Les récentes avancées des méthodes de détermination structurale à basse résolution (microscopie électronique, dispersion de neutrons ou de rayons X aux petits angles) et de l'imagerie cellulaire révèlent l'importance des assemblages supramoléculaires dans le fonctionnement de la cellule. Ces structures sont actuellement hors de portée des méthodes classiques de la modélisation moléculaire, limitées à l'étude des assemblages moléculaires de taille moyenne. Nous proposons une approche multi-échelle appelée Heligeom, basée sur les mouvements de vissage, permettant de relier l'échelle atomique à l'échelle des gros assemblages moléculaires. Cette approche exploite la propriété des assemblages moléculaires de s'auto-organiser en une grande variété de motifs géométriques tels que les hélices, les anneaux ou les filaments linéaires. Couplée à l'exploration des modes d'assemblage protéine-protéine au moyen de simulations d'amarrage ou d'échantillonnage par Monte Carlo, cette approche permet l'exploration et la combinaison de ces motifs. L'application d'Heligeom à l'étude du filament de RecA, une protéine membre de la famille des recombinases, a pu apporter un nouvel éclairage sur les modes d'auto-association de RecA et la diversité des géométries correspondantes, ainsi que sur les conséquences structurales de l'introduction d'irrégularités dans ces oligomères.La suite logicielle Heligeom est disponible dans la bibliothèque libre PTools. / Recent progress in methods for low resolution structural determination (electron microscopy, small angle neutron or X-ray scattering) and 3D cell imaging reveal the importance of supramolecular assemblies in the cell function. These structures are presently out of the reach of classical molecular modeling methods, which are limited to the study of medium size assemblies. We propose a multi-scale approach called Heligeom, based on the screw representation of movements, which enables linking the atomic scale to the scale of large assemblies. This approach builds on the property of molecular assemblies to self-organize into a large variety of geometric motifs such as helices, rings of linear filaments. Coupled to the exploration of protein-protein assembly modes using docking or Monte Carlo simulations, this approach allows identifying and combining such motifs. Application of Heligeom to study the filaments of RecA, a member of the recombinase protein family, shed new light on the modes of RecA self-association and the diversity of corresponding geometries, as well as the structural consequences of introducing irregularities in these oligomers. The Heligeom suite of computational tools is freely available in the PTools library.

Trypanosoma brucei est un parasite protozoaire responsable de la trypanosomiase humaine africaine. Il présente un cycle de vie complexe alternant entre des hôtes mammifères et un vecteur insecte, la mouche tsé-tsé. Au cours de ce cycle, il rencontre des environnements radicalement distincts auxquels il s’adapte en régulant son métabolisme. Nous avons étudié le métabolisme intermédiaire et énergétique de la forme procyclique évoluant dans le tractus digestif de l’insecte vecteur. Dans cet environnement dépourvu de glucose, la néoglucogenèse est cruciale pour la croissance et la survie des parasites car elle permet la synthèse d’hexoses phosphates et en particulier du glucose 6-phosphate qui alimente plusieurs voies de biosynthèse essentielles. Nos travaux confirment ce flux néoglucogénique alimenté par la proline mais aussi par le glycérol. Nous montrons que le glycérol est une source de carbone efficacement métabolisée et préférentiellement utilisée par la forme procyclique à défaut de la proline et même du glucose pour alimenter son métabolisme intermédiaire. Cette situation qu in’a jamais été décrite auparavant met en évidence la répression du glycérol sur le métabolisme du glucose. Nous montrons également que l’enzyme fructose 1,6-biphosphatase(FBPase), spécifique de la néoglucogenèse, n’est pas essentielle à la survie du parasite en conditions dépourvues de glucose indiquant qu’il existe une alternative à cette enzyme.Toutefois, FBPase joue un rôle important dans la virulence de T. brucei dans l’insecte.De plus, nous avons mis en évidence une autre stratégie d’adaptation de T. brucei basée sur des réarrangements génomiques qui peuvent mener à la synthèse de gènes chimères. / Trypanosoma brucei is a protozoan parasite responsible for human African trypanosomiasis. His complex life cycle alternates between mammalian hosts and the insect vector, the tsetsefly. During this cycle, the parasite encounters dissimilar environments and adapts to the sechanging conditions by regulating his metabolism. We have studied intermediate and energetic metabolism of the procyclic form living in the midgut of the insect vector. In this glucose-depleted environment, gluconeogenesis is crucial for growth and viability of the parasites. Indeed, it allows the synthesis of hexoses phosphates and in particular glucose 6-phosphate which feeds several essential biosynthetic pathways. Our work has confirmed the existence of a gluconeogenic flux fed by proline and glycerol. We have shown that glycerol is an efficiently metabolized carbon source and is preferentially used by the procyclic form rather than proline or even glucose. This situation never described before highlights glycerol repression on glucose metabolism. We have also showed that the enzyme fructose 1,6-biphosphatase (FBPase), specific of the gluconeogenesis, is not essential for the viability ofthe parasite in glucose-depleted conditions, suggesting that there is an alternative to this enzyme. However, FBPase plays an important role for virulence of T. brucei in the insect. Moreover, we have showed another adaptation strategy developed by T. brucei which is basedo n genomic rearrangements leading to the synthesis of chimeric genes.

