Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können. Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen. / The implementation of fluorescence microscopy enables specific labeling and studying of cellular structures with high contrast. Since light microscopy is limited in its resolution, structural information at the molecular level remains hidden. This barrier, known as diffraction limit, can be circumvented by modern imaging techniques. For this purpose localization microscopy employs photoswitchable fluorophores. The fluorescence of these fluorophores is spatially and temporally separated in order to localize single fluorophores with nanometer precision. From thousands of single-molecule localizations an artificial highresolution image is reconstructed. Super-resolution microscopy is a valuable tool for live-cell observations in order to investigate sub-cellular structures and protein dynamics beyond the diffraction limit under physiological conditions. Both photoactivatable fluorescent proteins and photoswitchable organic fluorophores can be used as labels. Whereas labeling with fluorescent proteins is straightforward to implement, organic fluorophores, however, have the Advantage of a more precise localization due to a higher photon yield. In living cells, labeling of structures with synthetic fluorophores is facilitated by so-called chemical tags. Those are polypeptide sequences that are genetically fused to the target protein and subsequently labeled with dye coupled substrates. In this work, on the basis of the model structure H2B—a histone protein—dyes are identified in combination with chemical tags, that can be successfully used for super-resolution imaging with direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in living cells. The dyes tetramethylrhodamine, 505 and Atto 655 proved to be particularly suitable, whereby the whole spectral range is represented. However, unspecific binding and dye aggregation can pose a problem for the efficient labeling of living cells. It is shown, that coating the glass surface with glycine successfully minimizes unspecific adsorption of fluorophores. Furthermore the impact of the excitation light on living cells is discussed. Methods are presented to keep photodamage at a minimum, e. g., by choosing a dye within the red excitation range. The feasibility to label living cells with photoswitchable organic fluorophores represents a big asset for localization microscopy, which originally employed dye labeled antibodies. This alternative labeling technique is used in a collaboration to study the aggregation behavior of � -Amyloid peptides, which cause Alzheimer’s disease. By means of HeLa cells, different diffraction limited morphologies of aggregates are revealed. It is thereby shown, that intracellular peptides generate larger aggregates than the ones in the extracellular region. In another collaboration the structural organization of two flotillin proteins in the membrane of bacteria is examined by means of the photoactivatable Protein mEos2 and photoactivated localization microscopy (PALM). These proteins form two clusters with different diameters, which could be determined with nanometer precision. It was also asserted that both proteins exist in unequal numbers within the bacterium.

Dank der mit modernen NMR-Spektrometern (Kernspintomographen) routinemäßig realisierbaren isotropen räumlichen Auflösungen von wenigen Mikrometern, ergeben sich für die 1H NMR-Mikroskopie zahlreiche neue Anwendungsgebiete. Allerdings sind die Möglichkeiten und Grenzen der NMR-Mikroskopie bezüglich ihrer praktischen Anwendbarkeit bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit ist im Bereich der biophysikalischen Grundlagenforschung angesiedelt und soll die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie auf neuen medizinischen und biologischen Anwendungsgebieten anhand von ausgewählten Beispielen aus diesen Bereichen demonstrieren. Die einzelnen Projekte besitzen deswegen immer auch den Charakter von Machbarkeitsstudien, die aufzeigen sollen, welche Möglichkeiten und Vorteile die NMR-Mikroskopie im Vergleich zu etablierten Untersuchungsmethoden bietet. Im Detail wurden unterschiedliche lebende und fixierte biologische Proben mittels NMR-Mikroskopie zerstörungsfrei und räumlich hochaufgelöst dargestellt. Dabei variierte die spezielle Zielsetzung von der Visualisierung der Invasion eines Tumorsphäroiden in ein Zellaggregat anhand von T2-Parameterkarten (Zeitkonstante der Spin-Spin-Relaxation) über die dreidimensionale Darstellung des Gehirns der Honigbiene in der intakten Kopfkapsel bis hin zur nicht-invassiven Abbildung der Anatomie prenataler Delphine. Für alle durchgeführten Projekte war der nicht-invasive Charakter der NMR-Experimente von entscheidender Bedeutung. Die zu beobachtende Tumorinvasion durfte nicht durch die Messung beeinflusst werden, das Bienengehirn sollte möglichst naturgetreu abgebildet werden, und die untersuchten Delphine sind seltene Museumsstücke, die nicht zerstört werden durften. Die verschiedenen Proben wurden mit der jeweils bestmöglichen räumlichen Auflösung visualisiert, die sich entweder durch das minimal nötige Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) oder durch die zur Verfügung stehende Messzeit ergab. Um einzelne feine Strukturen in den Bildern auflösen zu können, mussten sowohl das SNR, als auch das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Die Messungen wurden an Hochfeld-NMR-Spektrometern bei 500 und 750 MHz durchgeführt, um das für die hohe Auflösung notwendige SNR zu gewährleisten. Mit den Experimenten konnten zahlreiche Fragen bezüglich mikroskopischer Details der verschiedenen untersuchten Proben nicht-invasiv beantworten werden. Gleichzeitig führten sie zu neuen interessanten Fragestellungen bezüglich der NMR-Mikroskopie an fixierten Proben. Darüber hinaus konnte die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie als Alternative bzw. Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie der konfokalen Lasermikroskopie bei der Visualisierung des Bienengehirns und der konventionellen Histologie bei der Untersuchung der Anatomie der prenatalen Delphine demonstriert werden. Durch die Untersuchung der speziellen Vorteile und der Grenzen der Anwendung der NMR-Mikroskopie gegenüber den herkömmlichen Untersuchungsmethoden konnte konkret der praktische Nutzen ihres Einsatzes aufgezeigt und Ergebnisse erzielt werden, die sonst nicht erzielbar wären. Gerade der Einsatz der NMR-Mikroskopie in Form der NMR-Histologie stellt einen vielversprechenden Weg zur Etablierung der NMR-Mikroskopie als Routineuntersuchungsmethode dar. Als ebenso erfolgreich hat sich die Anwendung der NMR-Mikroskopie als Untersuchungsmethode bei der Beobachtung der Tumorinvasion erwiesen, so dass sie auch in der medizinischen in-vitro Forschung und Therapiesimulation als sinnvolle Alternative zu den vorhandenen Methoden angesehen werden kann. Anhand der ausgewählten Anwendungsbeispiele ist es in dieser Arbeit somit gelungen, neue, konkrete Einsatzmöglichkeiten für die NMR-Mikroskopie zu eröffnen und ihre praktische Anwendbarkeit als Untersuchungsmethode für Fragestellungen im Bereich der medizinischen in-vitro Forschung und verschiedener neuro- und entwicklungsbiologischer Bereiche zu demonstrieren. / With modern MR-spectrometers it is possible to achieve isotropic spatial resolutions in the range of only a few microns. Thus, several new fields of application for 1H-MR-Microscopy are being developed. Still, the practical possibilities and limitations of this technique have only been determined rarely. This work has a biophysical background and uses different examples to demonstrate the practical applicability of NMR-Microscopy in the medical and biological sector. Therefore, the different projects are feasibility studies which are used to compare the possibilities and advantages of NMR-Microscopy with other, established examination techniques. In detail, using MR-Microscopy, different living and fixed biological samples have been visualized non-invasively with high spatial resolution. The specific purpose of the studies ranged from the visualization of the invasion of tumor-spheroids into cell aggregates using T2 parameter maps (time constant of the spin-spin relaxation) to the three-dimensional display of the honey bee brain in the intact head capsule and the non-invasive visualization of the anatomy of prenatal dolphins. For all these projects, the non-invasive character of MR-experiments was of utmost importance. The tumor invasion was not to be disturbed by the measurements, the bee brain should be visualized as close to its true natural shape as possible and the examined dolphins represent rare museum specimens which should not be destroyed. The different samples were all imaged with the best possible spatial resolution which was either limited by the necessary signal-to-noise ratio (SNR) or the available scan time. In order to resolve single details and fine structures in the images, it was necessary to optimize the SNR as well as the contrast-to-noise ratio. To guarantee the necessary SNR, the measurements were performed on high field MR-spectrometers with resonance frequencies of 500 and 750 MHz. Numerous questions about microscopic details of the examined samples could be answered non-invasively with the experiments performed. At the same time, the experiments led to new interesting questions about MR-Microscopy on fixed samples. Furthermore, the practical applicability of MR-Microscopy as an alternative or a supplement to conventional examination methods could be demonstrated. Here, these methods were confocal laser microscopy in the case of the honey bee brain and conventional histology in the case of the prenatal dolphins. By investigating the specific advantages and limitations of MR-Microscopy in these cases, it was possible to demonstrate the practical value of its application and to obtain results which would otherwise have been impossible. Especially the use of MR-Microscopy as MR-Histology is a promising application which will help to establish MR-Microscopy as a routine examination method. Since the tumor invasion process could also be observed very successfully using MR-Microscopy, this technique can as well be considered as a valuable tool for medical in-vitro research and therapy simulation and thus an alternative to existing methods. In summary, with the examples chosen in this work, it was possible to find new applications for MR-Microscopy and to demonstrate the practical applicability of this method in the fields of medical in-vitro research as well as neurological and developmental biology.

This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. / In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt.

