. A associação das três técnicas elevou a sensibilidade do diagnóstico para 98,3%, o que enfatiza a necessidade de sua implementação como ferramentas de rotina, sobretudo quando a cultura fúngica não está disponível. Na etapa seguinte, a carga parasitária e o isolamento de Sporothrix sp. das lesões cutâneas de 74 gatos foram avaliados mensalmente antes e durante o tratamento com itraconazol por um período de 12 semanas. A mediana da carga fúngica observada antes do início do tratamento antifúngico foi maior (pMW = 0,013) nos gatos nos quais foi observada a persistência da lesão (Med=98,6) em relação aqueles em que houve cicatrização (Med=15,0). A redução da carga fúngica ocorreu em todas as lesões estudadas, assim como a redução da positividade da cultura fúngica e do exame citopatológico. Estes resultados sugerem uma redução no potencial zoonótico dos gatos, enfatizando a importância do tratamento precoce como medida de controle. Adicionalmente, o isolamento do fungo e a presença de estruturas leveduriformes nas lesões de gatos com esporotricose podem ser fatores preditores da falência terapêutica, indicando a necessidade da implementação de alternativas terapêuticas. / Sporotrichosis is subcutaneous mycose caused by species of fungus from the Sporothrix schenckii complex and affects humans and animals, especially cats. Since 1998, the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz in Rio de Janeiro has been describing in Rio de Janeiro an epidemic of sporotrichosis, involving humans, cats and dogs, with most of cases related to transmission through scratches, bites or contact with lesions from infected cats. The definitive diagnosis is based on the isolation of the fungus in culture; however, the results may take up to four weeks and postpone treatment outset. The cytopathology, histopathology and immunohistochemistry should be considered as rapid and accessible alternatives for the diagnosis in cats, especially when the fungal culture is not available. The early diagnosis of feline sporotrichosis is desirable for the prompt beginning of the antifungal treatment, improving the prognosis in most of the cases. The aim of this study was to evaluate and compare different techniques for the diagnosis of feline sporotrichosis before and during the treatment with itraconazol. In the first part of the study, cytopathological (Quick Panoptic), histopathological (Grocott silver stain) and immunohistochemical examinations were compared regarding the diagnosis of sporotrichosis in 184 cats without previous treatment, by using fungal culture as a reference standard. The yeast-like cells were observed in 160 (87.0%) cases by cytopathological examination, in 168 (91.3%) by histopathology and in 163 (88.3%) by immunohistochemistry. The combination of the three methods led to the diagnosis of 98.3% of cases, pointing to the need of their implementation as regular tools, notably when fungal culture is not available. In the second part of the study, the fungal burden and the isolation of Sporothrix sp. in cutaneous lesions of 74 cats were monthly evaluated before and during the treatment with itraconazole for twelve weeks. The median of the fungal load detected before the outse of the antifungal treatment was higher (pMW=0.013) in cats in which there was a persistence of the cutaneous lesion (Med=98.6) in comparison to those in which healing of the lesion was observed (Med=15.0). The decrease of the fungal burden occurred in all the lesions in this study as well as the reduction of the positivity of the fungal culture and the cytopathological examination. These results suggest a reduction in the zoonotic potential of cats and emphasize the importance of the early treatment as a control measure. In addition, the isolation of the fungus and the presence of yeast-like cells in lesions of cats with sporotrichosis during the treatment can be a predictor of treatment failure and should alert for the need of alternative therapeutic regimens.

