Notre génome est continuellement endommagé par des agents provoquant des lésions de l’ADN. Les cassures doubles brins de l’ADN (CDBs) sont les lésions les plus dangereuses. En effet, une CDB mal réparée peut mener à des aberrations de l’ADN pouvant conduire à l’apparition d’un cancer. Dans le but d’éviter les effets délétères des CDBs, nos cellules ont développé une voie de signalisation, nommée réponse aux dommages de l’ADN (RDA), permettant la détection des cassures et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire afin d’arrêter le cycle pendant la réparation des CDBs. Une des caractéristiques principales de la RDA est l’accumulation d’un grand nombre de facteurs sur l’ADN autour de la cassure, formant un foyer visible en microscopie. Cependant, l’efficacité de réparation de l’ADN est entravée par la structure condensée de la chromatine environnante. Les mécanismes de réparation de l’ADN surmontent ce problème en recrutant de nombreuses protéines permettant le réarrangement de la chromatine afin de faciliter la réparation. Le but de mon travail de thèse est d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine autour des CDBs. D’une part nous avons pour but d’identifier le protéome complet d’un foyer de réparation de l’ADN grâce à la technique PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci). D’autre part, nous étudions le rôle de l’oncoprotéine SET/TAF-1β, que nous avons identifié lors d’un criblage siRNA réalisé dans le but de découvrir de nouveaux facteurs chromatiniens impliqués dans la réparation des CDBs. / Various DNA damaging agents, that can cause DNA lesions, assault constantly our genome. The most deleterious DNA lesions are the breaks occurring in both strands of DNA (Double stand breaks: DSBs). Inefficient repair of DSBs can lead to aberrations that may induce cancer. To avoid these deleterious effects of DSBs, cells have developed signalling cascades which entail detection of the lesions and spreading of the signal that leads to arrest in cell cycle progression and efficient repair. A major characteristic of DNA damage response (DDR) is the accumulation of a vast amount of proteins around the DSBs that are visible in the cell as DNA damage foci. However, efficient DNA repair is hampered by the fact that genomic DNA is packaged into chromatin. The DNA repair machinery overcomes this condensed structure to access damaged DNA by recruiting many proteins that remodel chromatin to facilitate efficient repair. The aim of my PhD work is to identify novel proteinsinvolved in the DDR and/or the remodelling of chromatin surrounding DSBs. On one hand, we take advantage of the PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci) technique and we aim to identify the entire proteome of DNA repair foci. On the other hand, we study the role of the oncogene SET/TAFIβ, a major hit of a siRNA screen performed to identify novel chromatin related proteins that play role in repair of DSBs.

Dans les génomes bactériens, les fréquents transferts horizontaux de gènes (HGT) introduisent des innovations génomiques qui peuvent entraîner la diversification des populations bactériennes. À l'inverse, la recombinaison homologue (RH) au sein des populations homogénéise leurs génotypes, et ainsi renforce leur cohésion. Ces processus d'échange génétique, et la fréquence à laquelle ils interviennent au sein et entre les populations, doivent avoir un grand impact sur la cladogénèse bactérienne. Au-delà de la configuration des échanges qui se sont réellement produits entre les bactéries, les traces de RH et de HGT que nous observons dans leurs génomes reflètent les événements qui ont été fixés tout au long de leur histoire. Ce processus de fixation peut être biaisé en ce qui concerne la nature des gènes ou allèles qui ont été introduits. La sélection naturelle peut notamment conduire à la fixation des gènes transférés qui apportent de nouvelles adaptations écologiques. En outre, des biais mécaniques dans le processus de recombinaison lui-même peuvent conduire à la fixation d'allèles non-adaptatifs. Nous avons cherché à caractériser certains de ces processus adaptatifs et non-adaptatifs qui façonnent les génomes bactériens. À cette fin, plusieurs aspects de l'évolution des génomes, comme les variations de leurs répertoires de gènes, de leur architecture et de leur composition en nucléotides ont été examinés à la lumière de leur histoire de transfert et de recombinaison / In bacterial genomes, the frequent horizontal gene transfers (HGT) introduce genomic novelties that can promote the diversification of bacterial populations. In opposition, homologous recombination (HR) within populations homogenizes their genotypes, enforcing their cohesion. These processes of genetic exchange, and their patterns of occurrence among and within lineages, must have a great impact on bacterial cladogenesis. Beyond the pattern of exchanges actually occurring between bacteria, the traces of HR and HGT we observe in their genomes reflect what events were fixed throughout their history. This fixation process can be biased regarding the nature of genes or alleles that were introduced. Notably, natural selection can drive the fixation of transferred genes that bring new ecological adaptations. In addition, some mechanical biases in the recombination process itself may lead to the fixation of non-adaptive alleles. We aimed to characterize such adaptive and non-adaptive processes that are shaping bacterial genomes. To this end, several aspects of genome evolution, such as variations of their gene repertoires, of their architecture and of their nucleotide composition were examined in the light of their history of transfer and recombination

Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient 109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète de certains polluants toxiques pour l’environnement comme les composés organiques tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l’instant, pas cultivables in vitro. Mon travail s’inscrit dans le cadre d’une collaboration entre l’Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G. M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l’Ecole Centrale de Lyon. Nos partenaires à l’Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte de nouveaux gènes d’intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de la quinoléine présente dans les bactéries d’un sol de référence largement étudié au laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer une souche d’E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes recherchés dans un échantillon d’ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones de recombinaison qui vont jouer le rôle d’hameçons. Nous avons testé la capacité de Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule après l’ évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées pour améliorer l’efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop faible peut-être due à l’incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish. / As the development of metagenomic technologies in the past ten years, it is unquestionned that microorganisms encompass the largest resource of metabolic and genetic diversity in the world. Actually, one gramme of soil contains more than 109 bacteria and 103-104 species. Some of their members are able to carry out enzymatic reactions leading to the complete degradation of pollutants (such as quinoline). So, the biodegradation of some highly toxic or organic compounds by microorganisms will be a general trend for pollutant treatment. However, the huge reservoir of molecules and enzymes from microorganisms still need to be explored because more than 99% of microorganisms cannot be cultivated in vitro.My work was based on collaboration between the University SJTU and Ecole Centrale de Lyon. Our partners at the University SJTU have built a laboratory scale denitrification reactor which was capable of degrading quinoline by removing the chemical oxygen demand. A new tool called "Genefish" has been developed in our laboratory as an alternative method for metagenomics which aims to discover novel industrial or environmental genes of interest. Following the early work in our laboratory, my thesis is presented here in two parts.In the first part, we set up a quinoline microcosm experiment both under aerobic and anaerobic condition using reference soil extensively studied in the laboratory at Ecole Centrale de LYON. This work aimed to reveal the potential bacterial diversity and even genes responsible for quinoline degradation. We used RISA(Ribosomal intergenic Spacer analysis) to analyze the bacteria community structure changes and GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) was also used to detect the quinoline degradation and reveal potential quinoline metabolic pathways under aerobic and anaerobic condition. Results showed great bacteria community structure changes and high quinoline degradation activity after the quinoline addition under aerobic condition. The future work is to investigate the bacteria community which may be responsible for quinoline degradation using the technique of NGS (Next Generation Sequencing).The second object of my thesis was to use the Genefish tool to capture targeted genes (the bcr gene responsible for the quinoline degradation in the wastewater treatment bioreactor) from the soil metagenome. The aim was to construct an E.coli strain containing a capture plasmid and Red system for capturing targeted genes from metagenomic DNA by homologous recombination. The capture plasmid includes a toxic cassette consisting of two suicide genes which can be activated by chemical induction, finally support the positive recombinants selection. It also contains two multiply cloning sites in which highly conserved sequences were inserted and works as the bait during recombination. We have tested the capacity of Genefish to capture the PCR products of bcr gene; the efficiency was low because of the persistence of several copies of the capture plasmid into the Genefish strain after recombination events. So, three strategies were tried to improve the recombination efficiency: co-electroporation, plasmid segregation and mono-copy capture plasmid construction. Finally, the strategy of plasmid segregation works but the recombination efficiency was still low maybe caused by the uncertain model of homologous recombination. The further research will focus on the transfer of the toxic cassette and homologous arms into the host strain chromosome, this new strategy will exclude the bad effect of low copy number capture plasmid, uncertain model of λ Red induced homologous recombination and the homologous arms site in the capture plasmid which are the most important factors influencing the homologous recombination efficiency in Genefish.

