Mes travaux de thèse concernent le rôle du récepteur D1 de la dopamine dans les dyskinésies L-dopa induites, effets secondaires extrêmement handicapants du traitement de la maladie de Parkinson. En condition de dénervation striatale mimant l’environnement de la maladie de Parkinson, le traitement chronique par la L-dopa entraine des altérations majeures du trafic intraneuronal et de la signalisation du récepteur D1 de la dopamine dans les principaux neurones cibles de la dopamine, les neurones épineux de taille moyenne du striatum. Il existe en particulier une hypersensibilisation des récepteurs D1 dans les neurones striataux, avec une abondance accrue à la membrane plasmique et une diminution du niveau d’expression de la protéine GRK6 (Protéine kinase des Récepteurs Couplés aux Protéines G 6), un des acteurs clefs des phénomènes de désensibilisation, en relation directe avec l’apparition des dyskinésies.C’est dans ce contexte que se situe mon travail de thèse qui a eu pour objectif de mettre à profit et/ou de développer différents modèles expérimentaux et outils « in vivo » et « in vitro ». Nous avons associé des techniques d’imagerie cellulaire et tissulaire à des approches comportementales, afin d’explorer certains des événements cellulaires et moléculaires à l’échelle du neurone striatal et des réseaux neuronaux, reliant le niveau d’expression du récepteur D1, sa compartimentation cellulaire, son trafic intraneuronal et les dyskinésies ou des conditions pharmacologiques équivalentes.Nous avons confirmé dans le modèle du rat lésé unilatéralement à la 6-OHDA, traité par la L-dopa et développant des mouvements anormaux analogues aux dyskinésies chez l’homme, que le récepteur D1 est anormalement abondant à la membrane plasmique des neurones du striatum, alors qu’il devrait être internalisé après stimulation par son ligand naturel, la dopamine. Nous avons mis en évidence que les mécanismes d’internalisation après stimulation par un agoniste restent néanmoins fonctionnels. Après administration de l’agoniste D1, chez les animaux dyskinétiques, l’abondance des récepteurs D1 augmente dans les compartiments notamment impliqués dans les mécanismes d’internalisation et de transport (vésicules) et de dégradation (corps multivésiculaires). Nous avons apporté une explication possible à cette abondance anormale et à ce défaut d’internalisation, en montrant qu’ils pourraient être dus à une hétérodimérisation entre les récepteurs D1 et D3. La co-activation des récepteurs D1 et D3 par la L-dopa favoriserait l’ancrage du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux.Dans ce cadre, l’abord de l’étude de l’implication du protéasome dans la régulation de l’expression du récepteur D1 de la dopamine nous a semblé particulièrement important, sur la base des premières études soulignant l’implication de ce système catalytique dans le contrôle de l’activité et du métabolisme des récepteurs aux neurotransmetteurs. Nous avons révélé pour la première fois des liens entre l’activité catalytique du protéasome et la dynamique intraneuronale du récepteur D1 et plus particulièrement nous avons montré que son activité chymotrypsine-like est réduite de façon spécifique dans le striatum d’animaux dyskinétiques, comme une conséquence directe d’une déplétion en dopamine associée à une hyperstimulation dopaminergique.Nous avons testé en situation expérimentale une stratégie « thérapeutique » nouvelle en restaurant le mécanisme de désensibilisation homologue du récepteur D1 de la dopamine, par correction du déficit de la kinase GRK6 par transfert du gène correspondant via l’injection intrastriatale d’un vecteur lentiviral. Nous avons montré que cette approche permet de réduire considérablement la sévérité des dyskinésies dans les modèles rat et primate non-humain, analogues des dyskinésies chez l’homme et qu’elle restaure les effets thérapeutiques de la L-dopa. Ces effets sont la conséquence de la restauration des mécanismes de désensibilisation homologue : la surexpression de GRK6 entraîne l’internalisation spécifique des récepteurs D1. L’ensemble de nos résultats s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle menée depuis plusieurs années au laboratoire allant de la cellule au patient, avec pour but de transposer la compréhension des données