Introdução: Proteínas da Superfamília do fator transformador de crescimento β (TGF-β) estão implicadas na regulação de diversas funções biológicas. Embora alguns estudos revelaram a sua presença no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose, a sua função na etiopatogenia da doença permanece pouco conhecida. Objetivo: o estudo visa comparar a expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose com o endométrio tópico de pacientes sem essa condição. Método: Estudo de caso-controle utilizando imuno-histoquímica em amostras uterinas (blocos de parafina) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A amostra contém 28 casos de adenomiose e 21 controles. Resultados: Não encontramos associação entre tabagismo e adenomiose (P = 0,75), abortos e adenomiose (P = 0,29), gestações e adenomiose (P = 0,85), curetagens e adenomiose (P = 0,81), dor pélvica e adenomiose (P = 0,72) e presença de mioma e adenomiose (P = 0,15). Além disso encontramos relação entre sangramento uterino anormal (SUA) e adenomiose (P = 0,02) e cesarianas prévias e adenomiose (P = 0,02) . A expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 no endométrio ectópico de portadoras de adenomiose não teve diferença significativa quando comparado com a expressão dessa proteína no endométrio tópico de pacientes sem adenomiose (P = 0,86). Conclusão: Nosso estudo foi um dos primeiros a comparar a expressão de TGF-β1 no endométrio de pacientes com e sem adenomiose. Em nossa análise não obtivemos diferença significativa entre os grupos, resultado diferente do encontrado em outros dois estudos. Mais estudos são necessários para investigar o papel da superfamília TGF no desenvolvimento e manutenção da adenomiose. / Background: Proteins of transforming growth factor β superfamily (TGF-β) are implicated in the regulation of various biological functions. Although some studies have revealed their presence in ectopic endometrium of women with adenomyosis, their role in the pathogenesis of the disease remains largely unknown. Objective: The study aims to compare the immunohistochemical expression of TGF- β1 in ectopic endometrium of women with adenomyosis with the topic endometrium of patients without this condition. Methods: Casecontrol study using immunohistochemistry in uterine samples (paraffin blocks) obteined from Hospital de Clínicas de Porto Alegre. The sample contained 28 adenomyosis cases and 21 controls. Results: We found no significant difference between smoking and adenomyosis (P = 0.75), abortions and adenomyosis (P = 0.29), pregnancies and adenomyosis (P = 0.85), curettage and adenomyosis (P = 0.81), pelvic pain and adenomyosis (P = 0.72) and presence of myoma and adenomyosis (P = 0.15). We did find a relationship between adenomyosis and abnormal uterine bleeding (AUB) (P = 0.02) and previous cesarean section and adenomyosis (P = 0.02). Immunohistochemical expression of TGF-β1 in ectopic endometrium of women with adenomyosis did not have significant difference when compared with the expression of this protein in the topic endometrium of patients without adenomyosis (P = 0.86). Conclusion: Our study was one of the first to compare the TGF-β1 expression in the endometrium of patients with and without adenomyosis. In our analysis we have not had significant difference between the groups, unlike observed in two other studies. More studies are needed to investigate the role of TGF superfamily in the development and maintenance of adenomyosis.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.

Rhodococcus equi é um importante patógeno bacteriano em medicina veterinária, associado, sobretudo, a pneumonias piogranulomatosas em potros no primeiro semestre de vida. São descritos neste trabalho vinte casos de infecção por R. equi em potros recebidos para necropsia no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul entre janeiro de 1997 e janeiro de 2013. Os históricos clínicos obtidos com os veterinários apresentaram grande variabilidade e, mesmo os sinais clássicos de comprometimento respiratório e febre só foram vistos em metade dos casos. Os dados obtidos em uma visita a uma propriedade demonstram que a superpopulação de potros e a introdução de fêmeas no grupo de parição contribuíram para a ocorrência de um surto. Exames de necropsia e de histologia revelaram que pneumonia piogranulomatosa multifocal foi a forma de apresentação mais constante (dezenove casos), seguida por linfadenite piogranulomatosa (dez casos) e tiflocolite piogranulomatosa e ulcerativa (cinco casos). Três animais apresentaram osteomielite piogranuloamatosa, dos