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Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient 109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète de certains polluants toxiques pour l'environnement comme les composés organiques tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l'instant, pas cultivables in vitro. Mon travail s'inscrit dans le cadre d'une collaboration entre l'Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G. M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l'Ecole Centrale de Lyon. Nos partenaires à l'Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte de nouveaux gènes d'intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de la quinoléine présente dans les bactéries d'un sol de référence largement étudié au laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer une souche d'E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes recherchés dans un échantillon d'ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones de recombinaison qui vont jouer le rôle d'hameçons. Nous avons testé la capacité de Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule après l' évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées pour améliorer l'efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop faible peut-être due à l'incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish.

La stabilité génomique des organelles de plantes suscite un grand intérêt dans le domaine de la biologie végétale. En effet, plusieurs études récentes suggèrent que ce type d’instabilité génomique pourrait mener à l’isolation de traits intéressants en l’agronomie. Plusieurs protéines sont d’ailleurs déjà été identifiés comme étant impliqués dans le maintien de la stabilité de ces génomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protéines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le génome nucléaire d’Arabidopsis thaliana encode trois protéines s’apparentant à la Recombinase A bactérienne et qui sont ciblées à la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gènes partagent une similarité de séquence de 61% avec leur homologue bactérien chez Escherichia coli. Chez les bactéries ces protéines jouent un rôle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Chez Arabidopsis, il a été démontré que RECA2 et RECA3 sont nécessaires au maintien de l’intégrité du génome mitochondriale. Toutefois leur contribution à la stabilité du génome chloroplastique ainsi que le rôle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de déterminer la contribution éventuelle des protéines RECA d’Arabidopsis dans la réparation de l’ADN chloroplastique et plus précisément le rôle du gène RECA1. Nous énonçons l’hypothèse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactériens en étant impliqués dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tenté d’isoler des lignées mutantes pour chacun des gènes RECA d’Arabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignées convenables pour notre étude que dans le cas du gène RECA1. Ces lignées ont été utilisées pour évaluer la contribution de ce gène à la stabilité du génome du chloroplaste. Ensuite, pour étudier la relation épistatique des gènes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des différentes lignées mutantes pour ces gènes a été réalisé. Nous avons ensuite étudié la sensibilité de toutes ces lignées mutantes à la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons testé la présence de réarrangements dans le génome du chloroplaste en condition normal ou en présence de stress génotoxique. Nos résultats démontrent que les protéines Whirly et RECA1 sont impliquées dans deux voies de réparation de l’ADN différentes et que les Whirly sont suffisantes pour s’occuper des bris d’ADN double brin en l’absence de RECA1. Nous démontrons également que l’absence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantité de réarrangements dans le génome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymérase POLIB est impliquée dans la même voie de réparation que RECA1. Finalement nous proposons un modèle pour expliquer nos résultats et impliquons RECA1 dans un mécanisme de réparation d’ADN et aussi un rôle potentiel dans la réplication. / The stability of plant organelles genomes elicits a great interest in the domain of plant biology. In fact, numerous studies suggest that genomic instability can lead to the isolation of interesting traits in the field of agronomy. Some factors such as MSH1, the POLI family, OSB1, the Whirly proteins and the Recombinase A (RECA), have already been identified has being implicated in the maintenance of genome stability. The nuclear genome of Arabidopsis thaliana encodes three proteins, RECA1, RECA2 and RECA3, that shares a high resemblance with bacterial Recombinase A. They are targeted to the mitochondria and/or to the chloroplast. Globally, these genes share a similarity of sequence of 61% with their bacterial homologue in Escherichia coli. In bacteria these proteins play an essential part in homologous recombination and are implicated in DNA repair. In Arabidopsis, RECA2 and RECA3 have been shown as being essential to maintain the integrity of the mitochondrial genome but their contribution to the stability of the chloroplast as well as the role of RECA1 remains obscure. The goal of this project is to establish the eventual contribution of the Arabidopsis RECA proteins in the repair of chloroplast DNA and more precisely the role of the RECA1 gene. We propose the hypothesis that plants RECA act in the same fashion as their bacterial orthologues by being implicated in homologous recombination. Within the framework of this project, we have attempted to isolate mutant lines for each RECA gene of Arabidopsis. In the end, we were able to obtain appropriate lines for our study only for the RECA1 gene. These lines were then used to evaluate the contribution of the gene to chloroplast genome stability. Afterwards, in order to study the epistatic relationship between the RECA1, WHY1 and WHY3 genes, a cross between different mutant lines of these genes was realised. We then studied the sensitivity of all of those mutant lines to ciprofloxacine, an agent causing double stranded breaks exclusively in plant organelles. Finally, we evaluated the presence of rearrangements in the chloroplast genome under normal conditions and under the presence of a genotoxic stress. Our v results show that the Whirly and RECA1 proteins are implicated in two separate pathways of DNA reparation and that the Whirly proteins are sufficient to take in charge DNA double strand breaks generated by the absence of RECA1. We also demonstrate that the absence of Whirly and RECA1 causes an increasein the quantity of rearrangements in the chloroplast genome. Furthermore, we propose that the polymerase POLIB is implicated in the same repair pathway as RECA1. Finally we propose a model to explain our results and implicate RECA1 in a DNA repair mechanism and propose a role for RECA1 in DNA replication.