expérimentales concernant les anomalies de l’expression du récepteur D1 de la dopamine en stratégies thérapeutiques dans les dyskinésies L-dopa induites. Nos investigations montrent qu’il est possible d’agir sur l’expression du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux de manière indirecte, en manipulant trois co-activateurs de son métabolisme, pour espérer réduire « in fine » la sévérité des dyskinésies. / In my thesis work, I studied the role of dopamine D1 receptor in L-dopa induced dyskinesia, a debilitating complication of Parkinson's disease’s treatment. In condition of striatal denervation, that mimics the Parkinson's disease environment, chronic treatment with L-dopa leads to major alterations of intraneuronal trafficking and dopamine D1 receptor signaling in the major target of dopamine neurons, the striatal medium spiny neurons. In particularly, there is a D1 receptor hypersensitivity in striatal neurons, with an increased abundance of D1 receptor at the plasma membrane and a decreased level of GRK6 protein expression, a key actor in desensitization mechanism, directly related with the apparition of dyskinesia.In this context, I used different in vitro and in vivo experimental models and tools. I have associated cell and tissue imaging techniques and behavioural approaches in order to explore cellular and molecular events in striatal neuron and neuronal networks, linking the D1 receptor expression level, its cellular compartmentalization, its intraneuronal trafficking and the dyskinesia behaviour or equivalent pharmacological conditions.We confirmed in the rat analog of L-dopa-induced dyskinesia, i.e., the L-dopa-induced abnormal involuntary movements in unilaterally 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned animals, that D1 receptor is abnormally abundant in the plasma membrane of neurons in the striatum, whereas it should be internalized after stimulation by its natural ligand, the dopamine. We showed that nevertheless the internalization mechanisms after agonist stimulation remains functional. After D1 agonist administration in dyskinetic animals, D1 receptor abundance increases in the cytoplasmic compartments involved in the internalization and transport (vesicles) and degradation (multivesicular bodies) mechanisms. Based on D3 receptor antagonist experiment, we propose that this abnormal abundance and this lack of internalization could be due to heterodimerization between the D1 and D3 receptors. D1 and D3 receptors co-activation by L-dopa might anchor D1 receptor at the plasma membrane of striatal neurons.In this context, analysis of proteasome involvement in the regulation of dopamine D1 receptor expression seemed particularly important, on the basis of the first studies underlying proteasome involvement in the activity and metabolism of neurotransmitter receptors. We demonstrated for the first time links between the proteasomal catalytic activity and D1 receptor intraneuronal dynamics and more particularly we showed that the proteasome chymotrypsin-like activity is reduced specifically in the striatum of dyskinetic animals, as a direct consequence of dopamine depletion associated with dopaminergic hyperstimulation.We tested in experimental condition, a new "therapeutic"strategy in order to restore the dopamine D1 receptor homologous desensitization mechanism, correcting the GRK6 kinase deficit by gene transfer through the intrastriatal injection of a lentiviral vector. We showed that this approach reduces significantly the dyskinesia severity in rat and non-human primate models and restores the L-dopa therapeutic effects. These effects are a consequence of the homologous desensitization mechanisms restoration : indeed GRK6 overexpression provokes specific D1 receptor internalization.Our results are part of a translational research conducted over several years in the laboratory from cell to patient, in order to translate our increased understanding of D1 receptor function abnormalities into therapeutic strategies for L-dopa induced dyskinesia. Our investigations show that it is possible to act on D1 receptor expression at the plasma membrane of striatal neurons via various routes, all resulting into diminished dyskinesia severity.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.