quais, dois em vértebras. Uveítes e polissinovites assépticas foram constatadas em três casos. Exame imuno-histoquímco anti-Rhodococcus equi revelou-se positivo em todos os pulmões com lesões, embora os linfonodos tenham sido positivos em apenas três das nove amostras testadas. O exame bacteriológico das amostras de necropsia foi positivo em quinze casos clínicos, assim como em uma amostra de solo da propriedade visitada. O exame de reação da polimerase em cadeia (PCR) revelou o gene de virulência VapA de R. equi em todos os isolados clínicos, mas não na amostra de solo. Adicionalmente os pulmões foram testados por imuno-histoquímica para Pneumocystis sp.e apresentaram marcação em treze dos vinte casos. / Rhodococcus equi is an important bacterial pathogen in veterinary medicine, especially associated with piogranulomatous pneumonia in foals under six months of age. Twenty cases of R. equi infection in foals received for necropsy at the Pathology Veterinary Sector (SPV) of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS) between January 1997 and January 2013 are described in this paper. Clinical history obtained with veterinary practitioners presented high variability, and even classical respiratory signs and fever were only observed in half of the cases. Data collected in an investigative visiting to a breeding farm showed that the foal superpopulation and the introduction of females to the parturition group contributed to the occurrence of an outbreak. Necropsy and histologic examinations revealed that multifocal piogranulomatous pneumonia was the most constant presentation (nineteen cases), followed by piogranulomatous lymphadenitis (ten cases) and piogranulomatous and ulcerative typhlocolitis (five cases). Three animals presented piogranulomatous osteomyelitis, two of them in vertebrae. Aseptic uveitis and polisynovitis were verified in three cases. Anti-Rhodococcus equi immunohistochemical examination stained positive in all lungs containing lesions, although lymphnodes have stained positive in only three of nine samples tested. Bacteriologic examination of the necropsy samples was positive in fifteen cases and in a soil sample from the visited breeding farm. Polymerase chain reaction (PCR) test revealed the VapA virulence factor of R.equi in all clinical isolates, but not in the soil sample. Additionally, the lungs were tested to the presence of Pneumocystis sp. by immunohistochemistry, and stained positive in thirteen of twenty cases.

Objetivo: avaliar a concordância da expressão imuno-histoquímica (IMH) da proteína p53 (p53) na amostra endometrial e na peça cirúrgica de histerectomia, associando-a a fatores como tipo histológico, grau tumoral e estadiamento, bem como analisar a concordância interobservador para expressão e intensidade de expressão da p53 entre biópsia diagnóstica e peça cirúrgica. Métodos: estudo transversal retrospectivo, no qual foram incluídas pacientes com carcinoma endometrial submetidas à biópsia de endométrio e tratamento cirúrgico primário na Unidade de Oncologia Genital do HCPA. As lâminas foram lidas por dois patologistas. O percentual de expressão da p53 foi avaliado em três categorias (<10%, 10-50% e >50%). A intensidade foi avaliada como fraca, média ou forte. Foram extraídos dados do prontuário eletrônico das pacientes. A concordância foi avaliada através do coeficiente Kappa ponderado. Resultados: 72 pacientes foram incluídas, com idade média de 65,5 anos. O percentual de expressão da p53 entre biópsia e peça cirúrgica apresentou uma taxa de concordância de 70,8%, com um índice de Kappa ponderado de 0,64 e a intensidade de expressão apresentou uma taxa de concordância de 69,4%, com Kappa ponderado de 0,65. A avaliação da concordância do percentual de expressão da p53 conforme tipo histológico e grau tumoral apresentou coeficientes de Kappa ponderado de 0,64 e 0,72, nos carcinomas não endometrioides e G3, respectivamente. Tais dados, com diferença estatística significativa. A concordância interobservador para a expressão e intensidade da p53 na biópsia apresentou índices de Kappa 9 ponderado de 0,77 e 0,75, respectivamente. Na peça cirúrgica, os índices de kappa ponderado foram de 0,85 e 0,88, para a expressão e intensidade, respectivamente. Conclusões: as taxas de concordância para a expressão e intensidade de expressão IMH da p53 entre biópsia endometrial e peça cirúrgica foram boas, podendo ser útil em tempo pré-operatório, para a seleção de pacientes candidatas a uma cirurgia mais extensa, principalmente quando os dados anatomopatológicos da biópsia forem insuficientes para tal