La diversité des génomes de virus infectant les bactéries, les bactériophages (ou phage en abrégé), est telle qu’il est difficile de les classer de manière satisfaisante, la notion d’espèce elle-même ne faisant pas accord dans la communauté scientifique. A la racine de cette diversité, un des facteurs clé est la recombinaison de l’ADN, qui est élevée chez les bactériophages, et permet des échanges de gènes entre entités parfois fort différentes. Mes travaux se sont centrés sur la recombinaison homologue chez les bactériophages, et en particulier sur la protéine centrale de ce processus, la recombinase. J’ai montré pour deux grands types de recombinases phagiques, de type Rad52 et Sak4, que celles-ci étaient beaucoup moins fidèles dans le processus de recombinaison, comparées à la recombinase bactérienne RecA. De plus, pour Sak4, j’ai observé que cette recombinaison se produisait par appariement simple brin, et qu’elle dépendait entièrement in vivo d’une SSB phagique, dont le gène est situé à proximité du gène sak4 sur le chromosome du phage. Les échanges génétiques sont donc grandement facilités pour les phages contenant ce type de recombinases, mais ils ne sont pas non plus anarchiques : la recombinaison s’observe jusque 22% de divergence, mais deux séquences à 50% de divergence ne peuvent recombiner. Tout se passe donc comme si la notion d’espèce devait être élargie chez les phages par rapport aux bactéries, pour inclure dans un même groupe des génomes portant des traces d’échanges récents de matériel génétique par recombinaison homologue (ce que l’on appelle le mosaïcisme). / The diversity of the viruses infecting bacteria (bacteriophages, or phages for short) is so important that it is difficult to classify them in a pertinent way, and the species notion itself is a matter of debate among specialists. At the root of this diversity, one of the key factors is DNA recombination, which occurs at high levels among phages, and permits gene exchanges among entities that are sometimes very distant. My research has focused on homologous recombination in phages, and in particular on the protein that is key to the process, the recombinase. I have shown, for two different types of recombinases, Rad52-like and Sak4-like, that their fidelity was relaxed, compared to the bacterial recombinase, RecA. Moreover, for Sak4, a protein that had not been studied before, I showed that recombination occurs by single strand annealing, and that it is strictly dependent in vivo on the co-expression of its cognate SSB protein, whose gene is often encoded nearby in phage genomes encoding sak4. Genetic exchanges are therefore greatly facilitated for phages encoding these types of recombinases. Nevertheless, exchanges are not anarchical: recombination is seen up to 22% diverged substrates, but 50% diverged DNA sequences will not recombine. It may be that the species notion should be enlarged for phages, so as to include into a same group all phages exhibiting traces of recent exchanges of genetic material (the so-called mosaicism).