Gegenstand der Arbeit ist die Magnetometrie mit Stickstoff-Fehlstellen-Zentren im Diamantgitter und die Entwicklung eines Rastersondenmagnetometers auf Basis eines Ensembles dieser Defektzentren. Ein solches Instrument verspricht eine bislang nicht erreichte Kombination von Feldsensitivität und räumlicher Auflösung während einer Magnetfeldmessung, und kann damit einen wichtigen Beitrag für das Verständnis von magnetischen Systemen und Phänomenen liefern. Die Arbeit widmet sich zunächst dem Verständnis der elektronischen Zustände des Defekts, und wie diese optisch untersucht werden können. Gleichzeitige Anregung der Zentren durch sichtbares Licht und elektromagnetischer Strahlung im Bereich von Mikrowellenfrequenzen machen es möglich, die elektronische Spinstruktur des Defekts zu messen und zu manipulieren. Dadurch kann direkt der Einfluss von externen Magnetfeldern auf die Energie der Spinzustände ausgelesen werden. Die quantenmechanischen Auswahlregeln der verschiedenen Anregungen können für eine selektive Anregung der Zentren entlang einer bestimmten kristallographischen Achse verwendet werden. Damit kann eine Ensemble von Defekten zur Vektormagnetometrie, ohne auf ein zusätzliches äußeres Magnetfeld angewiesen zu sein, welches die untersuchte Probe nachhaltig beeinflussen kann. Anschließend wird die Entwicklung einer geeigneten Mikrowellenantenne dargestellt, die in einem späteren Rastersondenexperiment mit den Defekten auf geringem Raum eingesetzt werden kann. Außerdem werden die einzelnen Schritte präsentiert, wie die Farbzentren im Diamantgitter erzeugt werden und aus großen Diamantplättchen Nanostrukturen erzeugt werden, die als Rasterkraftsonden eingesetzt werden können. Die fertigen Sonden können in einem modularen Rasterkraftaufbau verwendet werden, der über einen zusätzlichen optischen Zugang verfügt, sodass die Information des Spinsensors ausgelesen werden kann. In verschiedenen Testexperimenten wird die Funktionsweise des gesamten Apparats demonstriert. / The present thesis demonstrates the basic principles of magnetometry with color centers in the diamond lattice called nitrogen-vacancy (NV) centers, and how these can be applied in a scanning probe magnetometer by using nanostructured diamond samples. The combination of high sensitivity magnetic field sensors, small detection volumes and a spatial precision in the nanometer range will lead to an unprecedented tool to investigate magnetic systems and phenomenons. The thesis explores the electronic structure of the defects by means of optical spectroscopy. The interaction between the electron spin and external electromagnetic fields with microwave frequencies allows for manipulation of the spin states, whose energies are also sensitive to the magnetic field. Combined optical and microwave excitation thus offers a way to measure the local magnetic field by using the crystal defect as a probe. The thesis presents further a method to distinguish between spin signals of the NV centers along the four crystallographic equivalent axes. This enables vector magnetometry with an ensemble of NV centers which is otherwise only achievable with help of an additional external bias magnetic field, but which can undesirably influence the investigated samples. The development of an appropriate microwave antenna is demonstrated, which can be used for manipulating the electron spin of the NV center in a multi-dimensional scanning probe experiment. The thesis illustrates further how NV centers are created in diamond samples and how diamond structures in the nanometer range can be fabricated in a top-down process. In a final step, a nanostructured diamond cantilever is introduced into a self-designed, pre-characterized atomic force microscope setup with optical access for electron spin initialization and read-out. Its functionality is demonstrated in several experiments.

The main problem addressed by this dissertation is the accurate and automated determination of electron microscope imaging conditions. This enables the restoration of the object wave, which confers direct structural information about the specimen, from sets of differently aberrated images. An important member in the imaging chain is the image recording device, in many cases now a charge-coupled device (CCD) camera. Previous characterisations of these cameras often relied on the unjustified assumption that the Modulation Transfer Function (MTF) also correctly describes the spatial frequency dependent attenuation of the electron shot noise. A new theory is therefore presented that distinguishes between signal and noise transfer. This facilitates the evaluation of both properties using a detailed Monte-Carlo simulation model for the electron and photon scattering in the scintillator of the camera. Furthermore, methods for the accurate experimental determination of the signal and noise transfer functions are presented. In agreement with the Monte-Carlo simulations, experimental results for commercially available CCD cameras show that the signal transfer is significantly poorer than the noise transfer. The centrepiece of this dissertation is the development of new methods for determining the relative aberrations in a set of images and the absolute symmetric aberrations in the restored wave. Both are based on the analysis of the phase information in the Fourier domain and give each Fourier component a weight independent of its strength. This makes the method suitable even for largely crystalline samples with little amorphous contamination, where conventional methods, such as automated diffractogram fitting, usually fail. The method is then extended to also cover the antisymmetric aberrations, using combined beam tilt and focal series. The applicability of the new method is demonstrated with object wave restorations from tilt and focal series of complex inorganic block oxides and of carbon nanotubes filled with one-dimensional inorganic crystals. The latter specimens allowed for the first time a direct comparison between the phase shift in the restored object wave of a specimen with precisely known thickness and the value predicted by simulations.