Il est relativement bien établi que les crises focales entraînent une augmentation régionale du flot sanguin dans le but de soutenir la demande énergétique en hémoglobine oxygénée des neurones épileptiques. Des changements hémodynamiques précoces ont également été rapportés dans la région homologue controlatérale, bien que ceci ait été moins bien caractérisé. Dans cette étude, notre objectif est de mieux caractériser, lors de crises focales, la nature des changements hémodynamiques précoces dans la région homologue controlatérale au foyer épileptique. L'imagerie optique intrinsèque (IOI) et la microscopie deux-photons sont utilisées pour étudier les changements hémodynamiques dans la région homologue controlatérale au site de crises focales induites par l’injection de 4-aminopyridine (4-AP) dans le cortex somatosensitif ipsilatéral de souris. Dans l'étude d'IOI, des changements de l’oxyhémoglobine (HbO), de la désoxyhémoglobine (HbR) et du débit sanguin cérébral ont été observées dans la région homologue controlatérale au site de crises focales lors de toutes les crises. Toutefois, ces changements étaient hétérogènes, sans patron cohérent et reproduisible. Nos expériences avec la microscopie deux-photons n’ont pas révélé de changements hémodynamiques significatifs dans la région homotopique controlatérale lors de trains de pointes épileptiques. Nos résultats doivent être interprétés avec prudence compte tenu de plusieurs limitations: d’une part absence de mesures électrophysiologiques dans la région d’intérêt controlatérale au foyer simultanément à l’imagerie deux-photons et à l'IOI; d’autre part, lors des expériences avec le deux-photons, incapacité à générer de longues décharges ictales mais plutôt des trains de pointes, couverture spatiale limitée de la région d’intérêt controlatérale, et faible puissance suite au décès prématuré de plusieurs souris pour diverses raisons techniques. Nous terminons en discutant de divers moyens pour améliorer les expériences futures. / It has been well demonstrated that focal seizures are associated with a significant increase in regional cerebral blood flow to actively supply discharging neurons with oxygenated hemoglobin. There is also some evidence to suggest that focal seizures elicit early hemodynamic changes in the contralateral homotopic area, although this has been less well documented. In this study, we aim to better characterize the nature of early hemodynamic responses contralateral to the epileptic focus during seizures. We used intrinsic optical imaging (IOI) and two-photon laser microscopy to measure the hemodynamic changes in the homotopic contralateral area following focal seizures induced by an injection of 4-aminopyridine (4-AP) in the mouse somatosensory neocortex. In the study using IOI, oxyhemoglobin (HbO), deoxyhemoglobin (HbR) and cerebral blood flow (CBF) changes were observed in the homotopic area contralateral to the focus during all seizures. However, these changes were rather heterogenous, lacking any consistent or reproducible pattern. Our two-photon study showed no significant hemodynamic changes at the capillary level in the homotopic area contralateral to the ictal focus during epileptic spike trains. However, these findings must be interpreted cautiously in light of several limitations we encountered during the experiments. Specifically, we were unable to simultaneously record electrophysiology in the contralateral homotopic area. Furthermore, during our two-photon experiments, we failed to induce long ictal discharges (inducing only spike trains) had a limited sampling of the contralateral homotopic area and reduced power as a result of low mice survival rate. We conclude by providing alternatives to possibly improve future experiments.

L’élimination programmée d’ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l’introduction de cassures double brin (CDB) de l’ADN et la préservation de l’intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l’introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l’excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l’élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L’implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l’excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n’y a pas de jonctions d’excision formées et les extrémités cassées s’accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L’hypothèse d’une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l’utilisation de microhomologie, a été émise. C’est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d’extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l’ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d’un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l’introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome. / Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.