Les cassures double brin de l’ADN sont des dommages pouvant engendrer la mort cellulaire. Deux mécanismes majeurs sont impliqués dans leur réparation chez les bactéries : la recombinaison homologue et le Non-Homologous End Joining (NHEJ). Streptomyces est une bactérie modèle pour étudier l'impact relatif des mécanismes de recombinaison sur la structure du génome et son évolution ; le chromosome est en effet caractérisé par sa linéarité, son organisation génétique compartimentée et sa plasticité génomique remarquable. L'objectif de cette recherche est d'identifier les acteurs impliqués dans les mécanismes de réparation des cassures double brin qui restent inconnus chez Streptomyces à ce jour. Concernant la recombinaison homologue, la première étape consiste en une maturation des extrémités d’ADN générées par la cassure. Cette première étape est assurée par un complexe à activité hélicase-nuclease : RecBCD (chez Escherichia coli), AddAB (chez Bacillus subtilis) ou AdnAB (chez les mycobactéries). Une analyse in silico des génomes disponibles de Streptomyces a permis d’identifier chez ces organismes, deux gènes conservés et adjacents, nommés adnA et adnB en raison de leur homologie avec les gènes adnAB récemment identifiés chez les mycobactéries. Les tentatives visant à déléter ces gènes chez Streptomyces ambofaciens et Streptomyces coelicolor ont été infructueuses. Cependant, le fait que leur délétion soit rendue possible par l’ajout d’une copie ectopique du locus sauvage nous a amené à conclure au caractère essentiel d’adnA et adnB chez Streptomyces. La trans-complémentation d’un mutant [delta]recB d’E. coli par le locus adnAB de S. ambofaciens restaure l’activité nucléase cellulaire et la survie en présence ou non d’agent génotoxique, suggérant qu’adnAB code l’homologue fonctionnel de RecBCD d’E. coli. Le rôle central d’adnAB dans la recombinaison homologue et la réplication est discuté. Le mécanisme NHEJ montre une distribution sporadique chez les bactéries et implique les deux protéines Ku et LigD. La protéine Ku se fixe sur les extrémités de l’ADN et recrute la ligase LigD. Cette dernière est une protéine multifonctionnelle présentant, outre une activité ligase, une activité polymérase et parfois une activité nucléase. L’analyse des génomes de Streptomyces a révélé un nombre variable d’homologues de ku (1-3) et d’homologues codant pour l’une ou l’autre des trois activités de LigD. Ces différents gènes définissent deux loci conservés entre espèces de Streptomyces. Chez S. ambofaciens, trois homologues de ku (nommés kuA, kuB et kuC) et deux ligases ATP-dépendantes (nommés ligC et ligD) ont été identifiés. L’exposition de souches déficientes pour ces différents gènes aux agents endommageant l’ADN (la mitomycine C, l’irradiation par faisceau d’électrons) a démontré l’implication de kuA et ligC, deux acteurs conservés, mais aussi des gènes variables kuC et ligD, dans la réparation de l’ADN. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre le rôle du NHEJ dans l'évolution du génome et la biologie Streptomyces. / Double strand breaks (DSB) constitute the most deleterious form of DNA damage that a bacterial cell can encounter. Two major pathways can carry out DSB repair in bacteria: homologous recombination and Non-Homologous End Joining (NHEJ). Streptomyces is a model bacterium to explore the relative impact of these recombination mechanisms on genome structure and evolution; the chromosome is indeed typified by its linearity, its compartmentalized genetic organization and its remarkable genomic plasticity. The objective of this research is to identify actors involved in DSB repair mechanisms which remain mostly elusive in Streptomyces up to now. The first step of DSB repair by homologous recombination is the resection of broken DNA ends by a multisubunit helicase-nuclease complex exemplified by Escherichia coli RecBCD, Bacillus subtilis AddAB and Mycobacterium tuberculosis AdnAB. In silico analysis of Streptomyces genomes allowed to identify homologues for adnA and adnB which constitute a highly conserved locus within the genus. Attempts to disrupt these two genes were unsuccessful in Streptomyces ambofaciens as well as in Streptomyces coelicolor, unless an extra copy of adnAB was inserted in the chromosome. This indicates that AdnA and AdnB are both essential for Streptomyces growth. Complementation of an E. coli [delta]recB mutant by S. ambofaciens adnAB locus restored nuclease activity and cell survival in the presence or absence of DNA damaging agent, strongly suggesting that Streptomyces adnAB encodes a functional homologue of E. coli RecBCD. The key role of adnAB in homologous recombination and DNA replication is discussed. The NHEJ mechanism shows a sporadic distribution in bacteria and is known to involve the two proteins Ku and LigD. The Ku protein binds to the ends of the broken DNA and recruits the ATP-dependent ligase LigD which is a multifunctional protein carrying ligase, polymerase and sometimes nuclease activity. In silico analysis of Streptomyces genomes revealed a complex organization with a variable number of ku homologues (1 to 3) and of homologues encoding one of the three distinct LigD activities. These homologues define two conserved loci. S. ambofaciens possesses 3 ku (named kuA, kuB and kuC) and 2 ATP-dependent ligases (named ligC and ligD). Exposure to DNA damaging agents (mitomycin C, electron beam irradiation) of mutant strains got involved kuA and ligC, two conserved actors, but also variable genes such as kuC and ligD in DNA repair. These results open up new prospects to understand the role of NHEJ in the biology and genome evolution of Streptomyces.