Hard x rays come along with a variety of extraordinary properties which make them an excellent probe for investigation in science, technology and medicine. Their large attenuation length in matter opens up the possibility to use hard x-rays for non-destructive investigation of the inner structure of specimens. Medical radiography is one important example of exploiting this feature. Since their discovery by W. C. Röntgen in 1895, a large variety of x-ray analytical techniques have been developed and successfully applied, such as x-ray crystallography, reflectometry, fluorescence spectroscopy, x-ray absorption spectroscopy, small angle x-ray scattering, and many more. Each of those methods reveals information about certain physical properties, but usually, these properties are an average over the complete sample region illuminated by the x rays. In order to obtain the spatial distribution of those properties in inhomogeneous samples, scanning microscopy techniques have to be applied, screening the sample with a small x-ray beam. The spatial resolution is limited by the finite size of the beam. The availability of highly brilliant x-ray sources at third generation synchrotron radiation facilities together with the development of enhanced focusing x-ray optics made it possible to generate increasingly small high intense x-ray beams, pushing the spatial resolution down to the sub-100 nm range. During this thesis the prototype of a hard x-ray scanning microscope utilizing microstructured nanofocusing lenses was designed, built, and successfully tested. The nanofocusing x-ray lenses were developed by our research group of the Institute of Structural Physics at the Technische Universität Dresden. The prototype instrument was installed at the ESRF beamline ID 13. A wide range of experiments like fluorescence element mapping, fluorescence tomography, x-ray nano-diffraction, coherent x-ray diffraction imaging, and x-ray ptychography were performed as part of this thesis. The hard x-ray scanning microscope provides a stable x-ray beam with a full width at half maximum size of 50-100 nm near the focal plane. The nanoprobe was also used for characterization of nanofocusing lenses, crucial to further improve them. Based on the experiences with the prototype, an advanced version of a hard x-ray scanning microscope is under development and will be installed at the PETRA III beamline P06 dedicated as a user instrument for scanning microscopy. This document is organized as follows. A short introduction motivating the necessity for building a hard x-ray scanning microscope is followed by a brief review of the fundamentals of hard x-ray physics with an emphasis on free-space propagation and interaction with matter. After a discussion of the requirements on the x-ray source for the nanoprobe, the main features of synchrotron radiation from an undulator source are shown. The properties of the nanobeam generated by refractive x-ray lenses are treated as well as a two-stage focusing scheme for tailoring size, flux and the lateral coherence properties of the x-ray focus. The design and realization of the microscope setup is addressed, and a selection of experiments performed with the prototype version is presented, before this thesis is finished with a conclusion and an outlook on prospective plans for an improved microscope setup to be installed at PETRA III. / Aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften kommt harte Röntgenstrahlung in vielfältiger Weise in der Wissenschaft, Industrie und Medizin zum Einsatz. Vor allem die Fähigkeit, makroskopische Gegenstände zu durchdringen, eröffnet die Möglichkeit, im Innern ausgedehnter Objekte verborgene Strukturen zum Vorschein zu bringen, ohne den Gegenstand zerstören zu müssen. Eine Vielzahl röntgenanalytischer Verfahren wie zum Beispiel Kristallographie, Reflektometrie, Fluoreszenzspektroskopie, Absorptionsspektroskopie oder Kleinwinkelstreuung sind entwickelt und erfolgreich angewendet worden. Jede dieser Methoden liefert gewisse strukturelle, chemische oder physikalische Eigenschaften der Probe zutage, allerdings gemittelt über den von der Röntgenstrahlung beleuchteten Bereich. Um eine ortsaufgelöste Verteilung der durch die Röntgenanalyse gewonnenen Information zu erhalten, bedarf es eines sogenannten Mikrostrahls, durch den die Probe lokal abgetastet werden kann. Die dadurch erreichbare räumliche Auflösung ist durch die Größe des Mikrostrahls begrenzt. Aufgrund der Verfügbarkeit hinreichend brillanter Röntgenquellen in Form von Undulatoren