Cette recherche clinique vise à explorer le retentissement de l'hypofertilité masculine et de la fécondation in vitro (FIV) sur le fonctionnement psychique des épouses dans le premier centre de consultation FIV en Egypte (1986), en contexte culturel égyptien. Près de 60% des couples qui consultent au Centre FIV présentent le diagnostic d'infertilité d'origine masculine. Nous nous intéressons à comprendre ce qui constitue la spécificité du fonctionnement psychique de ces femmes dans ce contexte culturel où l'infertilité masculine est une pathologie taboue, suscitant la honte familiale, et où seule la FIV homologue- utilisant les gamètes d'un couple marié- est autorisée par la loi. La première hypothèse renvoie à l'existence d'une souffrance psychique chez l'épouse liée au maintien du secret de l'hypofertilité masculine. La seconde hypothèse suppose que le diagnostic et les traitements médicaux sont accompagnés chez l'épouse d'une idéalisation oedipienne de ses propres parents. Notre échantillon est composé de dix femmes âgées de 20 à 40 ans inscrites dans un protocole FIV. Sur le plan méthodologique, nous nous sommes basés sur des entretiens de recherche semi-directifs et sur l'inventaire abrégé de dépression de Beck BDI-13. L'analyse des résultats met en évidence la présence chez les épouses d'un discours de plainte adressé envers leurs conjoints, en même temps que l'expression d'une idéalisation de leurs propres parents. La présence de symptômes de dépression variables est relevée dans l'échantillon. Enfin, la manière dont les femmes s'approprient subjectivement l'expérience de la FIV est un indicateur pertinent de leur équilibre psychique. Pour conclure, cette étude se veut être une recherche-action visant à mettre en place un dispositif clinique au service des femmes et des couples dans une institution médicale, et qui soit adapté à ce contexte culturel particulier. / This study aims at exploring the impact of male subfertility and In Vitro Fertilization (IVF) on the psychological functioning of a group of female spouses, in the first Egyptian IVF center in Egypt (1986), within the Egyptian cultural context. Approximately 60% of couples consulting at the Egyptian Center for IVF carry the diagnosis of male factor infertility. We are interested in understanding what constitutes the specificity of the psychological functioning of these women within this cultural context, where male infertility is a taboo pathology provoking family shame, and where only homologous IVF -using a married couple's gametes- is allowed by the law. The first hypothesis states that there is a specific female suffering related to the maintenance of the secret of male subfertility. The second hypothesis assumes that for the wife, the diagnosis disclosure and medical treatments are followed by an oedipal idealization of the her parents. Our sample is composed of ten women aged between 20 and 40 years old, and undergoing an IVF protocol. On the methodological aspect, we have used semi-structured interviews and the 13-Item Beck Depression Inventory. Results indicate the existence of a complain discourse among the wives, addressed towards their husbands, and at the same time an idealization of their own parents. Variable depression symptoms have been observed in our sample. Finally, the way women integrate psychologically the IVF experience is a relevant indicator of their psychological balance. As a conclusion, this study aims at being a research-action, which objective is to elaborate a clinical intervention at the service of women and couples, and suitable to this particular cultural context.