Hautement conservé, de la bactérie jusqu'à l’Homme, la recombinaison homologue est indispensable à la survie de tout organisme vivant. Chez l’humain, la protéine hRad51 (human Rad51) y joue un rôle clé en s’autoassemblant au site de cassure sur les extrémités simple-brin d’une molécule d’ADN endommagée pour former le filament nucléoprotéique. Ce filament est capable à lui seul d’effectuer la plupart des opérations nécessaires au bon déroulement de la recombinaison homologue; il va permettre la reconnaissance d’homologie, l’appariement des séquences homologues et l’invasion de brins requise pour la synthèse de l’ADN manquant.La recombinaison homologue est un processus complexe impliquant de multiples partenaires. Pour mieux comprendre le rôle du filament nucléoprotéique au sein de la réaction, on se propose d’étudier ce dernier en l’absence de tout partenaire. Plus précisément, on observe le comportement mécanique de filaments hRad51-ADNdb en fonction des conditions chimiques. La formation du filament nucléoprotéique modifie la conformation de l’ADN sur lequel il s’assemble, l’allongeant de 50% et le déroulant de 43% dans le cas d’une molécule double-brin. Les pinces magnétiques sont un outil permettant de contrôler la force et la torsion appliquées à une unique molécule d’ADN double-brin (ADNdb), elles sont donc l’outil idéal pour sonder les propriétés mécaniques de filaments nucléoprotéiques. Le système des pinces magnétiques a été modifié afin de mesurer des paramètres mécaniques précédemment inaccessibles tel que le couple ressenti ou exercé par le filament. Le but de cette thèse a été d’étudier les propriétés mécano-chimiques des filaments nucléoprotéiques tout en essayant de tracer le paysage énergétique qui régit les transitions de ces systèmes. / Highly conserved throughout the species, homologous recombination is crucial to the survival of any living organism. In humans, the hRad51 protein (human Rad51) plays a key role by self-assembling at the break site on the single stranded extremities of damaged DNA molecules thus forming the nucleoprotein filament. This filament is able by itself to accomplish most of the necessary operations of homologous recombination; it allows the homology search, the pairing of the homologous sequences and the strand exchange.Homologous recombination is a complex process involving many partners. In order to better understand the role of the nucleoprotein filament in this process, we propose to study it in the absence of any partners. We will focus on the study of the mechanical properties of hRad51-dsDNA filaments as a function of chemical conditions. The formation of the nucleoprotein filament modifies the conformation of the DNA molecule on which it assembles, stretching it by 50% and unwinding it by 43% in the case of a double stranded DNA. The magnetic tweezers are a tool allowing the control of the force and torsion applied to a single dsDNA molecule; they are therefore the ideal tool to probe the mechanical properties of nucleoprotein filaments. We modified the magnetic tweezers as to allow the measurement of previously inaccessible mechanical parameters such as the torque applied or felt by the filament. The goal of this thesis has been to study the mechano-chemical properties of nucleoprotein filaments while drawing the energy landscape that governs the various transitions of these systems.