decisão. Devemos, no entanto, levar em consideração que existem muitos outros marcadores moleculares para a neoplasia endometrial, sendo provável futuramente o estudo da concordância deles em associação ao da p53. / Objective: To evaluate the agreement of the immunohistochemical (IMH) expression of the p53 protein (p53) in preoperative endometrial tissues and in surgical specimens obtained during hysterectomy, to determine the association of this agreement with factors such as histological type, tumor grade and stage and to evaluate interobserver agreement for the expression and intensity of p53 between the diagnostic biopsy and the surgical specimen. Methods: Retrospective cross-sectional study. Patients with endometrial carcinoma who submitted to endometrial biopsy and primary surgical treatment at the HCPA Genital Oncology Unit were included. The slides were assessed by two pathologists. The percentage of p53 expression was evaluated and categorized into one of three groups (<10%, 10-50% and >50%). The intensity was evaluated as weak, medium or strong. The agreement was assessed by the weighted Kappa coefficient. Results: 72 patients with a mean age of 65.5 years were included. The percentage of p53 expression between the biopsy and the surgical specimen presented an agreement rate of 70.8%, with a weighted Kappa index of 0.64. The intensity of expression had an agreement rate of 69.4% with a weighted Kappa of 0.65. When evaluated according to histological type and tumor grade, the agreement for p53 expression showed weighted Kappa indexes of 0.64 and 0.72 in non-endometrioid and G3 carcinomas, respectively (p<0.001). With respect to the biopsy, the interobserver agreement for the expression and intensity of p53 had weighted Kappa indexes of 0.77 and 0.75, respectively. With respect to the surgical specimen, the weighted Kappa indexes were 0.85 and 0.88 for expression and intensity, respectively. 11 Conclusions: This study found good agreement rates for the expression and intensity of p53 IMH expression between the endometrial biopsy specimen and the surgical specimen, which may be useful in a preoperative setting for the selection of patients who are candidates for more extensive surgery, especially when anatomopathological biopsy data are insufficient for such a decision.

INTRODUÇÃO: Carcinomas de mama triplo-negativos (CMTN) constituem um grupo de tumores heterogêneos caracterizados por sobrevida pobre dos pacientes e falta de terapia-alvo. Receptor andrógeno (AR) tem sido descrito no CMTN, mas o impacto prognóstico da expressão nesse subgrupo não está bem claro. OBJETIVO: Investigar a associação do status de expressão AR analisado por imunohistoquímica em casos de CMTN com parâmetros clínicos (idade, sobrevida) e variáveis patológicas (tamanho do tumor, grau do tumor). MÉTODOS: Foram analisados 62 CMTN por imuno-histoquímica automatizada para receptor andrógeno. A imuno-histoquímica foi avaliada por dois diferentes patologistas e a expressão do biomarcador foi avaliada por H-Score (intensidade mais percentagem de coloração). Kaplan-Meyer foi o método usado para avaliar a sobrevida global, tendo as diferenças nas distribuições sido avaliadas com base na expressão do marcador. RESULTADOS: 26% dos CMTNs foram AR positivos (n = 16) e 74% AR negativos (n = 46). Todos os casos de AR positivos ocorreram em mulheres ≥ 40 anos enquanto 13% dos casos de AR negativos foram vistos em mulheres ≤ 40 anos. 93% (52/56) de todos os CMTNs foram carcinoma ductal invasivo do tipo não especial (ICNST) e 93% (14/15) de AR positivos dos casos de ICNST. O tamanho do tumor variou de 2 a 4,9 cm na maioria dos cânceres AR positivos (n = 8/13; 62%). 60% (n = 9/15) dos casos de AR positivos mostraram grau histológico 3 seguidos de 27% de tumores de grau 2. Não se observou diferença entre pacientes AR positivos e AR negativos quando comparados por idade, tamanho do tumor, grau do tumor e tipo do tumor (p > 0,17). A positividade imuno-histoquímica para ARs também não foi associada com melhor sobrevida (p = 0,737; n = 51) ou sobrevida livre da doença (p = 0,552; n = 45) em CMTNs. CONCLUSÃO: Sob o ponto de vista do prognóstico, a imunorreatividade do AR tem sido associada com melhor sobrevida das pacientes. Esse resultado não foi confirmado na presente série. Isso poderia estar relacionado com o pequeno tamanho amostral ou com uma baixa prevalência de casos de AR positivos especificamente nesse subtipo de câncer de mama. Estudos realizados com maiores amostras são necessários para investigar esse biomarcador em CMTNs. / INTRODUCTION: Triple negative