an Synchrotronstrahlungseinrichtungen und des Vorhandenseins verbesserter Röntgenoptiken ist es in den vergangen Jahren gelungen, immer kleinere intensive Röntgenfokusse zu erzeugen und somit das räumliche Auflösungsvermögen der Röntgenrastermikroskope auf unter 100 nm zu verbessern. Gegenstand dieser Arbeit ist der Prototyp eines Rastersondenmikroskops für harte Röntgenstrahlung unter Verwendung refraktiver nanofokussierender Röntgenlinsen, die von unserer Arbeitsgruppe am Institut für Strukturphysik entwickelt und hergestellt werden. Das Rastersondenmikroskop wurde im Rahmen dieser Promotion in Dresden konzipiert und gebaut sowie am Strahlrohr ID 13 des ESRF installiert und erfolgreich getestet. Das Gerät stellt einen hochintensiven Röntgenfokus der Größe 50-100 nm zur Verfügung, mit dem im Verlaufe dieser Doktorarbeit zahlreiche Experimente wie Fluoreszenztomographie, Röntgennanobeugung, Abbildung mittels kohärenter Röntgenbeugung sowie Röntgenptychographie erfolgreich durchgeführt wurden. Das Rastermikroskop dient unter anderem auch dem Charakterisieren der nanofokussierenden Linsen, wobei die dadurch gewonnenen Erkenntnisse in die Herstellung verbesserten Linsen einfließen. Diese Arbeit ist wie folgt strukturiert. Ein kurzes einleitendes Kapitel dient als Motivation für den Bau eines Rastersondenmikroskops für harte Röntgenstrahlung. Es folgt eine Einführung in die Grundlagen der Röntgenphysik mit Hauptaugenmerk auf die Ausbreitung von Röntgenstrahlung im Raum und die Wechselwirkungsmechanismen von Röntgenstrahlung mit Materie. Anschließend werden die Anforderungen an die Röntgenquelle besprochen und die Vorzüge eines Undulators herausgestellt. Wichtige Eigenschaften eines mittels refraktiver Röntgenlinsen erzeugten Röntgenfokus werden behandelt, und das Konzept einer Vorfokussierung zur gezielten Anpassung der transversalen Kohärenzeigenschaften an die Erfordernisse des Experiments wird besprochen. Das Design und die technische Realisierung des Rastermikroskops werden ebenso dargestellt wie eine Auswahl erfolgreicher Experimente, die am Gerät vollzogen wurden. Die Arbeit endet mit einem Ausblick, der mögliche Weiterentwicklungen in Aussicht stellt, unter anderem den Aufbau eines verbesserten Rastermikroskops am PETRA III-Strahlrohr P06.

The main problem addressed by this dissertation is the accurate and automated determination of electron microscope imaging conditions. This enables the restoration of the object wave, which confers direct structural information about the specimen, from sets of differently aberrated images. An important member in the imaging chain is the image recording device, in many cases now a charge-coupled device (CCD) camera. Previous characterisations of these cameras often relied on the unjustified assumption that the Modulation Transfer Function (MTF) also correctly describes the spatial frequency dependent attenuation of the electron shot noise. A new theory is therefore presented that distinguishes between signal and noise transfer. This facilitates the evaluation of both properties using a detailed Monte-Carlo simulation model for the electron and photon scattering in the scintillator of the camera. Furthermore, methods for the accurate experimental determination of the signal and noise transfer functions are presented. In agreement with the Monte-Carlo simulations, experimental results for commercially available CCD cameras show that the signal transfer is significantly poorer than the noise transfer. The centrepiece of this dissertation is the development of new methods for determining the relative aberrations in a set of images and the absolute symmetric aberrations in the restored wave. Both are based on the analysis of the phase information in the Fourier domain and give each Fourier component a weight independent of its strength. This makes the method suitable even for largely crystalline samples with little amorphous contamination, where conventional methods, such as automated diffractogram fitting, usually fail. The method is then extended to also cover the antisymmetric aberrations, using combined beam tilt and focal series. The applicability of the new method is demonstrated with object wave restorations from tilt and focal series of complex inorganic block oxides and of carbon nanotubes filled with one-dimensional inorganic crystals. The latter specimens allowed for the first time a direct comparison between the phase shift in the restored object wave of a specimen with precisely known thickness and the value predicted by simulations.