L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.

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Le facteur de transcription homéotique Cdx2 est un suppresseur de tumeurs et son expression est réduite de manière hétérogène dans les tumeurs coliques. Or, le cancer colorectal demeure un problème de santé publique par sa fréquence et sa gravité. Au travers de 3 sous-projets, cette thèse visait à comprendre le mode d’action de Cdx2. Premièrement, la cadhérine Mucdhl a été identifiée et caractérisée en tant que nouvelle cible de Cdx2 : Mucdhl inhibe la croissance des cellules cancéreuses coliques et s’oppose à l’activité de la -caténine. Deuxièmement, un effet inattendu de Cdx2 sur le cytosquelette et la rigidité cellulaire a été montré. Ceci pourrait expliquer comment Cdx2 intervient dans l’organisation structurale des entérocytes ou la migration. En parallèle, une lignée cellulaire rapportrice de l’expression de Cdx2 a été créé qui, après validation, sera un outil précieux pour l’étude des mécanismes moléculaires qui conditionnent l’hétérogénéité tumorale. Par la mise en évidence de nouvelles fonctions et cibles de Cdx2, cette thèse permet de mieux appréhender son rôle physiologique et son action de suppresseur de tumeurs dans l’intestin. / Colorectal cancer is a major public health problem because of its frequency and propensity to metastasize. Cdx2 plays the role of a tumor suppressor and its expression is frequently but heterogeneously reduced in colon tumors. Through three sub-projects, this thesis aimed to better understand the mode of action of Cdx2. First, the Cadherin Mucdhl was identified and characterized as a new direct target gene of Cdx2. Mucdhl was also shown to inhibit the growth of colon cancer cells and to oppose -catenin activity. Second, an unexpected effect of Cdx2 on the cell cytoskeleton and rigidity of a cancer cell monolayer was uncovered. This gives new clues about how Cdx2 contributes to the structural organization and differentiation of enterocytes but also nhibits cell migration. In parallel, a reporter cell line for Cdx2 expression was created. After its validation, this cell line will be a precious tool to study the molecular mechanisms underlying tumor heterogeneity in vivo. Altogether, this thesis unraveled new functions and target genes of Cdx2 that permit to better apprehend its physiological function and its action as a tumor suppressor in the intestine.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops representam cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Um componentes presente em venenos de serpentes são as fosfolipases A2 (PLA2s), que podem apresentar diversas atividades biológicas. Diversos estudos com PLA2s e PLA2s-homólogas de venenos de serpentes buscam melhor compreender o mecanismo da ação miotóxica, sugerindo diferentes sítios de ação. Neste trabalho, são apresentados estudos com PLA2s-homólogas do veneno de Bothrops moojeni, conhecida popularmente como caiçaca. A miotoxina II (MjTX-II) foi estudada na forma nativa, complexada com ácidos graxos e os inibidores ácido rosmarínico e suramina, enquanto a miotoxina I (MjTX-I) foi estudada em complexo com o ligante suramina. Para a obtenção dos dados, foram utilizadas diferentes técnicas biofísicas como espalhamento dinâmico de luz, calorimetria por titulação isotérmica e cristalografia de raios X. Estes estudos foram complementados com estudos funcionais por técnicas miográficas e estudos computacionais por dinâmica molecular realizados por outros membros do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural. As estruturas cristalográficas da MjTX-II nativa e complexada com ácidos graxos revelaram particularidades para esta toxina, como a independência da ligação de ácidos graxos na estrutura para a sua ativação - alinhamento dos resíduos importantes para a atividade miotóxica. A estrutura da MjTX-II com o ácido rosmarínico revelou que o ligante interage com uma das regiões rela... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops genus represents approximately 90% of the ophidian accidents that occur in Brazil. One of the compounds of the venom is the phospholipases A2 (PLA2s), which are proteins with a wide range of biological activities. Several studies with PLA2s and PLA2-homologues from snake venom were performed to better understanding the myotoxic mechanism, suggesting different activity sites. This work presents studies with PLA2s-homologues isolated from Bothrops moojeni, known in Brazil as caiçaca. The myotoxin II (MjTX-II) was studied in native, complexes to fatty acids, rosmarinic acid and suramin inhibitors. Myotoxin I (MjTX-I) was studied complexed to suramin. X-ray crystallography, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry were used to characterize the protein and complexes. Furthermore, functional studies by myographic techniques and computational studies using molecular dynamics were performed by other members of the Laboratory. Crystallographic structures of MjTX-II in native form and complexes to fatty acids reveals particularities for these toxin, such as the independence of the fatty acids binding for myotoxic residues alignment. The structure of MjTX-II complexed to rosmarinic acid showed that this ligand interact to a of regions related to myotoxic activity of toxin, which probably explaining its inbitory action demonstrated by myographic techniques and is according to previous proposed mechanism. Crystallographic data of the MjTX-II/suramin complex s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Les modifications post-traductionnelles des protéines par des polymères d’ADP-ribose (PAR) ou par phosphorylation permet l’assemblage des complexes de la réparation de l’ADN à la chromatine endommagée dont les fonctions sont essentielles pour assurer le maintien de la stabilité du génome. En réponse aux lésions de l’ADN, l’activité de synthèse de PAR des protéines PARP1 et PARP2 est fortement stimulée. Les PAR servent de signalisation pour le recrutement de multiples protéines, dont la protéine plateforme XRCC1.Les études menées au cours de cette thèse ont porté sur l’étude de la régulation des fonctions des protéines PARP1, PARP2 dans la réparation des cassures double brins (CDB) et l’étude des modifications de XRCC1 par phosphorylation en réponse à des dommages de l’ADN. En utilisant des substrats permettant de mesurer l’efficacité des différentes voies de réparation des CDB, nous avons démontré que PARP2, et non PARP1, est impliqué dans la régulation du choix des voies de la réparation des CDB. Plus spécifiquement, nous avons montré que PARP2 stimule l’initiation de la résection des extrémités des CDB dépendante de CtIP, indépendamment de son activité catalytique. Par des approches de vidéo-microscopie, nous avons pu déterminer que PARP2 limite l’accumulation de 53BP1 aux sites de dommages induits par micro-irradiation laser. Nous proposons que la protéine PARP2, en limitant le recrutement de la protéine 53BP1 aux sites de dommages, favorise la réparation des CDB dépendante de la résection des extrémités d’ADN, au détriment de la voie canonique de jonction des extrémités. Ces résultats sont les premiers démontrant un rôle de PARP2 dans le choix des voies de réparation des CDB.En parallèle, nous avons analysé comment la phosphorylation régule les fonctions de la protéine XRCC1. Par des approches in vitro et in vivo, nous avons pu déterminer que l’interdomaine 1 de XRCC1 est phosphorylé par la kinase CDK5. En réponse aux dommages induits par un agent alkylant, XRCC1 est activement déphosphorylé in vivo. De plus, nous avons observé que lorsque l’interdomaine 1 ne peut pas être phosphorylé in vitro, l’interaction de XRCC1 avec les PAR synthétisés par PARP1 et PARP2 augmente, et le recrutement de XRCC1 aux sites de dommages de l’ADN est accru. Ces résultats indiquent pour la première fois que la déphosphorylation de XRCC1 en réponse à un stress génotoxique participe activement à son recrutement aux sites de dommages.Dans leur ensemble, ces travaux ont contribué à améliorer nos connaissances fondamentales des réseaux de protéines impliquées dans la prise en charge des dommages de l’ADN. La compréhension de ces mécanismes est essentielle non seulement car ils participent au maintien de la stabilité du génome mais aussi du fait du développement exponentiel de nouvelles stratégies anti-tumorales qui visent à inhiber les voies de la réparation dans la but de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. / Post-translational modifications of proteins by polymers of ADP-ribose (PAR) or by phosphorylation allow the assembly of DNA repair protein complexes at damaged chromatin and are crucial to ensure genome stability. In response to DNA insults, the synthesis of PAR by the PARP1 and PARP2 proteins is strongly induced. PAR act as a signaling platform for the recruitment of multiples proteins at the sites of DNA damages, including the scaffold protein XRCC1. Research conducted during this PhD have been focused on studying the regulation of PARP1 and PARP2 functions in double-strands break repair (DSBR), and in investigating the role of XRCC1 modifications by phosphorylation in response to DNA damage.Using DNA repair assay allowing us to assess the accuracy of the different DSBR pathways, we demonstrated that PARP2, and not PARP1, is involved in the regulation of DNA double-strands break repair pathway choice. More precisely, we showed that PARP2 stimulates CtIP dependent initiation of end-resection at DSB, independently of its catalytic activity. By live cell imaging, we were able to determine that PARP2 limit 53BP1 accumulation at DNA damage sites induced by laser-microirradiation. We propose that by limiting 53BP1 accumulation at DNA damage sites, PARP2 stimulate DSB repair pathway that depend on DNA end-resection, thus counteracting the canonical end-joining pathway. These results are the first demonstrating a role for PARP2 in DNA DBSR pathway choice.In addition, we analyzed how the functions of XRCC1 are regulated by phosphorylation. Using in vitro and in vivo approaches, we were able to demonstrate that the linker 1 region of XRCC1 is phosphorylated by the CDK5 kinase. XRCC1 is actively dephosphorylated in response to DNA damage induced by an alkylating agent in vivo. We also observed that when the linker 1 cannot be phosphorylated, the XRCC1 interaction between the PAR synthetized by PARP1 and PARP2 is stimulated, and XRCC1 recruitement at the sites of DNA damage is far more efficient. These evidences indicate for the first time that the dephosphorylation of XRCC1 actively participate in its recruitment at the site of DNA damage. Put together, this work contributed to strengthen our fundamental knowledge of the protein network involved in the DNA damage response. Knowledge of those mechanisms is crucial since they participate in maintaining genome stability, and because new antitumoral drugs targeting DNA repair pathways in the attempt to specifically killed tumor cells are exponentially released.

Les réarrangements permettent une évolution rapide du génome par l’acquisition de séquences codantes exogènes, la perte de fonctions non-essentielles ou la création de nouvelles organisations génomiques. Différents mécanismes de réarrangements impliquant des éléments génétiques mobiles (EGM) ont été identifiés chez les archées, les bactéries et les eucaryotes. En revanche, on ignore l’origine des nombreuses inversions génomiques détectées pour les espèces du genre archéen Thermococcus. Mes travaux de thèse visent à améliorer la compréhension de l’évolution génomique chez les Thermococcales à travers l’étude de deux familles d’EGM : les familles de plasmides pTN3 et pT26-2. Plus précisément, je me suis intéressée aux recombinases à tyrosine (ou intégrases) que ces plasmides encodent et qui permettent leur intégration dans le chromosome de l’hôte. J’ai montré que l’intégrase plasmidique Intᵖᵀᴺ³ est responsable d’inversions dans le chromosome de son hôte Thermococcus nautili grâce à une activité catalytique inédite de recombinaison homologue. J’ai par la suite caractérisé deux autres intégrases de Thermococcales reliés phylogénétiquement à Intᵖᵀᴺ³ dont seulement une présente une activité de recombinaison homologue. La comparaison de leurs séquences primaires et la résolution de la structure de Intᵖᵀᴺ³ vont maintenant éclairer les déterminants génétiques responsables de la spécificité de site et de l’activité de recombinaison homologue. Les trois intégrases appartiennent à une classe de recombinases spécifique des archées qui catalyse une intégration suicidaire. Lors de l’intégration, le gène de l’intégrase est fragmenté et probablement désactivé. L’EGM intégré se retrouve piégé dans le chromosome. Les avantages évolutifs d’une telle activité suicidaire restent pour l’instant mystérieux. J’ai identifié 62 intégrases hyperthermophiles suicidaires et reconstruit leur histoire évolutive. Ces intégrases sont très prévalentes et recrutées par différents EGM. De plus, j’ai montré que l’une de ces intégrases présente in vitro une activité de recombinaison site-spécifique à des températures proches de l’ébullition de l’eau, représentant un avantage dans les environnements hyperthermophiles. / Genomes rapidly evolve through rearrangements that can generate new genome organizations or lead to the acquisition of foreign coding sequences or the loss of non-essential functions. Several mechanisms of rearrangement were uncovered for Archaea, Bacteria and Eukaryotes that involve mobile genetic elements (MGE). Species from the archaeal genera Thermococcus present numerous genomic inversions but