La protéine télomérique TRF2 permet de protéger les télomères notamment en régulant leur taille. Dans des cellules humaines, la surexpression de la protéine mutante TRF2ΔB, dont le domaine basique est absent, induit un raccourcissement soudain des télomères. In vitro, ce domaine basique protège des structures d’ADN particulières, appelées Jonctions de Holliday (JH), de la résolution par des endonucléases. Ces JH peuvent être présentes aux télomères d’une part au niveau de la boucle télomérique, une conformation de l’ADN qui ressemble à une structure intermédiaire de la recombinaison homologue (RH), et d’autre part au niveau des fourches de réplication bloquées, fréquentes aux télomères. Nous pensons que le raccourcissement soudain des télomères implique la résolution de JH au cours d’un événement de recombinaison homologue qui doit être étroitement régulé afin d’éviter qu’il ne se réalise de façon inappropriée. Dans le but de mieux caractériser cet événement, j’ai montré que différentes endonucléases capables de résoudre des JH (GEN1, MUS81, SLX1-SLX4) sont impliquées dans le raccourcissement des télomères induit par la surexpression de la protéine TRF2ΔB. Puis j’ai étudié le rôle de la protéine hRAP1 dans la régulation de ce mécanisme et l’implication des protéines de la RH. L’ensemble des résultats obtenus nous ont permis de proposer un nouveau rôle de la protéine TRF2 dans la régulation des événements de recombinaison homologue au cours de la réplication des télomères. / The stability of mammalian telomeres depends upon TRF2 which prevents inappropriate repair and checkpoint activation. In human cells, overexpressing a TRF2 mutant lacking the N-terminal basic domain, TRF2ΔB, induces sudden telomere shortening. In vitro, the basic domain protects particular DNA structures, called Holliday junctions (HJ), of the resolution by endonucleases. These HJ may be present at telomeres in one hand at the t-loop, a DNA conformation looking like a structural intermediate of homologous recombination (HR), and also at the level of stalled replication forks, frequent at telomeres. We believe that the sudden shortening of telomeres involves the resolution of HJ during a HR event that would be tightly regulated to prevent it occurs inappropriately. In order to better characterize this event, I have shown that different proteins harbouring resolving activities (GEN1, MUS81, SLX1-SLX4) are involved in telomere shortening induced by overexpression of TRF2ΔB. Then, I studied the role of hRAP1 in the regulation of this mechanism and involvement of HR proteins. The overall results allowed us to propose a new role of TRF2 in the regulation of HR events during the replication of telomeres.

Les rayons UV du soleil causent une variété de dommages dans l'ADN, parmi lesquels les dimères cyclobutilyques de pyrimidines (CPD) sont considérés comme hautement toxiques et dommageables pour un organisme. Par conséquent, il est important de comprendre comment la machinerie de réparation par excision des nucléotides (la NER), assure la réparation in vivo des CPD présents dans l'ADN empaqueté sous forme de chromatine. Il est connu que la présence du nucléosome inhiberait la NER, mais les détails fonctionnels demeurent mal compris, de même que les mécanismes cellulaires nécessaires pour contourner cette inhibition offerte par la chromatine. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les gènes SIR (SIR1, SIR2, SIR3 et SIR4 ) permettent la formation d'une structure hétérochromatique sur le locus du type sexuel et les télomères. Cependant, l'impact de cette hétérochromatine sur la réparation des CPD est très peu étudié.Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont permis de caractériser l'impact des gènes SIR dans la survie des cellules après irradiation aux rayons UV, de même que dans la réparation de l'ADN des régions hétérochromatiques. Premièrement, à l'aide d'une méthode basée sur le suivi de la croissance en milieu de culture liquide, nous avons démontré que les mutants sir[delta] sont plus résistants aux rayons UV par rapport aux cellules de types sauvages. Ce phénotype serait relié à l'effet de pseudo-diploïdie présent dans ces mutants, et plus précisément à la recombinaison homologue en phase G2/M du cycle cellulaire.Les protéines Sir ne joueraient donc pas un rôle directement dans la réparation des CPD. Par la suite, nous avons procédé à l'analyse de la cinétique de réparation de l'ADN du locus du type sexuel et des télomères dans des cellules de type sauvage et des mutants si2r[delta], sir3[delta], et rad26[delta] . À partir des résultats obtenus, nous avons pu tirer différentes conclusions préliminaires laissant croire que la présence de l'hétérochromatine faite par les protéines Sir n'inhiberait pas davantage la réparation par rapport à la présence des nucléosomes, du moins dans les régions sous-télomériques. De plus, nos résultats démontreraient que la réparation couplée à la transcription pourrait jouer un rôle important dans la réparation de ces régions. Ces hypothèses devront évidemment être testées.