Hard x rays come along with a variety of extraordinary properties which make them an excellent probe for investigation in science, technology and medicine. Their large attenuation length in matter opens up the possibility to use hard x-rays for non-destructive investigation of the inner structure of specimens. Medical radiography is one important example of exploiting this feature. Since their discovery by W. C. Röntgen in 1895, a large variety of x-ray analytical techniques have been developed and successfully applied, such as x-ray crystallography, reflectometry, fluorescence spectroscopy, x-ray absorption spectroscopy, small angle x-ray scattering, and many more. Each of those methods reveals information about certain physical properties, but usually, these properties are an average over the complete sample region illuminated by the x rays. In order to obtain the spatial distribution of those properties in inhomogeneous samples, scanning microscopy techniques have to be applied, screening the sample with a small x-ray beam. The spatial resolution is limited by the finite size of the beam. The availability of highly brilliant x-ray sources at third generation synchrotron radiation facilities together with the development of enhanced focusing x-ray optics made it possible to generate increasingly small high intense x-ray beams, pushing the spatial resolution down to the sub-100 nm range. During this thesis the prototype of a hard x-ray scanning microscope utilizing microstructured nanofocusing lenses was designed, built, and successfully tested. The nanofocusing x-ray lenses were developed by our research group of the Institute of Structural Physics at the Technische Universität Dresden. The prototype instrument was installed at the ESRF beamline ID 13. A wide range of experiments like fluorescence element mapping, fluorescence tomography, x-ray nano-diffraction, coherent x-ray diffraction imaging, and x-ray ptychography were performed as part of this thesis. The hard x-ray scanning microscope provides a stable x-ray beam with a full width at half maximum size of 50-100 nm near the focal plane. The nanoprobe was also used for characterization of nanofocusing lenses, crucial to further improve them. Based on the experiences with the prototype, an advanced version of a hard x-ray scanning microscope is under development and will be installed at the PETRA III beamline P06 dedicated as a user instrument for scanning microscopy. This document is organized as follows. A short introduction motivating the necessity for building a hard x-ray scanning microscope is followed by a brief review of the fundamentals of hard x-ray physics with an emphasis on free-space propagation and interaction with matter. After a discussion of the requirements on the x-ray source for the nanoprobe, the main features of synchrotron radiation from an undulator source are shown. The properties of the nanobeam generated by refractive x-ray lenses are treated as well as a two-stage focusing scheme for tailoring size, flux and the lateral coherence properties of the x-ray focus. The design and realization of the microscope setup is addressed, and a selection of experiments performed with the prototype version is presented, before this thesis is finished with a conclusion and an outlook on prospective plans for an improved microscope setup to be installed at PETRA III.:1 Introduction ............................................... 1 2 Basic Properties of Hard X Rays ............................ 3 2.1 Free Propagation of X Rays ............................... 3 2.1.1 The Helmholtz Equation ................................. 4 2.1.2 Integral Theorem of Helmholtz and Kirchhoff ............ 6 2.1.3 Fresnel-Kirchhoff's Diffraction Formula ................ 8 2.1.4 Fresnel-Kirchhoff Propagation .......................... 11 2.2 Interaction of X Rays with Matter ........................ 13 2.2.1 Complex Index of Refraction ............................ 13 2.2.2 Attenuation ............................................ 15 2.2.3 Refraction ............................................. 18 3 The X-Ray Source ........................................... 21 3.1 Requirements ............................................. 21 3.1.1 Energy and Energy Bandwidth ............................ 21 3.1.2 Source Size and Divergence ............................. 23 3.1.3 Brilliance ............................................. 23 3.2 Synchrotron Radiation .................................... 24 3.3 Layout of a Synchrotron Radiation Facility ............... 27 3.4 Liénard-Wiechert Fields .................................. 29 3.5 Dipole Magnets ........................................... 31 3.6 Insertion Devices ........................................ 36 3.6.1 Multipole Wigglers ..................................... 36 3.6.2 Undulators ............................................. 37 4 X-Ray Optics ............................................... 39 4.1 Refractive X-Ray Lenses .................................. 40 4.2 Compound Parabolic Refractive Lenses (CRLs) .............. 41 4.3 Nanofocusing Lenses (NFLs) ............................... 43 4.4 Adiabatically Focusing Lenses (AFLs) ..................... 45 4.5 Focal Distance ........................................... 46 4.6 Transverse Focus Size .................................... 50 4.7 Beam Caustic ............................................. 52 4.8 Depth of Focus ........................................... 53 4.9 Beam Divergence .......................................... 53 4.10 Chromaticity ............................................ 54 4.11 Transmission and Cross Section .......................... 55 4.12 Transverse Coherence .................................... 56 4.12.1 Mutual Intensity Function ............................. 57 4.12.2 Free Propagation of Mutual Intensity .................. 57 4.12.3 Mutual Intensity In The Focal Plane ................... 58 4.12.4 Diffraction Limited Focus ............................. 