Cette recherche clinique vise à explorer le retentissement de l'hypofertilité masculine et de la fécondation in vitro (FIV) sur le fonctionnement psychique des épouses dans le premier centre de consultation FIV en Egypte (1986), en contexte culturel égyptien. Près de 60% des couples qui consultent au Centre FIV présentent le diagnostic d'infertilité d'origine masculine. Nous nous intéressons à comprendre ce qui constitue la spécificité du fonctionnement psychique de ces femmes dans ce contexte culturel où l'infertilité masculine est une pathologie taboue, suscitant la honte familiale, et où seule la FIV homologue- utilisant les gamètes d'un couple marié- est autorisée par la loi. La première hypothèse renvoie à l'existence d'une souffrance psychique chez l'épouse liée au maintien du secret de l'hypofertilité masculine. La seconde hypothèse suppose que le diagnostic et les traitements médicaux sont accompagnés chez l'épouse d'une idéalisation oedipienne de ses propres parents. Notre échantillon est composé de dix femmes âgées de 20 à 40 ans inscrites dans un protocole FIV. Sur le plan méthodologique, nous nous sommes basés sur des entretiens de recherche semi-directifs et sur l'inventaire abrégé de dépression de Beck BDI-13. L'analyse des résultats met en évidence la présence chez les épouses d'un discours de plainte adressé envers leurs conjoints, en même temps que l'expression d'une idéalisation de leurs propres parents. La présence de symptômes de dépression variables est relevée dans l'échantillon. Enfin, la manière dont les femmes s'approprient subjectivement l'expérience de la FIV est un indicateur pertinent de leur équilibre psychique. Pour conclure, cette étude se veut être une recherche-action visant à mettre en place un dispositif clinique au service des femmes et des couples dans une institution médicale, et qui soit adapté à ce contexte culturel particulier. / This study aims at exploring the impact of male subfertility and In Vitro Fertilization (IVF) on the psychological functioning of a group of female spouses, in the first Egyptian IVF center in Egypt (1986), within the Egyptian cultural context. Approximately 60% of couples consulting at the Egyptian Center for IVF carry the diagnosis of male factor infertility. We are interested in understanding what constitutes the specificity of the psychological functioning of these women within this cultural context, where male infertility is a taboo pathology provoking family shame, and where only homologous IVF -using a married couple's gametes- is allowed by the law. The first hypothesis states that there is a specific female suffering related to the maintenance of the secret of male subfertility. The second hypothesis assumes that for the wife, the diagnosis disclosure and medical treatments are followed by an oedipal idealization of the her parents. Our sample is composed of ten women aged between 20 and 40 years old, and undergoing an IVF protocol. On the methodological aspect, we have used semi-structured interviews and the 13-Item Beck Depression Inventory. Results indicate the existence of a complain discourse among the wives, addressed towards their husbands, and at the same time an idealization of their own parents. Variable depression symptoms have been observed in our sample. Finally, the way women integrate psychologically the IVF experience is a relevant indicator of their psychological balance. As a conclusion, this study aims at being a research-action, which objective is to elaborate a clinical intervention at the service of women and couples, and suitable to this particular cultural context.

Le médulloblastome est une des tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central chez l’enfant. Son impact clinique, ainsi que les effets secondaires engendrés par les traitements actuels, sont significatifs en matière de morbidité et de mortalité. La caractérisation moléculaire des tumeurs du système nerveux central a grandement évolué, et ce, particulièrement en ce qui concerne le médulloblastome. Des travaux antérieurs ont permis d’établir qu’un des sous-groupes de médulloblastome est caractérisé par l’activation de la voie sonic hedgehog. La mutation la plus fréquente menant à ce sous-type de médulloblastome est la mutation du gène suppresseur de tumeur PTCH1. Grâce au modèle de souris Ptch1+/-, des données issues de notre laboratoire ont permis de caractériser le développement de cette tumeur comme étant en deux étapes. Ce travail porte sur la caractérisation du mécanisme par lequel cette première étape, soit la perte d’hétérozygotie de Ptch1, survient. Tout d’abord, nous revisitons le rôle in vivo du corécepteur Boc dans la tumorigenèse. Selon nos résultats, la modulation de Boc ne semble pas avoir un impact significatif sur le