La réplication des chromosomes est altérée par les facteurs endogènes et/ou exogènes qui perturbent la progression des fourches de réplication. Les cellules doivent donc coordonner la synthèse d’ADN avec des mécanismes assurant la stabilité et le rétablissement des fourches bloquées. La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme universel qui permet la réparation de l’ADN et participe au maintien de la réplication des chromosomes. Néanmoins, les mécanismes qui régulent la RH, notamment la RH ectopique versus la RH allélique, restent mal compris. Un autre mécanisme essentiel assurant la stabilité des génomes est l’assemblage de l’ADN néo-synthétisé autour de nucléosomes, conduisant à la constitution de fibres chromatiniennes nécessaires à l’organisation structurale du matériel génétique. Chez Saccharomyces cerevisiae, des défauts d’assemblage de la chromatine conduisent à une instabilité des fourches de réplication et augmentent le taux de RH. Sachant que les chaperonnes d’histones jouent un rôle crucial durant l’assemblage de la chromatine, j'ai décidé de me concentrer sur le rôle de la chaperonne d’histones H3-H4 appelé Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) dans les mécanismes de RH, chez Schizosaccharomyces pombe. En effet, la RH est associée à une étape de synthèse de l’ADN, et peu de choses sont connues sur l’assemblage de la chromatine au cours de cette synthèse. Mes résultats ont exclu un rôle de CAF-1 dans la recombinaison allelique et le maintien de la stabilité des fourches de réplication. Par contre, CAF-1 joue un rôle important dans les mécanismes de recombinaisons ectopique et dans la formation de réarrangements chromosomiques induits par des blocages de fourches. Mes données suggèrent un modèle selon lequel CAF-1 permet la stabilisation d’intermédiaires de recombinaison précoces (D-loop), via le dépôt de nucleosomes au cours de l’extension par polymérisation de ces intermédiaires. Ainsi CAF-1 neutralise la dissociation des intermédiaires de recombinaison précoces par l’ADN helicase Rqh1. CAF-1 ferait partie d'un équilibre qui règle la stabilité/dissociation des intermédiaires de recombinaison précoces. J'ai montré que le rôle de CAF-1 dans cet équilibre a une importance toute particulière pendant la recombinaison non-allelique, révélant ainsi un nouveau niveau de régulation des mécanismes de RH par l'assemblage de la chromatine. / The replication of chromosomes can be challenged by endogenous and environmental factors, interfering with the progression of replication forks. Therefore, cells have to coordinate DNA synthesis with mechanisms ensuring the stability and the recovery of halted forks. Homologous recombination (HR) is a universal mechanism that supports DNA repair and the robustness of DNA replication. Nonetheless, mechanisms regulating HR pathways, such as ectopic versus allelic recombination, remain poorly understood. Another essential pathway for genome stability is the wrapping of newly replicated DNA around nucleosomes, leading to the constitution of a chromatin fibre, which allows the structural organization of the genetic material. In Saccharomyces cerevisiae, deficiencies in chromatin assembly pathways lead to replication forks instability and consequent increase in the rate of HR. Histone chaperones play a crucial role during chromatin assembly, thus I decided to focus on the H3-H4 histone chaperone Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), to study its role in HR processes in Schizosaccharomyces pombe. Indeed, HR includes a DNA synthesis step and little is known about the associated chromatin assembly. My data excluded a role for CAF-1 in allelic recombination and in the maintenance of forks stability. However, CAF-1 was found to play an important role during ectopic recombination, in promoting chromosomal rearrangements induced by halted replication forks. My data support a model according to which CAF-1 allows the stabilization of early recombination intermediates (D-loop), via nucleosome deposition during the elongation of these intermediates. Doing so, CAF-1 counteracts the dissociation of early recombination intermediates by the helicase Rqh1. Therefore, CAF-1 appears to be part of an equilibrium that regulates stability/dissociation of early steps of recombination events. Importantly, I found that the role of CAF-1 in this equilibrium is of particular importance during non-allelic recombination, revealing a novel regulation level of HR mechanisms and outcomes by chromatin assembly.