Le xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare caractérisée par une hypersensibilité aux ultraviolets (UV) et une forte incidence des tumeurs cutanées. Les cellules des patients XP sont incapables d’éliminer les lésions induites dans l’ADN par les UV en raison d’un dysfonctionnement du mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER). Plusieurs groupes de complémentation ont été identifiés dans le syndrome XP, parmi lesquels le groupe XP-C représente la majorité des patients à travers le monde.Au cours de mon travail de thèse, j’ai développé un modèle de correction ciblée par recombinaison homologue (RH) d’une délétion de deux nucléotides au niveau de l’exon 9 du gène XPC aboutissant à l’apparition prématurée d’un codon stop. Afin de stimuler la RH, deux types de nucléases ingéniérées sont utilisées : les méganucléases et les TALENs. J’ai observé que la méthylation de la séquence ciblée pouvait affecter l’activité de celles-ci et donc l’efficacité du ciblage de gène. Cependant, deux approches ont été développées pour résoudre ce problème : l’utilisation d’un agent déméthylant (5-aza-2’-désoxycytidine (5azadC)) ou la création d’une endonucléase insensible à la méthylation. L’utilisation des méganucléases en combinaison avec la 5azadC a permis de stimuler la fréquence de coupure de presque 20 fois dans des fibroblastes XPC et la TALEN modifiée permet une augmentation de 40 fois. Avec ces deux stratégies j’ai obtenu des événements de correction génétique par introduction d’une matrice de réparation dans le locus ciblé avec une fréquence proche de 3%. La caractérisation des clones corrigés avec la TALEN XPC montre la correction génomique des deux nucléotides dans l’exon 9, une restauration de l’expression de la protéine XPC et une résistance cellulaire après irradiation UV traduisant le rétablissement des fonctions de la NER. Cette étude représente la première preuve de correction génétique de cellules déficientes en protéine XPC en utilisant une approche ciblée. / Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare inherited genetic disorder characterized by an UV hypersensitivity and a severe predisposition to skin cancers. Cells from XP patients are deficient in nucleotide excision repair (NER) of UV‐induced DNA lesions. Several complementation groups have been identified in the XP syndrome and the XP-C group represents the majority of XP patients around the world. During my PhD work, I developed a model of targeted correction by homologous recombination (HR) in order to correct a deletion of two nucleotides in the ninth exon in XPC gene leading to a premature stop codon. To stimulate HR, I used two types of engineered endonucleases : meganucleases and TALEN. I observed that the target methylation status could affect the endonuclease activities and therefore XPC gene correction. Nervertheless, I developed two approaches to overcome this methylation sensitivity : use of a demethylating agent (5-aza-2-deoxycytidine (5azadC)) or a specific engineering of TALEN. Using 5azadC with meganuclease allowed to stimulate the cutting frequency by nearly 20 fold in XPC fibroblasts and the engineered TALEN allowed a 40 fold-increase in frequency. With both strategies I obtained genetic correction events by repair matrix introduction in the targeted locus with a near 3% frequency. The characterization of corrected clones with the XPC TALEN shows genomic correction in the ninth exon, a restoration of the XPC protein expression and cell survival following UV exposure, thus demonstrating fully recovered normal repair activity by NER. This study represents the first evidence of genetic correction of XPC-deficient cells by a targeted approach.