none of the previously known inversion drivers. To better understand the genomic evolution of Thermococcales, I investigated two of their MGE families: the pTN3 and pT26-2 plasmid families. Specifically, I focused on the tyrosine recombinases (or integrase) that these plasmids encode and that catalyze their site-specific integration in the host chromosome. I demonstrated that the plasmidic integrase Intᵖᵀᴺ³ is responsible for chromosomal inversions in the host Thermococcus nautili through an unprecedented homologous recombination catalytic activity. I also characterized two other related Thermococcus integrases and only one catalyzes homologous recombination. The structure resolution of Intᵖᵀᴺ³ and primary sequence comparisons will now provide clues about the genetic determinants of site specificity and of the homologous recombination activity. The three integrases all belong to an archaeal-specific class of integrases that catalyzes a suicidal integration. The integrase gene is partitioned and presumably inactivated upon integration. The integrated MGE is then trapped into the chromosome. The evolutionary benefits of this suicide activity are puzzling. I identified 62 related suicidal hyperthermophilic integrases and reconstructed their evolutionary history. They are highly prevalent and recruited by diverse MGE. I also showed that one of these integrases can catalyze in vitro site-specific recombination at near boiling water temperature, representing an advantage in hyperthermophilic environments.

Mes travaux de thèse concernent le rôle du récepteur D1 de la dopamine dans les dyskinésies L-dopa induites, effets secondaires extrêmement handicapants du traitement de la maladie de Parkinson. En condition de dénervation striatale mimant l’environnement de la maladie de Parkinson, le traitement chronique par la L-dopa entraine des altérations majeures du trafic intraneuronal et de la signalisation du récepteur D1 de la dopamine dans les principaux neurones cibles de la dopamine, les neurones épineux de taille moyenne du striatum. Il existe en particulier une hypersensibilisation des récepteurs D1 dans les neurones striataux, avec une abondance accrue à la membrane plasmique et une diminution du niveau d’expression de la protéine GRK6 (Protéine kinase des Récepteurs Couplés aux Protéines G 6), un des acteurs clefs des phénomènes de désensibilisation, en relation directe avec l’apparition des dyskinésies.C’est dans ce contexte que se situe mon travail de thèse qui a eu pour objectif de mettre à profit et/ou de développer différents modèles expérimentaux et outils « in vivo » et « in vitro ». Nous avons associé des techniques d’imagerie cellulaire et tissulaire à des approches comportementales, afin d’explorer certains des événements cellulaires et moléculaires à l’échelle du neurone striatal et des réseaux neuronaux, reliant le niveau d’expression du récepteur D1, sa compartimentation cellulaire, son trafic intraneuronal et les dyskinésies ou des conditions pharmacologiques équivalentes.Nous avons confirmé dans le modèle du rat lésé unilatéralement à la 6-OHDA, traité par la L-dopa et développant des mouvements anormaux analogues aux dyskinésies chez l’homme, que le récepteur D1 est anormalement abondant à la membrane plasmique des neurones du striatum, alors qu’il devrait être internalisé après stimulation par son ligand naturel, la dopamine. Nous avons mis en évidence que les mécanismes d’internalisation après stimulation par un agoniste restent néanmoins fonctionnels. Après administration de l’agoniste D1, chez les animaux dyskinétiques, l’abondance des récepteurs D1 augmente dans les compartiments notamment impliqués dans les mécanismes d’internalisation et de transport (vésicules) et de dégradation (corps multivésiculaires). Nous avons apporté une explication possible à cette abondance anormale et à ce défaut d’internalisation, en montrant qu’ils pourraient être dus à une hétérodimérisation entre les récepteurs D1 et D3. La co-activation des récepteurs D1 et D3 par la L-dopa favoriserait l’ancrage du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux.Dans ce cadre, l’abord de l’étude de l’implication du protéasome dans la régulation de l’expression du récepteur D1 de la dopamine nous a semblé particulièrement important, sur la base des premières études soulignant l’implication de ce système catalytique dans le contrôle de l’activité et du métabolisme des récepteurs aux neurotransmetteurs. Nous avons révélé pour la première fois des liens entre l’activité catalytique du protéasome