breast carcinomas (TNBC) are a heterogeneous group of tumors characterized by poor patient survival and lack of targeted therapies. Androgen receptor (AR) has been described in TNBC but the prognostic impact of the expression in this subgroup of tumors is not clear. OBJECTIVE: To investigate the association of AR expression status by immunohistochemistry in TNBC cases with clinical (age, survival) and pathological variables (tumor size, tumor grade). METHODS: 62 TNBC were analyzed by automated immunohistochemistry for androgen receptor. Immunohistochemistry was scored by two investigators and biomarker expression was assessed by H-Score (intensity plus the percentage of staining). Kaplan-Meier was used to evaluate overall survival, where differences in distributions were evaluated based on marker expression. RESULTS: 26% of TNBC were AR-positive (n = 16) and 74% AR negative (n = 46). All AR-positive cases occurred in women ≥ 40 years, while 13% of AR-negative cases were seen in women ≤ 40 years. 93% (52/56) of all TNBC were infiltrating ductal carcinomas of no special type (ICNST) and 14/15 (93%) of AR-positive cases were ICNST. Tumor size varied from 2-4.9 cm in the majority of AR-positive cancers (n = 8/13; 62%). 60% (n = 9/15) of AR-positive cases showed histological grade 3 tumors, followed by 27% of grade 2 tumors. No differences were observed between AR-positive and AR-negative patients when compared for age, tumor size, tumor grade and tumor type (all p > 0.17). AR immunohistochemical positivity was also not associated with better overall survival (p = 0.737, n = 51) or disease-free survival (p = 0.552; n = 45) in TNBCs. CONCLUSION: From the prognostic point of view, AR immunoreactivity has been associated with better overall patient survival. Unfortunately, this result could not be confirmed in our series. This could be related to the relatively small series of analyzed samples and to the low prevalence of AR-positive cases in this specific breast cancer subtype. Further studies with bigger samples are needed to investigate this biomarker in TNBC.

The aim of this study was to analyze the expression of interferon-gamma (INF-&#947;) in gingival biopsies from shallow and deep sites in patients with severe chronic periodontitis. The secondary objective was to correlate the expression of INF-&#947; in the gingival crevicular fluid (GCF) with sites where the gingival biopsies were collected. Biopsies from 22 patients with chronic generalized or localized severe periodontitis (mean age 45.5 SD 8.9 years), 22 deep and 18 shallow sites were collected. The control group consisted of 14 patients clinically healthy (mean age 39.35 SD 16.5 years). In total, 54 biopsies were collected from 36 patients. The GCF samples were collected from some of the same sites where biopsies were performed, totaling 12 deep sites, 8 shallow sites and 4 control sites. Clinical evaluation parameters including probing pocket depth (PPD), clinical attachment level (CAL), visible plaque index (VPI) and gingival bleeding index (GBI) were used. The tissue was removed with a 2 mm of diameter punch, in the surgery area (control group) or in the subgingival scaling with or without surgical access (test group) and stored in an Eppendorff with 1 ml of 10% formaldehyde for subsequent morphological and immunohistochemical analysis. The intensity of staining was evaluated semi - quantitatively in the epithelial cells, plasma cells, macrophages, fibroblasts and endothelial cells, considering strong staining (score 2), weak staining (score 1) or absence of staining (score 0). The Kruskal-Wallis test was used to compare the expression of INF-&#947; in epithelial and connective tissues between the three groups (shallow and deep sites of periodontitis and control sites). We observed a trend for a similar pattern of staining in the shallow and deep sites, with a predominance of weak staining in deep sites. In control sites the staining of the epithelium was predominant. However, we could not demonstrate statistically significant differences between the expression of INF-&#947; in epithelial and connective tissues in the groups that were analyzed. The Spearman correlation analysis showed a strong correlation between the immunohistochemical expression of INF-&#947; in the epithelium with macrophages, fibroblasts and endothelial cells (r &#8805; 0.6 and p &#8804; 0.01). There was no correlation with the expression of INF-&#947; in the epithelial and connective tissues with the clinical data and with the GCF. We conclude that there were no differences in the expression