Les réarrangements permettent une évolution rapide du génome par l’acquisition de séquences codantes exogènes, la perte de fonctions non-essentielles ou la création de nouvelles organisations génomiques. Différents mécanismes de réarrangements impliquant des éléments génétiques mobiles (EGM) ont été identifiés chez les archées, les bactéries et les eucaryotes. En revanche, on ignore l’origine des nombreuses inversions génomiques détectées pour les espèces du genre archéen Thermococcus. Mes travaux de thèse visent à améliorer la compréhension de l’évolution génomique chez les Thermococcales à travers l’étude de deux familles d’EGM : les familles de plasmides pTN3 et pT26-2. Plus précisément, je me suis intéressée aux recombinases à tyrosine (ou intégrases) que ces plasmides encodent et qui permettent leur intégration dans le chromosome de l’hôte. J’ai montré que l’intégrase plasmidique Intᵖᵀᴺ³ est responsable d’inversions dans le chromosome de son hôte Thermococcus nautili grâce à une activité catalytique inédite de recombinaison homologue. J’ai par la suite caractérisé deux autres intégrases de Thermococcales reliés phylogénétiquement à Intᵖᵀᴺ³ dont seulement une présente une activité de recombinaison homologue. La comparaison de leurs séquences primaires et la résolution de la structure de Intᵖᵀᴺ³ vont maintenant éclairer les déterminants génétiques responsables de la spécificité de site et de l’activité de recombinaison homologue. Les trois intégrases appartiennent à une classe de recombinases spécifique des archées qui catalyse une intégration suicidaire. Lors de l’intégration, le gène de l’intégrase est fragmenté et probablement désactivé. L’EGM intégré se retrouve piégé dans le chromosome. Les avantages évolutifs d’une telle activité suicidaire restent pour l’instant mystérieux. J’ai identifié 62 intégrases hyperthermophiles suicidaires et reconstruit leur histoire évolutive. Ces intégrases sont très prévalentes et recrutées par différents EGM. De plus, j’ai montré que l’une de ces intégrases présente in vitro une activité de recombinaison site-spécifique à des températures proches de l’ébullition de l’eau, représentant un avantage dans les environnements hyperthermophiles. / Genomes rapidly evolve through rearrangements that can generate new genome organizations or lead to the acquisition of foreign coding sequences or the loss of non-essential functions. Several mechanisms of rearrangement were uncovered for Archaea, Bacteria and Eukaryotes that involve mobile genetic elements (MGE). Species from the archaeal genera Thermococcus present numerous genomic inversions but none of the previously known inversion drivers. To better understand the genomic evolution of Thermococcales, I investigated two of their MGE families: the pTN3 and pT26-2 plasmid families. Specifically, I focused on the tyrosine recombinases (or integrase) that these plasmids encode and that catalyze their site-specific integration in the host chromosome. I demonstrated that the plasmidic integrase Intᵖᵀᴺ³ is responsible for chromosomal inversions in the host Thermococcus nautili through an unprecedented homologous recombination catalytic activity. I also characterized two other related Thermococcus integrases and only one catalyzes homologous recombination. The structure resolution of Intᵖᵀᴺ³ and primary sequence comparisons will now provide clues about the genetic determinants of site specificity and of the homologous recombination activity. The three integrases all belong to an archaeal-specific class of integrases that catalyzes a suicidal integration. The integrase gene is partitioned and presumably inactivated upon integration. The integrated MGE is then trapped into the chromosome. The evolutionary benefits of this suicide activity are puzzling. I identified 62 related suicidal hyperthermophilic integrases and reconstructed their evolutionary history. They are highly prevalent and recruited by diverse MGE. I also showed that one of these integrases can catalyze in vitro site-specific recombination at near boiling water temperature, representing an advantage in hyperthermophilic environments.

Ovarian cancer is serious and one of the most common gynecologic cancers. Carboplatin is the therapeutic agent of the first choice in the ovarian cancer therapy. However, after the primary therapeutic response to carboplatin, the relapse of the disease may occur with developed resistance to carboplatin. Chemoresistance and insufficient therapy response are considered to be the reason of the high mortality rate of ovarian cancer. The DNA damage response pathways play an important role in the therapeutic response and chemoresistance development. Restoration of homologous recombination function in cancers is the key mechanism of resistance development to platinum agents. Based on this knowledge, we formed our hypothesis, that the inhibition of homologous recombination could increase the sensibility to carboplatin. The main goal of this thesis was to define the role of double-strand breaks repair in response to chemotherapy of ovarian cancer. Protein MRE11 is part of the MRN complex, that participates in double-strand breaks repair. Using mirin as a pharmaceutic inhibitor of MRE11 we were aiming to determine the impact of homologous recombination on the effect of carboplatin and its role in resistant development to carboplatin. In the practical part of the thesis, we described the association between...