59 4.13 Coherent Flux ........................................... 60 4.14 Two-Stage Focusing ...................................... 64 4.14.1 The Prefocusing Parameter ............................. 65 4.14.2 Required Refractive Power ............................. 67 4.14.3 Flux Considerations ................................... 70 4.14.4 Astigmatic Prefocusing ................................ 75 5 Nanoprobe Setup ............................................ 77 5.1 X-Ray Optics ............................................. 78 5.1.1 Nanofocusing Lenses .................................... 79 5.1.2 Entry Slits ............................................ 82 5.1.3 Pinhole ................................................ 82 5.1.4 Additional Shielding ................................... 83 5.1.5 Vacuum and Helium Tubes ................................ 83 5.2 Sample Stages ............................................ 84 5.2.1 High Resolution Scanner ................................ 84 5.2.2 High Precision Rotational Stage ........................ 85 5.2.3 Coarse Linear Stages ................................... 85 5.2.4 Goniometer Head ........................................ 85 5.3 Detectors ................................................ 86 5.3.1 High Resolution X-Ray Camera ........................... 86 5.3.2 Diffraction Cameras .................................... 89 5.3.3 Energy Dispersive Detectors ............................ 91 5.3.4 Photodiodes ............................................ 93 5.4 Control Software ......................................... 94 6 Experiments ................................................ 97 6.1 Lens Alignment ........................................... 97 6.2 Focus Characterization ................................... 99 6.2.1 Knife-Edge Scans ....................................... 100 6.2.2 Far-Field Measurements ................................. 102 6.2.3 X-Ray Ptychography ..................................... 103 6.3 Fluorescence Spectroscopy ................................ 105 6.3.1 Fluorescence Element Mapping ........................... 107 6.3.2 Fluorescence Tomography ................................ 110 6.4 Diffraction Experiments .................................. 111 6.4.1 Microdiffraction on Phase Change Media ................. 112 6.4.2 Microdiffraction on Stranski-Krastanow Islands ......... 113 6.4.3 Coherent X-Ray Diffraction Imaging of Gold Particles ... 115 6.4.4 X-Ray Ptychography of a Nano-Structured Microchip ...... 117 7 Conclusion and Outlook ..................................... 121 Bibliography ................................................. 125 List of Figures .............................................. 139 List of Publications ......................................... 141 Danksagung ................................................... 145 Curriculum Vitae ............................................. 149 Erklärung .................................................... 151 / Aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften kommt harte Röntgenstrahlung in vielfältiger Weise in der Wissenschaft, Industrie und Medizin zum Einsatz. Vor allem die Fähigkeit, makroskopische Gegenstände zu durchdringen, eröffnet die Möglichkeit, im Innern ausgedehnter Objekte verborgene Strukturen zum Vorschein zu bringen, ohne den Gegenstand zerstören zu müssen. Eine Vielzahl röntgenanalytischer Verfahren wie zum Beispiel Kristallographie, Reflektometrie, Fluoreszenzspektroskopie, Absorptionsspektroskopie oder Kleinwinkelstreuung sind entwickelt und erfolgreich angewendet worden. Jede dieser Methoden liefert gewisse strukturelle, chemische oder physikalische Eigenschaften der Probe zutage, allerdings gemittelt über den von der Röntgenstrahlung beleuchteten Bereich. Um eine ortsaufgelöste Verteilung der durch die Röntgenanalyse gewonnenen Information zu erhalten, bedarf es eines sogenannten Mikrostrahls, durch den die Probe lokal abgetastet werden kann. Die dadurch erreichbare räumliche Auflösung ist durch die Größe des Mikrostrahls begrenzt. Aufgrund der Verfügbarkeit hinreichend brillanter Röntgenquellen in Form von Undulatoren an Synchrotronstrahlungseinrichtungen und des Vorhandenseins verbesserter Röntgenoptiken ist es in den vergangen Jahren gelungen, immer kleinere intensive Röntgenfokusse zu erzeugen und somit das räumliche Auflösungsvermögen der Röntgenrastermikroskope auf unter 100 nm zu verbessern. Gegenstand dieser Arbeit ist der Prototyp eines Rastersondenmikroskops für harte Röntgenstrahlung unter Verwendung refraktiver nanofokussierender Röntgenlinsen, die von unserer Arbeitsgruppe am Institut für Strukturphysik entwickelt und hergestellt werden. Das Rastersondenmikroskop wurde im Rahmen dieser Promotion in Dresden konzipiert und gebaut sowie am Strahlrohr ID 13 des ESRF installiert und erfolgreich getestet. Das Gerät stellt einen hochintensiven Röntgenfokus der Größe 50-100 nm zur Verfügung, mit dem im Verlaufe dieser Doktorarbeit zahlreiche Experimente wie Fluoreszenztomographie, Röntgennanobeugung, Abbildung mittels kohärenter Röntgenbeugung sowie Röntgenptychographie erfolgreich durchgeführt wurden. Das Rastermikroskop dient unter anderem auch dem Charakterisieren der nanofokussierenden Linsen, wobei die dadurch gewonnenen Erkenntnisse in die Herstellung verbesserten Linsen einfließen. Diese Arbeit ist wie folgt strukturiert. Ein kurzes einleitendes Kapitel dient als Motivation für den Bau eines Rastersondenmikroskops für harte Röntgenstrahlung. Es folgt eine Einführung in die Grundlagen der Röntgenphysik mit Hauptaugenmerk auf die Ausbreitung von Röntgenstrahlung im Raum und die Wechselwirkungsmechanismen von Röntgenstrahlung mit Materie. Anschließend werden die Anforderungen an die Röntgenquelle besprochen und die Vorzüge eines Undulators herausgestellt. Wichtige Eigenschaften eines mittels refraktiver Röntgenlinsen erzeugten Röntgenfokus werden behandelt, und das Konzept einer Vorfokussierung zur gezielten Anpassung der transversalen Kohärenzeigenschaften an die Erfordernisse des Experiments wird besprochen. Das Design und die technische Realisierung des Rastermikroskops werden ebenso dargestellt wie eine Auswahl erfolgreicher Experimente, die am Gerät vollzogen wurden. Die Arbeit endet mit einem Ausblick, der mögliche Weiterentwicklungen in Aussicht stellt, unter anderem den Aufbau eines verbesserten Rastermikroskops am PETRA III-Strahlrohr P06.:1 Introduction ............................................... 