of INF-&#947; in gingival biopsies in shallow and deep sites of pacients with periodontitis compared to healthy subjects, which may be attributed to the biphasic character of INF-&#947;. The low detection of INF-&#947; in the GCF, within the limitations of the study, may suggest that the GCF may not be the election method for detection of INF-&#947;. / O objetivo desse estudo foi analisar a expressão do interferon-gamma (INF-&#61543;) em biópsias gengivais de sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa. O objetivo secundário foi correlacionar a expressão do INF-&#61543; no fluido gengival com os sítios onde foram coletadas as biópsias gengivais. Foram coletadas biópsias de 22 pacientes portadores de periodontite crônica generalizada ou localizada severas (idade média 45,5 &#61617; DP 8,9 anos), sendo 22 sítios profundos e 18 sítios rasos. O grupo controle foi composto por 14 pacientes clinicamente saudáveis (idade média 39,35 &#61617; DP 16,5 anos). No total, foram 54 biópsias coletadas de 36 pacientes. As amostras do fluido gengival foram coletadas de alguns dos mesmos sítios de onde foram realizadas as biópsias, totalizando 12 sítios profundos, 8 sítios rasos e 4 sítios controle. Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB); nível de inserção clínica (NIC); índice de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival (ISG). O tecido foi removido com punch de 2 mm de diâmetro, na área cirúrgica (grupo controle) ou na consulta para raspagem subgengival com ou sem acesso cirúrgico (grupo teste) e armazenados em Eppendorffs com 1 ml de solução de formaldeído a 10% para posterior análise morfológica e imuno-histoquímica. A intensidade da marcação do INF-&#61543; foi avaliada semiquantitativamente nas células epiteliais, plasmócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais, considerando-se marcação forte (escore 2), marcação fraca (escore 1) ou ausência de marcação (escore 0). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar a expressão do INF-&#61543; nos tecidos epitelial e conjuntivo, entre os três grupos (sítios profundos e rasos da periodontite e sítios controle). Observamos uma tendência a um padrão de marcação similar nos sítios rasos e profundos, com predomínio de marcação fraca nos sítios profundos. Nos sítios controle a marcação do epitélio demonstrou ser predominante. Porém, não foi possível demonstrar diferenças estatisticamente significativas entre a expressão do INF-&#61543; nos tecidos epitelial e conjuntivo nos grupos analisados. A análise da correlação de Spearman revelou uma forte correlação entre a expressão imuno-histoquímica do INF-&#61543; no epitélio com macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (r &#8805; 0,6 e p &#8804; 0,01). A expressão do INF-&#61543; nos tecidos demostrou não ter correlação significante com os dados clínicos apresentados e com o fluido gengival. Concluímos que não foi possível observar diferenças na expressão do INF-&#61543; em biópsias gengivais nos sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite quando comparados à indivíduos saudáveis, o que pode ser atribuído ao caráter bifásico do INF-&#61543;. A baixa detecção do INF-&#61543; no fluido gengival, dentro das limitações do estudo, pode sugerir que este talvez não seja o método de eleição para a detecção do INF-Y.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-08T20:33:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Gabriela Tonini Peterle.pdf: 1720247 bytes, checksum: f69ebeacd96de38d131c0f8171f8ed62 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-05-17T13:49:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Gabriela Tonini Peterle.pdf: 1720247 bytes, checksum: f69ebeacd96de38d131c0f8171f8ed62 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T13:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Gabriela Tonini Peterle.pdf: 1720247 bytes, checksum: f69ebeacd96de38d131c0f8171f8ed62 (MD5) / CNPQ / O carcinoma epidermoide de cavidade oral (CEC oral) é uma causa significativa de mortalidade e morbidade e está relacionado, principalmente, ao uso do álcool e tabaco. Alguns marcadores genéticos de resposta ao tratamento e evolução clínica já foram identificados para esse carcinoma, como a HIF1α, a qual promove a transcrição de genes como CA-IX, PAI-1 e VEGF envolvidos na resposta celular à depleção de oxigênio. Com o intuito de observar as influências de algumas proteínas da via de hipóxia nas características clinicopatológicas e no prognóstico dos pacientes, bem como observar a atuação dos constituintes do tabaco no mecanismo de hipóxia, foi