RAD18 is an E3 ubiquitin ligase that prevents the replication forks from collapsing caused by damaged DNA. As an important factor controlling replication, its dysregulation was shown to be associated with some human tumours. However, the clinical relevance of this finding is unknown. The aim of the thesis was evaluation of selected RAD18 variants that had been identified in breast and ovarian cancer patients. This work revealed functional defects of RAD18 variants not only in replication fork protection but also in repair of DNA double-strand breaks. This unconventional role of RAD18 is known to be dependent on upstream ubiquitination events, however, its contribution to the repair per se is not understood. This work aimed to elucidate the function of RAD18 in DNA double-strand break repair by homologous recombination focusing especially on its relationship with 53BP1. Data presented here show that RAD18 effectively disrupts 53BP1 accumulation in the repair foci by competition for the same binding partner and thus promotes resection of DNA ends. This antagonistic function of RAD18 is restricted both spatially (to the vicinity of the repair centre) and temporarily (to S phase). Moreover, it seems to be regulated by existence of RAD18 in two distinct complexes. Potential models for this regulation...

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第18186号 / 医科博第51号 / 新制||医科||4(附属図書館) / 31044 / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 小柳 義夫, 教授 松岡 雅雄, 教授 朝長 啓造 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.

Les membres de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), présents dans tous les domaines de la vie, sont impliqués dans des processus allant de la cohésion des chromatides-sœurs jusqu’à la réparation de l’ADN. Chacun des membres de cette famille, composée de 6 membres (Smc1 à Smc6), s’associe avec un autre membre ainsi qu’à des sous-unités non-SMC pour former 3 complexes : cohésine, condensine et Smc5-6. L’implication du complexe Smc5-6 dans plusieurs aspects du maintien de l’intégrité génomique est bien démontrée. Néanmoins, une question fondamentale concernant ce complexe demeure encore sans réponse: comment peut-il être impliqué dans autant d’aspects de la vie d’une cellule? Encore à ce jour, il est difficile de répondre à cette question en raison du manque d’information disponible au sujet des activités biochimiques de ce complexe. C’est pourquoi l’objectif de ce travail consiste en la caractérisation biochimique du complexe Smc5-6. La biochimie de cohésine et condensine suggère diverses possibilités en ce qui a trait aux activités biochimiques du complexe Smc5-6. La première étape de mon projet fut donc d’élaborer une procédure pour la purification de Smc5 et Smc6 après surexpression en levure. Après plusieurs expériences, il apparut clair que les deux protéines possèdent une activité de liaison à l’ADN simple brin (ADNsb) ainsi qu’à l’ADN double brins (ADNdb) et que, même si les protéines peuvent se lier aux deux types d’ADN, elles possèdent une plus grande affinité pour l’ADNsb. De plus, ces expériences permirent de démontrer que l’interaction entre Smc5 ou Smc6 et l’ADNsb est très stable, alors que l’interaction avec l’ADNdb ne l’est pas. Suite à l’obtention de ces résultats, la seconde étape fut la détermination de la ou des partie(s) de Smc5 et Smc6 permettant la liaison à l’ADN. Pour répondre à cette question, une dissection moléculaire fut réalisée, suivi d’une caractérisation des différents domaines constituants Smc5 et Smc6. De cette façon, il fut possible de démontrer qu’il existe deux sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 ; le premier site se trouvant dans le domaine «hinge» ainsi que dans la région adjacente du domaine «coiled-coil» et le second au niveau de la tête ATPase des deux protéines. Bien que les deux domaines puissent lier l’ADNsb, il fut démontré qu’une différence majeure existe au niveau de leur affinité pour ce type d’ADN. En effet, le domaine «hinge» possède une affinité plus forte pour l’ADNsb que la tête ATPase. De plus, cette dernière est incapable de lier l’ADNdb alors que le domaine «hinge» le peut. L’identification des sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 permettra de créer de nouveaux mutants possédant un défaut dans la liaison à l’ADN. Ainsi, l’étude du complexe Smc5-6 durant la réparation de l’ADN in vivo sera facilité. / The Smc5-6 complex is part of the SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) family and is involved in the maintenance of genome integrity. This complex is required for the replication and repair of DNA. Unfortunately, the DNA substrates recognized by the Smc5-6 complex are still unknown. To address this gap, I used a biochemical approach to purify and functionally characterize the core of the Smc5-6 complex represented by the two SMC proteins. Subsequently, I wanted to understand which part(s) of Smc5 or Smc6 mediate their binding to DNA. I show here that Smc5 and Smc6 bind to all types of DNA tested. Despite this ability to associate with several types of nucleic acids, they have a clear preference for single-stranded DNA (ssDNA). The ability of Smc5 and Smc6 to link DNA independently of each other suggests that both SMC proteins have the potential to target the Smc5-6 complex to its DNA substrates in vivo. Furthermore, the minimal length of ssDNA required for the binding of Smc5 or Smc6 is between 45 to 75 nucleotides. This length of ssDNA is shorter than the size of ssDNA intermediates created during DNA repair or replication reactions. In addition to having a preference for ssDNA, the binding of both SMC proteins to this type of DNA is stronger than their binding to double-stranded DNA (dsDNA). Finally, the molecular dissection of SMC proteins into functional domains revealed that there are two independent DNA-binding sites on each molecule of Smc5 or Smc6. The first region is located in the hinge domain, while the second region is located in the ATPase head of the protein. The affinity and selectivity of independent domains towards DNA substrates suggest a functional differentiation between the two DNA-binding sites of SMC molecules. Indeed, the hinge domain has a greater affinity for ssDNA than the ATPase head. In terms of selectivity, the hinge domain is capable of binding to dsDNA whereas the ATPase head cannot. Taken together, our identification of the DNA-binding domains on Smc5 and Smc6 will enable the creation of new mutants with a defect in their DNA-binding activity. Thus, the study of the Smc5-6 complex during DNA repair, in vivo, will be facilitated.