Afin de transmettre leurs informations génétiques d'une génération à l'autre, les organismes à reproduction sexuée doivent réduire de moitié leur contenu chromosomique pour former des gamètes haploïdes. Cette réduction se produit lors d'une division cellulaire appelée méiose, durant laquelle une étape de réplication est suivie de deux divisions successives, la méiose I et II. Au cours de la méiose I, les chromosomes homologues se séparent et leur bonne ségrégation dépend de la création entre eux d’un lien physique. En méiose c’est le processus de réparation appelé recombinaison homologue, qui à la suite de l’induction dans le génome de centaine de cassures double brin par la protéine Spo11, permet d’établir ce lien. Spo11 est l'orthologue méiotique de la sous-unité catalytique de la topoisomérase VI, TopoVIA. Comme TopoVI est composée de deux sous-unités, TopoVIA et TopoVIB, l’existence d’un orthologue méiotique de TopoVIB était une question posée depuis l'identification de Spo11. Au cours de ma thèse, j'ai contribué à identifier une nouvelle famille de protéine, que l’on a nommé TopoVIB-like, orthologue à TopoVIB et nécessaire à la formation des cassures double-brin d'ADN méiotiques(Robert et al, 2016). Ces protéines ont des domaines similaires à ceux de TopoVIB, à savoir un GHKL (impliqué dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP), un domaine transducteur et un domaine CTD. Nous avons démontré que chez la souris, SPO11 forme un complexe avec TOPOVIBL. De plus, nous avons démontré que cette protéine est nécessaire à la formation des CDB. Ces résultats suggèrent que chez la souris, les CDB méiotiques sont catalysées par un complexe TopoVI-like. Chez S. cerevisiae, il n'y a pas d'orthologue clair de TopoVIB, mais nous avons trouvé que la protéine Rec102, connue pour être nécessaire à la formation des CDB méiotiques, présente une homologie partielle avec le domaine transducteur des TopoVIB-like. Rec102 forme un complexe avec Rec104, une protéine également requise pour la formation des CDB. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que le complexe Rec102 / Rec104 était l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la levure, interagissant avec Spo11 pour former un complexe de type TopoVI-like. Malgré l'importance de Spo11, son mode d'action est mal connu. Cette absence de données biochimiques est due à l’insolubilité de la protéine. Le but de ma thèse était de caractériser le mode d'action et la régulation du complexe TopoVI-like dans la formation des CDB méiotiques. Tout d'abord, biochimiquement, en purifiant in vitro une forme soluble du complexe TopoVI-like de levure composé de Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 (un partenaire direct de Spo11) en co-exprimant ces protéines dans deux systèmes d'expression, E. coli et S. cerevisiae. En utilisant E. coli, j'ai réussi à purifier un complexe soluble formé par Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 et en utilisant S. cerevisiae, j'ai purifié deux complexes différents, l'un formé par les quatre protéines, et un formé uniquement par Spo11 et Rec102. Néanmoins, les tests d'activité sur différents substrats d'ADN n'ont révélé aucune activité de coupure de l’ADN. Le deuxième objectif de ma thèse était d'étudier comment, chez la souris, TOPOVIBL régule l'activité de SPO11 en interagissant avec d'autres protéines nécessaires à la formation des CDB. En double hybride, j'ai prouvé que, comme chez la levure, l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la souris interagissait avec REC114, une autre protéine nécessaire à la formation des CDB. La cartographie de cette interaction à l'échelle de l’acide aminé a conduit à l'identification d'un résidu sur TOPOVIBL essentiel pour l'interaction entre TOPOVIBL et REC114. Afin d'étudier in vivo le rôle de l'interaction entre TOPOVIBL et REC114, une souris mutante pour le résidu identifié de TOPOVIBL a été générée à l'aide de CRISPER-Cas9 et son phénotype a été analysé. / To properly transmit their genetic information from one generation to another, sexually reproductive organisms need to halve their genome to form haploid gametes. This reduction occurs during a special cell division called meiosis, which proceeds through one round of DNA replication followed by two successive divisions called meiosis I and II. During meiosis I homologous chromosomes segregate, and their proper segregation depends on the homologous recombination pathway that establishes a physical link between the homologues. During meiosis, homologous recombination events are triggered by the formation of DNA double strand break (DSB) catalyzed by the evolutionarily conserved Spo11 protein. Spo11 is the meiotic ortholog of the catalytic subunit of the TopoVI topoisomerase, TopoVIA. As TopoVI is composed of two subunits, TopoVIA and TopoVIB, the requirement for meiotic DSB formation of a B subunit was under investigation since the identification of Spo11. During my PhD, I contributed to the identification of a new family of protein, the TopoVIB-like family, ortholog to the Topoisomerase VI B subunit (TopoVIB) and required for meiotic DNA double strand break formation (Robert et al, 2016). These proteins share domains in part similar to the canonical TopoVIB which are a GHKL domain (involved in ATP binding and hydrolysis), a transducer domain and a CTD domain. We demonstrated that in mice, SPO11 forms a complex with TOPOVIBL. Biochemical characterization of this complex