développement tumoral dans des expériences de transplantation orthotopiques. Ensuite, nous démontrons que le ligand Shh augmente le dommage à l’ADN, ce qui mène à une hausse des évènements de recombinaisons qui peuvent causer une perte d’hétérozygotie. Nous tentons de moduler l’activité de Rad51 en observant une tendance non statistiquement significative des évènements de recombinaison avec des inhibiteurs de Rad51. Nous démontrons ensuite qu’un inhibiteur de Cdc7 permet la diminution des évènements de recombinaisons ainsi qu’une diminution du stress réplicatif de l’ADN. En intervenant sur le gène Mcm2 grâce à un modèle de souris transgénique, nous parvenons à prouver qu’une diminution de l’action de Mcm2 permet une diminution du stress réplicatif de l’ADN. En somme, la première étape du développement du médulloblastome sonic hedgehog-activé est la perte d’hétérozygotie de Ptch1. Celle-ci est caractérisée par une augmentation du dommage à l’ADN engendrant une hausse des évènements de recombinaison. Plusieurs cibles potentielles de modulation s’avèrent prometteuses pour un éventuel traitement ciblé. / Medulloblastoma is one of the most common central nervous system tumors of the child. Its clinical impact, as well as the adverse effects caused by current treatments, are significant in terms of morbidity and mortality. The molecular characterization of tumors of the central nervous system has greatly evolved, particularly in the case of medulloblastoma. Previous work has established that one of the medulloblastoma sub-groups is characterized by the activation of the sonic hedgehog (Shh) pathway. The most common mutation leading to this medulloblastoma subtype is the PTCH1 tumor suppressor gene mutation. Working with the Ptch1+/- mouse model, data from our la-boratory characterized the medulloblastoma tumorigenesis as a two-step process. This work focuses on the characterization of the mechanism by which this first step, the loss of heterozygosity of Ptch1, occurs. First, we revisit the in vivo role of the Boc coreceptor in the medulloblastoma tumor-igenesis. According to our results, Boc modulation does not seem to have a significant impact on tumor development. Next, we show that the Shh ligand increases DNA dam-age. This leads to an increase in recombination events which predispose to loss of het-erozygosity. We attempt to modulate Rad51 activity and observe a non-statistically sig-nificant trend to decrease recombination events with Rad51 inhibitors. We then demonstrate that Cdc7 inhibition reduces recombination events as well as DNA replica-tive stress. Using an Mcm2 transgenic mouse model, we demonstrate that a reduction in the action of Mcm2 reduces DNA replicative stress. To conclude, the first step in the development of Shh-activated medulloblastoma is the loss of heterozygosity of Ptch1. This is characterized by an increase in DNA damage leading to an increase in recombination events. Several potential modulation targets hold promise for possible targeted therapy.

Les sirtuines sont une famille conservée de déacétylases NAD+-dépendantes qui sont impliquées dans divers processus. Les humains possèdent 7 sirtuines (SIRT1-7) qui jouent un rôle dans plusieurs voies cellulaires, tandis que la levure Saccharomyces cerevisiae possède 5 membres (Sir2, Hst1-4) qui influencent plusieurs voies comme le cycle cellulaire ou le vieillissement. Une absence d’activité des sirtuines mène toutefois à des défauts de croissance, une thermosensibilité et l’apparition de dommages spontanés à l’ADN par des mécanismes mal élucidés. Pour mieux caractériser ce phénomène, ce mémoire met en lumière certains résultats venant d’un crible chimiogénétique réalisé par traitement au nicotinamide (NAM), un pan-inhibiteur des sirtuines. Nos résultats indiquent que le NAM entraîne chez la levure Saccharomyces cerevisiae une forte activation des voies de réponses aux dommages à l’ADN, et que les défauts de croissance sont principalement dus à l’hyperacétylation de la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56), une modification post-traductionnelle qui est renversée par les sirtuines Hst3 et Hst4. Lors d’hyperacétylation de H3K56, la protéine Slx4 et le complexe PP4 sont requis pour la croissance de la levure en modulant les niveaux d’activation de la kinase Rad53 lors de la RDA. Également, certains résultats préliminaires inclus dans ce mémoire mettent en évidence un rôle de l’activité des sirtuines dans la régulation de la recombinaison homologue, l’une des voies de réparation de l’ADN. Ensemble, nos résultats suggèrent que la déacétylation des histones par les sirtuines permet de moduler la réponse aux dommages à l’ADN en présence de stress réplicatif. / Sirtuins are a conserved family of NAD+-dependent deacetylases that