realizada uma análise semi-quantitativa de 52 pacientes com CEC oral, por meio de imuno-histoquímica, sendo os cálculos e gráficos estatísticos feitos através do software Epi Info® v3.4.3, 2007. A frequência de positividade da expressão CA-IX confirmou a existência de diferenças biológicas entre as expressões negativa e positiva da proteína (p=0,027). Desta forma, a expressão citoplasmática positiva mostrou uma relação significante com a ocorrência de linfonodos acometidos (p=0,025) e a expressão membranar negativa de CA-IX foi predominante nos casos com o infiltrado inflamatório intenso (p=0,044). Em relação às curvas de sobrevida, as expressões positivas fraca e forte de CA-IX membranar mostraram significância referente à Sobrevida Livre de Doença Local (LDL) (p=0,038); já as expressões citoplasmáticas negativa e positiva da proteína apresentaram significância para a Sobrevida Doença Específica (DE) (p=0,022). A análise multivariada confirmou a expressão citoplasmática de CA-IX como um fator de risco para a ocorrência de óbito doença específica, aumentando esse risco em aproximadamente 3x (HR=2,84; IC= 1,02-7,87). Em relação ao PAI-1, o nível da expressão citoplasmática da proteína mostrou relação significante com o grau de diferenciação tumoral (p=0,027) e as expressões citoplasmáticas e membranares positivas apresentaram associação com o infiltrado inflamatório moderado (p=0,013; p=0,033, respectivamente). Já para o prognóstico, as expressões membranares negativa e positiva de PAI-1 apresentaram uma associação significante com a recidiva local (p=0,027) e a análise multivariada confirmou a expressão membranar positiva da proteína como um fator de risco para a ocorrência de tal recidiva, aumentando esse risco em aproximadamente 14x (OR=14,49; IC= 1,40-150,01). O grau de diferenciação tumoral também foi significantemente associado com as expressões citoplasmáticas negativa e positiva de VEGF (p=0,035) e foi observada uma relação entre a presença do infiltrado inflamatório e as expressões positivas fraca e forte da proteína (p=0,038). Por fim, não foram encontradas significâncias estatísticas entre o hábito tabagista e as expressões de CA-IX, PAI-1 e VEGF, no entanto, acredita-se que este resultado seja decorrente da composição da casuística do trabalho. Assim, a busca de biomarcadores para o CEC oral é um desafio que deve ser assumido por grupos de pesquisas que trabalham com a doença, com o intuito de elucidar mecanismos da gênese tumoral que ainda não foram compreendidos. / Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is a significant cause of mortality and morbidity and is mainly related to the use of alcohol and tobacco. Some genetic markers of treatment response and clinical evolution have been identified for this carcinoma, such as HIF1α, which promotes transcription of more than 100 genes involved in cell hypoxia response, among these: CA IX, PAI-1 and VEGF. In order to observe the influence of these proteins in tumor clinicopathological and prognostic features, as well as observe the activity of the constituents of tobacco in hypoxic mechanism, a semi-quantitative analysis of 52 patients with oral cancer was performed, by means of immunohistochemistry, being the statistical calculations and graphics performed by Epi Info® v3.4.3, 2007. The frequency of CA-IX positive expression confirmed the existence of biological differences between the negative and positive expressions of protein (p=0.027). Furthermore, the cytoplasmic positive expression showed a significant relationship with the occurrence of regional lymph node metastases (p=0.025) and CA-IX membrane negative expression was predominant in cases with intense inflammatory infiltrate (p=0.044). Regarding to the survival curves, the CA-IX weak and strong expression of membrane showed significance with respect to the Local Disease-Free Survival (p=0.038), whereas positive and negative cytoplasmic protein expressions were significant for Disease Specific Survival (p=0.022). Multivariate analysis confirmed the cytoplasmic CA-IX expression as a risk factor for the occurrence of disease specific death, with approximately 3-fold increased risk (HR=2.84, CI=1.02-7.87). The cytoplasmic expression level of PAI-1 showed significant correlation with the degree of tumor differentiation (p=0.027) and both the cytoplasmic expressions and positive membrane were associated with mild infiltration (p=0.013, p=0.033, respectively). Concerning to prognostic characteristics, PAI-1 positive and negative membrane expression showed a significant association with local relapse (p=0.027). Moreover, multivariate analysis confirmed the PAI-1 positive membrane expression of as a risk factor for the occurrence of this recurrence, with approximately 14-fold increased risk (OR=14.4, CI=1.40-150.01). The degree of tumor differentiation was also significantly associated with VEGF negative and positive cytoplasmic expression (p=0.035) and a relationship between the presence of inflammatory infiltrate and the weak and strong positive expression of the protein (p=0.038) was observed. Finally, statistical significance between the smoking habit and the CA-IX, PAI-1 and VEGF expression of were not found, but, it is believed that this result was due to the composition of the work casuistry. Thus, the search for biomarkers for OSCC is a challenge which must be faced by research groups, in order to elucidate mechanisms of tumorigenesis that are not yet understood.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-07. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:55Z : No. of bitstreams: 1 000847517.pdf: 1122598 bytes, checksum: 5bc0d6d1da79abdbf524626af4ab9944 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo avaliou, histoquimicamente e imunoistoquimicamente, a influência do plasma rico em plaquetas (PRP), da terapia com laser em baixa intensidade (LLLT) ou da associação de ambos na cicatrização de defeitos de fenestração periodontal (DFP) em ratos. DFP foram criados cirurgicamente na mandíbula de 80 ratos. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos: 1) C (controle) e 2) PRP - defeitos preenchidos com coágulo sanguíneo ou PRP, respectivamente; 3) LLLT e 4) PRP/LLLT - defeitos receberam aplicação da LLLT, foram preenchidos com coágulo sanguíneo ou PRP, respectivamente e irradiados novamente. Os animais foram submetidos à eutanásia aos 10 ou 30 dias pós-operatórios. As fibras colágenas imaturas e maduras foram avaliadas por análise histoquímica e suas porcentagens calculadas. Foram realizadas reações imunoistoquímicas para fator de transcrição relacionado à Runt (Runx2), osteocalcina (OCN), osteopontina (OPN) e fosfatase alcalina (ALP). Células Runx2-positivas foram quantificadas. Um método semi-quantitativo foi usado para avaliar a imunomarcação de OCN, OPN e ALP. Os dados foram analisados estatisticamente. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas porcentagens de fibras colágenas imaturas e maduras dos grupos experimentais quando comparadas ao grupo controle. Aos 10 dias, os grupos PRP e PRP/LLLT apresentaram número de células Runx2-positivas significativamente maior que o controle; o grupo PRP/LLLT apresentou padrões de imunomarcação de OCN e OPN significativamente maiores que o controle e não houve diferenças estatisticamente significativas no padrão de imunomarcação de ALP. Aos 30 dias, diferenças estatisticamente significativas não foram Resumo observadas nos padrões de imunomarcação de OCN, OPN e ALP entre os grupos experimentais... / This study histochemically and imunoistochemically evaluated the influence of platelet-rich plasma (PRP), low-level laser therapy (LLLT), or their combination on the healing of periodontal fenestration defects (PFD) in rats. PFD were surgically created in the mandible of 80 rats. The animals were randomly divided into 4 groups: 1) C (Control) and 2) PRP - defects were filled with blood clot or PRP, respectively; 3) LLLT and 4) PRP/LLLT - defects received laser irradiation, were filled with blood clot or PRP, respectively, and then irradiated again. Animals were euthanized at either 10 or 30 days post-operative. Immature and mature collagen fibers were histochemically evaluated and their percentages were calculated. Runtrelated transcription factor 2 (Runx2), osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN) and alkaline phosphatase (ALP) immunohistochemical staining were performed. Runx2-positive cells were quantified. A semi-quantitative method was used to evaluate OCN, OPN, and ALP immunolabeling pattern. Data were statistically analyzed. Statistically significant differences were not observed in the percentages of immature and mature collagen fibers when each experimental group was compared to control. At 10 days, PRP and PRP/LLLT groups presented a significantly higher number of Runx2-positive cells than control; PRP/LLLT presented significantly higher OCN and OPN immunolabeling than control; and statistically significant differences were not observed in the ALP immunolabeling. At 30 days, statistically significant differences were not observed in the OCN, OPN and ALP immunolabeling among the experimental groups... / FAPESP: 13/15380-3