1 2 Basic Properties of Hard X Rays ............................ 3 2.1 Free Propagation of X Rays ............................... 3 2.1.1 The Helmholtz Equation ................................. 4 2.1.2 Integral Theorem of Helmholtz and Kirchhoff ............ 6 2.1.3 Fresnel-Kirchhoff's Diffraction Formula ................ 8 2.1.4 Fresnel-Kirchhoff Propagation .......................... 11 2.2 Interaction of X Rays with Matter ........................ 13 2.2.1 Complex Index of Refraction ............................ 13 2.2.2 Attenuation ............................................ 15 2.2.3 Refraction ............................................. 18 3 The X-Ray Source ........................................... 21 3.1 Requirements ............................................. 21 3.1.1 Energy and Energy Bandwidth ............................ 21 3.1.2 Source Size and Divergence ............................. 23 3.1.3 Brilliance ............................................. 23 3.2 Synchrotron Radiation .................................... 24 3.3 Layout of a Synchrotron Radiation Facility ............... 27 3.4 Liénard-Wiechert Fields .................................. 29 3.5 Dipole Magnets ........................................... 31 3.6 Insertion Devices ........................................ 36 3.6.1 Multipole Wigglers ..................................... 36 3.6.2 Undulators ............................................. 37 4 X-Ray Optics ............................................... 39 4.1 Refractive X-Ray Lenses .................................. 40 4.2 Compound Parabolic Refractive Lenses (CRLs) .............. 41 4.3 Nanofocusing Lenses (NFLs) ............................... 43 4.4 Adiabatically Focusing Lenses (AFLs) ..................... 45 4.5 Focal Distance ........................................... 46 4.6 Transverse Focus Size .................................... 50 4.7 Beam Caustic ............................................. 52 4.8 Depth of Focus ........................................... 53 4.9 Beam Divergence .......................................... 53 4.10 Chromaticity ............................................ 54 4.11 Transmission and Cross Section .......................... 55 4.12 Transverse Coherence .................................... 56 4.12.1 Mutual Intensity Function ............................. 57 4.12.2 Free Propagation of Mutual Intensity .................. 57 4.12.3 Mutual Intensity In The Focal Plane ................... 58 4.12.4 Diffraction Limited Focus ............................. 59 4.13 Coherent Flux ........................................... 60 4.14 Two-Stage Focusing ...................................... 64 4.14.1 The Prefocusing Parameter ............................. 65 4.14.2 Required Refractive Power ............................. 67 4.14.3 Flux Considerations ................................... 70 4.14.4 Astigmatic Prefocusing ................................ 75 5 Nanoprobe Setup ............................................ 77 5.1 X-Ray Optics ............................................. 78 5.1.1 Nanofocusing Lenses .................................... 79 5.1.2 Entry Slits ............................................ 82 5.1.3 Pinhole ................................................ 82 5.1.4 Additional Shielding ................................... 83 5.1.5 Vacuum and Helium Tubes ................................ 83 5.2 Sample Stages ............................................ 84 5.2.1 High Resolution Scanner ................................ 84 5.2.2 High Precision Rotational Stage ........................ 85 5.2.3 Coarse Linear Stages ................................... 85 5.2.4 Goniometer Head ........................................ 85 5.3 Detectors ................................................ 86 5.3.1 High Resolution X-Ray Camera ........................... 86 5.3.2 Diffraction Cameras .................................... 89 5.3.3 Energy Dispersive Detectors ............................ 91 5.3.4 Photodiodes ............................................ 93 5.4 Control Software ......................................... 94 6 Experiments ................................................ 97 6.1 Lens Alignment ........................................... 97 6.2 Focus Characterization ................................... 99 6.2.1 Knife-Edge Scans ....................................... 100 6.2.2 Far-Field Measurements ................................. 102 6.2.3 X-Ray Ptychography ..................................... 103 6.3 Fluorescence Spectroscopy ................................ 105 6.3.1 Fluorescence Element Mapping ........................... 107 6.3.2 Fluorescence Tomography ................................ 110 6.4 Diffraction Experiments .................................. 111 6.4.1 Microdiffraction on Phase Change Media ................. 112 6.4.2 Microdiffraction on Stranski-Krastanow Islands ......... 113 6.4.3 Coherent X-Ray Diffraction Imaging of Gold Particles ... 115 6.4.4 X-Ray Ptychography of a Nano-Structured Microchip ...... 117 7 Conclusion and Outlook ..................................... 121 Bibliography ................................................. 125 List of Figures .............................................. 139 List of Publications ......................................... 141 Danksagung ................................................... 145 Curriculum Vitae ............................................. 149 Erklärung .................................................... 151