Cette recherche clinique vise à explorer le retentissement de l'hypofertilité masculine et de la fécondation in vitro (FIV) sur le fonctionnement psychique des épouses dans le premier centre de consultation FIV en Egypte (1986), en contexte culturel égyptien. Près de 60% des couples qui consultent au Centre FIV présentent le diagnostic d'infertilité d'origine masculine. Nous nous intéressons à comprendre ce qui constitue la spécificité du fonctionnement psychique de ces femmes dans ce contexte culturel où l'infertilité masculine est une pathologie taboue, suscitant la honte familiale, et où seule la FIV homologue- utilisant les gamètes d'un couple marié- est autorisée par la loi. La première hypothèse renvoie à l'existence d'une souffrance psychique chez l'épouse liée au maintien du secret de l'hypofertilité masculine. La seconde hypothèse suppose que le diagnostic et les traitements médicaux sont accompagnés chez l'épouse d'une idéalisation oedipienne de ses propres parents. Notre échantillon est composé de dix femmes âgées de 20 à 40 ans inscrites dans un protocole FIV. Sur le plan méthodologique, nous nous sommes basés sur des entretiens de recherche semi-directifs et sur l'inventaire abrégé de dépression de Beck BDI-13. L'analyse des résultats met en évidence la présence chez les épouses d'un discours de plainte adressé envers leurs conjoints, en même temps que l'expression d'une idéalisation de leurs propres parents. La présence de symptômes de dépression variables est relevée dans l'échantillon. Enfin, la manière dont les femmes s'approprient subjectivement l'expérience de la FIV est un indicateur pertinent de leur équilibre psychique. Pour conclure, cette étude se veut être une recherche-action visant à mettre en place un dispositif clinique au service des femmes et des couples dans une institution médicale, et qui soit adapté à ce contexte culturel particulier. / This study aims at exploring the impact of male subfertility and In Vitro Fertilization (IVF) on the psychological functioning of a group of female spouses, in the first Egyptian IVF center in Egypt (1986), within the Egyptian cultural context. Approximately 60% of couples consulting at the Egyptian Center for IVF carry the diagnosis of male factor infertility. We are interested in understanding what constitutes the specificity of the psychological functioning of these women within this cultural context, where male infertility is a taboo pathology provoking family shame, and where only homologous IVF -using a married couple's gametes- is allowed by the law. The first hypothesis states that there is a specific female suffering related to the maintenance of the secret of male subfertility. The second hypothesis assumes that for the wife, the diagnosis disclosure and medical treatments are followed by an oedipal idealization of the her parents. Our sample is composed of ten women aged between 20 and 40 years old, and undergoing an IVF protocol. On the methodological aspect, we have used semi-structured interviews and the 13-Item Beck Depression Inventory. Results indicate the existence of a complain discourse among the wives, addressed towards their husbands, and at the same time an idealization of their own parents. Variable depression symptoms have been observed in our sample. Finally, the way women integrate psychologically the IVF experience is a relevant indicator of their psychological balance. As a conclusion, this study aims at being a research-action, which objective is to elaborate a clinical intervention at the service of women and couples, and suitable to this particular cultural context.

Le facteur de transcription homéotique Cdx2 est un suppresseur de tumeurs et son expression est réduite de manière hétérogène dans les tumeurs coliques. Or, le cancer colorectal demeure un problème de santé publique par sa fréquence et sa gravité. Au travers de 3 sous-projets, cette thèse visait à comprendre le mode d'action de Cdx2. Premièrement, la cadhérine Mucdhl a été identifiée et caractérisée en tant que nouvelle cible de Cdx2 : Mucdhl inhibe la croissance des cellules cancéreuses coliques et s'oppose à l'activité de la -caténine. Deuxièmement, un effet inattendu de Cdx2 sur le cytosquelette et la rigidité cellulaire a été montré. Ceci pourrait expliquer comment Cdx2 intervient dans l'organisation structurale des entérocytes ou la migration. En parallèle, une lignée cellulaire rapportrice de l'expression de Cdx2 a été créé qui, après validation, sera un outil précieux pour l'étude des mécanismes moléculaires qui conditionnent l'hétérogénéité tumorale. Par la mise en évidence de nouvelles fonctions et cibles de Cdx2, cette thèse permet de mieux appréhender son rôle physiologique et son action de suppresseur de tumeurs dans l'intestin.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

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