are involved in various processes. Humans have seven sirtuins (SIRT1-7) and play a role in several cellular pathways, while the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has 5 members (Sir2, Hst1-4) and influence several pathways, such as the cell cycle or aging. Lack of sirtuin activity however leads to growth defects, thermosensitivity and spontaneous DNA damage by poorly understood mechanisms. To further characterize this phenomenon, this thesis highlights results obtained from a chemogenetic screen realized by treatment with nicotinamide (NAM), a pan-inhibitor of all sirtuins. Our results indicate that NAM causes strong activation of DNA damage-induced signaling in budding yeast Saccharomyces cerevisiae, and that growth defects are mainly due to histone H3 lysine 56 (H3K56) hyperacetylation, a post-translational modification reversed by sirtuins Hst3 and Hst4. During H3K56 hyperacetylation, the Slx4 protein and PP4 complex are both required for yeast growth by modulating the activation levels of Rad53 kinase during the DDR. Also, preliminary results included in this thesis highlight that proper regulation of homologous recombination, one of DNA repair pathways, is essential for growth in the presence of NAM-induced sirtuin inhibition. Together, our results suggest that chromosome-wide histone deacetylation by sirtuins can modulate DNA damage response in presence of replicative stress.

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation. / The genome of every cell is constantly subjected to stresses that could compromise its integrity. DNA double-strand breaks (DSB) are amongst the most damaging events for a cell and can lead to gross chromosomal rearrangements, cell death and cancer if improperly repaired. Homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ) are the main repair pathways responsible for the repair of DSBs. However, the mechanistic basis of both pathways is fundamentally different and the regulation of the choice between both for the repair of DSBs remains largely misunderstood. The Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) complex acts as a DSB first responder and contributes to repair by both homologous recombination and NHEJ. Being at the crossroads of both DSB repair pathways, the MRX complex is therefore in a convenient position to influence the repair choice. This thesis unravels two distinct phosphorylation systems modifying the MRX complex and specifically regulating repair by NHEJ. The first relies on cell cycle progression and inhibits NHEJ, while the second requires the presence of DNA damage and is necessary for efficient NHEJ. Together, our results suggest a model in which the MRX complex would act as an integrator of phospho-stimuli in order to regulate the DSB repair pathway choice.

Les topoisomérases (topos) de type IA jouent un rôle primordial dans le maintien et l’organisation du génome. Cependant, les mécanismes par lesquels elles contrôlent cette stabilité génomique sont encore à approfondir. Chez E. coli, les deux principales topoisomérases de type IA sont la topo I (codée par le gène topA) et la topo III (codée par le gène topB). Il a déjà été montré que les cellules dépourvues des topos I et III formaient de très longs filaments dans lesquels les chromosomes ne sont pas bien séparés. Comme ces défauts de ségrégation des chromosomes sont corrigés par l’inactivation de la protéine RecA qui est responsable de la recombinaison homologue, il a été émis comme hypothèse que les topoisomérases de type IA avaient un rôle dans la résolution des intermédiaires de recombinaison afin de permettre la séparation des chromosomes. D’autre part, des études réalisées dans notre laboratoire démontrent que le rôle majeur de la topoisomérase I est d’empêcher la formation des R-loops durant la transcription, surtout au niveau des opérons rrn. Ces R-loops on été récemment identifiés comme des obstacles majeurs à l’avancement des fourches de réplication, ce qui peut provoquer une instabilité génomique. Nous avons des évidences génétiques montrant qu’il en serait de même chez nos mutants topA. Tout récemment, des études ont montré le rôle majeur de certaines hélicases dans le soutien aux fourches de réplication bloquées, mais aussi une aide afin de supprimer les R-loops. Chez E. coli, ces hélicases ont été identifiées et sont DinG, Rep et UvrD. Ces hélicases jouent un rôle dans la suppression de certains obstacles à la réplication. Le but de ce projet était de vérifier l’implication de ces hélicases chez le mutant topA en utilisant une approche génétique. Étonnamment, nos résultats montrent que la délétion de certains de ces gènes d’hélicases a pour effet de corriger plutôt que d’exacerber des phénotypes du mutants topA qui sont liés à la croissance et à la