showed a structure compatible with an A2B2 organization. Furthermore, we demonstrated that this protein is required for meiotic DSB formation. These results suggest the existence, in mice, of a TopoVI-like complex that catalyzes the formation of meiotic DSB. In S. cerevisiae, there is no clear TopoVIB-like ortholog, but we found that the Rec102 protein, which is known to be required for the formation of meiotic DSB, shows a partial homology with the transducer domain of the TopoVIB-like proteins. Rec102 forms a complex with Rec104, a protein also essential for DSB formation. Thus, we hypothesized that the Rec102/Rec104 complex is the yeast meiotic ortholog of TopoVIB, interacting with Spo11 to form a meiotic TopoVI-like complex. Despite the importance of Spo11 little is known about its mode of action. This absence of biochemical data is due to the lack of solubility of the protein. The aim of my PhD was to characterize the mode of action and regulation of the TopoVI-like complex for meiotic DSB formation. First, biochemically, by purifying in vitro a soluble form of the yeast TopoVI-like complex composed by Spo11/Rec102/Rec104/Ski8. To achieve this objective, I co-expressed these proteins in two different expression systems, E. coli and meiotic culture of S. cerevisiae. Using E. coli I managed to purify a soluble complex formed by Spo11/Rec102/Rec104/Ski8, and using meiotic culture of S. cerevisiae, I purified two different complexes, one formed, by the four proteins, and one formed only by Spo11 and Rec102. Nevertheless, in vitro activity essays on different DNA substrates did not reveal any DNA cleavage activity. The second goal of my PhD was to study how in mouse, the activity of TOPOVIBL / SPO11 may be regulated by other proteins known to be required for DSB formation. Using Y2H experiment I was able to prove that, as in yeast, mouse TOPOVIBL interacts with REC114, a protein required for DSB formation. The mapping of this interaction at the amino-acid scale, leads to the identification of one residue on TOPOVIBL essential for the interaction between TOPOVIBL and REC114. In order to investigate in vivo the role of the interaction between TOPOVIBL and REC114, a mutant mouse carrying a mutation in the identified residue of TOPOVIBL was generated using CRISPER-Cas9, and its phenotype analyzed.

A great challenge in bioinformatics is to accurately predict protein structure and function from its amino acid sequence, including annotation of protein domains, identification of protein disordered regions and detecting protein stability changes resulting from amino acid mutations. The combination of bioinformatics, genomics and proteomics becomes essential for the investigation of biological, cellular and molecular aspects of disease, and therefore can greatly contribute to the understanding of protein structures and facilitating drug discovery. In this thesis, a PREDICTOR, which consists of three machine learning methods applied to three different but related structure bioinformatics tasks, is presented: using profile Hidden Markov Models (HMMs) to identify remote sequence homologues, on the basis of protein domains; predicting order and disorder in proteins using Conditional Random Fields (CRFs); applying Support Vector Machines (SVMs) to detect protein stability changes due to single mutation. To facilitate structural instability and disease studies, these methods are implemented in three web servers: FISH, OnD-CRF and ProSMS, respectively. For FISH, most of the work presented in the thesis focuses on the design and construction of the web-server. The server is based on a collection of structure-anchored hidden Markov models (saHMM), which are used to identify structural similarity on the protein domain level. For the order and disorder prediction server, OnD-CRF, I implemented two schemes to alleviate the imbalance problem between ordered and disordered amino acids in the training dataset. One uses pruning of the protein sequence in order to obtain a balanced training dataset. The other tries to find the optimal p-value cut-off for discriminating between ordered and disordered amino acids.  Both these schemes enhance the sensitivity of detecting disordered amino acids in proteins. In addition, the output from the OnD-CRF web server can also be used to identify flexible regions, as well as predicting the effect of mutations on protein stability. For ProSMS, we propose, after careful evaluation with different methods, a clustered by homology and a non-clustered model for a three-state classification of protein stability changes due to single amino acid mutations. Results for the non-clustered model reveal that the sequence-only based prediction accuracy is comparable to the accuracy based on protein 3D structure information. In the case of the clustered model, however, the prediction accuracy is significantly improved when protein tertiary structure information, in form of local environmental conditions, is included. Comparing the prediction accuracies for the two models indicates that the prediction of mutation stability of proteins that are not homologous is still a challenging task. Benchmarking results show that, as stand-alone programs, these predictors can be comparable or superior to previously established predictors. Combined into a program package, these mutually complementary predictors will facilitate the understanding of structural instability and disease from protein sequence.