DNA is wrapped around proteins called histones, whose modification regulates numerous cellular processes. Therefore it is not surprising that mutations in the genes that modify the histones are frequently associated with human cancer. For example, mutations in SETD2, encoding the sole enzyme that catalyses histone H3 lysine 36 trimethylation (H3K36me3), occur frequently in multiple cancer types. This identifies H3K36me3 loss as an important event in cancer development, and also as a potential therapeutic target. This thesis investigates the following questions: (1) how does the loss of H3K36me3 contribute to cancer development; and (2) what therapy can be used to kill cancers that have already lost H3K36me3. To answer the first question, this thesis shows that H3K36me3 facilitates the accurate repair of DNA double-stranded breaks (DSBs) by homologous recombination (HR). H3K36me3 promotes HR by recruiting CtIP to the site of DSBs to carry out resection, allowing the binding of HR proteins (such as RPA and RAD51) to the damage sites. Thus it is proposed that error-free HR repair within H3K36me3-decorated transcriptionally active genomic regions suppresses genetic mutations which could promote tumourigenesis. To answer the second question, this thesis reveals a clinically relevant synthetic lethal interaction between H3K36me3 loss and WEE1 inhibition. WEE1 inhibition selectively kills H3K36me3-deficient cells by inhibiting DNA replication, and subsequent fork stalling results in MUS81 endonuclease-dependent DNA damage and cell death. The mechanism is found to be synergistic depletion of RRM2 (ribonucleotide reductase small subunit), the enzyme that generates deoxyribonucleotides (dNTPs). This work reveals two pathways that regulate RRM2: one involves transcriptional activation of RRM2 by H3K36me3, and the other involves RRM2 degradation regulated by Cyclin-Dependent Kinase, CDK1 (which is controlled by WEE1, CHK1 and ATR). Based on this mechanism, the synthetic lethal interaction is expanded, from between two genes, to between two pathways. Supported by in vivo experiments, the study suggests that patients with cancers that have lost H3K36me3 could benefit from treatment with the inhibitors of WEE1, CHK1 or ATR.

L’élimination programmée d’ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l’introduction de cassures double brin (CDB) de l’ADN et la préservation de l’intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l’introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l’excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l’élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L’implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l’excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n’y a pas de jonctions d’excision formées et les extrémités cassées s’accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L’hypothèse d’une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l’utilisation de microhomologie, a été émise. C’est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d’extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l’ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d’un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l’introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome. / Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.