morphologie des nucléoides et des cellules. Ces résultats sont interprétés à la lumière de nouvelles fonctions attribuées aux topoisomérases de types IA dans la stabilité du génome. / Type 1A topoisomerases (topos) play a vital role in the maintenance and organization of the genome. However, the mechanisms by which they control genome stability still remain to be explored. In E. coli, the two type IA topoisomerases are topo I (encoded by topA) and topo III (encoded by topB). It has been shown that cells lacking topo I and III form very long filaments in which the chromosomes are not well separated. As the chromosome segregation defects are corrected by inactivation of the RecA protein, that is responsible for homologous recombination, it has been hypothesized that type IA topoisomerases have a role in the resolution of recombination intermediates to allow chromosome segregation. On the other hand, studies in our laboratory have shown that the major role of topoisomerase I is to prevent the formation of R-loops during transcription, especially at the rrn operons. These R-loops have been recently identified as major roadblocks to the progression of replication forks, which can cause genomic instability. We have genetic evidence suggesting similar effects may occur in our topA mutants. More recently, studies have shown the important role of certain helicases in eliminating roadblocks for replication forks that could sometimes be R-loops. In E. coli, these helicases have been identified and they are DinG, Rep and UvrD. The purpose of this project was to study the roles of these helicases in our topA mutant, using a genetic approach. Surprisingly, our results show that deletions of some of these genes have the effect of correcting rather than exacerbating topA mutant phenotypes that are related to the growth and cell and nucleoid morphology. These results are interpreted in the light of new functions assigned to the type IA topoisomerases in genome stability.

L’acétylation est une modification post-traductionnelle des protéines essentielles. Elle est impliquée dans bon nombre de processus cellulaires importants comme la régulation de la structure de la chromatine et le recrutement de protéines. Deux groupes d’enzymes, soient les lysines acétyltransférases et les lysines désacétylases, régulent cette modification, autant sur les histones que sur les autres protéines. Au cours des dernières années, de petites molécules inhibitrices des désacétylases ont été découvertes. Certaines d’entre elles semblent prometteuses contre diverses maladies telles le cancer. L’acide valproïque, un inhibiteur de deux des trois classes des désacétylases, a un effet antiprolifératif chez plusieurs organismes modèles. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à cet effet restent encore méconnus. Ce mémoire met en lumière l’effet pH dépendant de l’acide valproïque sur différentes voies cellulaires importantes chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il démontre que ce composé a la capacité d’inhiber la transition entre les phases G1 et S par son action sur l’expression des cyclines de la phase G1. De plus, il inhibe l’activation de la kinase principale de la voie activée suite à un stress à la paroi cellulaire. L’acide valproïque occasionne également un arrêt dans la réplication de l’ADN sans y causer de dommage. Il s’agit là d’un effet unique qui, à notre connaissance, n’est pas observable avec d’autres agents qui inhibent la progression en phase S. / Acetylation is an essential post-translational modification involved in many important cellular processes such as regulation of chromatin structure and proteins interactions. Two enzyme families, lysine acetyltransferases and lysine deacetylases, allow proper regulation of this modification both on histones and non-histones proteins. In recent years, the discovery of small deacetylase inhibitors has led to promising novel therapy in the treatment against various diseases such as cancer. Valproic acid, a class I and II deacetylase inhibitor, has been shown to have antiproliferative effects in various models. However, the cellular mechanisms underlying this effect remain unknown. This thesis highlights the pH-dependent effects of VPA on numerous important cellular pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Our results demonstrate that VPA inhibits the transition from G1 to S phase of the cell cycle by its action on the expression of G1 cyclins. Moreover, VPA inhibits the activation of the main kinase involved in the cell wall integrity pathway. Furthermore, VPA exposure also leads to DNA replication arrest in a DNA damage-independent manner. This is a unique effect that, to our knowledge, is not observable with other agents that inhibit S phase progression.