et la dynamique intraneuronale du récepteur D1 et plus particulièrement nous avons montré que son activité chymotrypsine-like est réduite de façon spécifique dans le striatum d’animaux dyskinétiques, comme une conséquence directe d’une déplétion en dopamine associée à une hyperstimulation dopaminergique.Nous avons testé en situation expérimentale une stratégie « thérapeutique » nouvelle en restaurant le mécanisme de désensibilisation homologue du récepteur D1 de la dopamine, par correction du déficit de la kinase GRK6 par transfert du gène correspondant via l’injection intrastriatale d’un vecteur lentiviral. Nous avons montré que cette approche permet de réduire considérablement la sévérité des dyskinésies dans les modèles rat et primate non-humain, analogues des dyskinésies chez l’homme et qu’elle restaure les effets thérapeutiques de la L-dopa. Ces effets sont la conséquence de la restauration des mécanismes de désensibilisation homologue : la surexpression de GRK6 entraîne l’internalisation spécifique des récepteurs D1. L’ensemble de nos résultats s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle menée depuis plusieurs années au laboratoire allant de la cellule au patient, avec pour but de transposer la compréhension des données expérimentales concernant les anomalies de l’expression du récepteur D1 de la dopamine en stratégies thérapeutiques dans les dyskinésies L-dopa induites. Nos investigations montrent qu’il est possible d’agir sur l’expression du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux de manière indirecte, en manipulant trois co-activateurs de son métabolisme, pour espérer réduire « in fine » la sévérité des dyskinésies. / In my thesis work, I studied the role of dopamine D1 receptor in L-dopa induced dyskinesia, a debilitating complication of Parkinson's disease’s treatment. In condition of striatal denervation, that mimics the Parkinson's disease environment, chronic treatment with L-dopa leads to major alterations of intraneuronal trafficking and dopamine D1 receptor signaling in the major target of dopamine neurons, the striatal medium spiny neurons. In particularly, there is a D1 receptor hypersensitivity in striatal neurons, with an increased abundance of D1 receptor at the plasma membrane and a decreased level of GRK6 protein expression, a key actor in desensitization mechanism, directly related with the apparition of dyskinesia.In this context, I used different in vitro and in vivo experimental models and tools. I have associated cell and tissue imaging techniques and behavioural approaches in order to explore cellular and molecular events in striatal neuron and neuronal networks, linking the D1 receptor expression level, its cellular compartmentalization, its intraneuronal trafficking and the dyskinesia behaviour or equivalent pharmacological conditions.We confirmed in the rat analog of L-dopa-induced dyskinesia, i.e., the L-dopa-induced abnormal involuntary movements in unilaterally 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned animals, that D1 receptor is abnormally abundant in the plasma membrane of neurons in the striatum, whereas it should be internalized after stimulation by its natural ligand, the dopamine. We showed that nevertheless the internalization mechanisms after agonist stimulation remains functional. After D1 agonist administration in dyskinetic animals, D1 receptor abundance increases in the cytoplasmic compartments involved in the internalization and transport (vesicles) and degradation (multivesicular bodies) mechanisms. Based on D3 receptor antagonist experiment, we propose that this abnormal abundance and this lack of internalization could be due to heterodimerization between the D1 and D3 receptors. D1 and D3 receptors co-activation by L-dopa might anchor D1 receptor at the plasma membrane of striatal neurons.In this context, analysis of proteasome involvement in the regulation of dopamine D1 receptor expression seemed particularly important, on the basis of the first studies underlying proteasome involvement in the activity and metabolism of neurotransmitter receptors. We demonstrated for the first time links between the proteasomal catalytic activity and D1 receptor intraneuronal dynamics and more particularly we showed that the proteasome chymotrypsin-like activity is reduced specifically in the striatum of dyskinetic animals, as a direct consequence of dopamine depletion associated with dopaminergic hyperstimulation.We tested in experimental condition, a new "therapeutic"strategy in order to restore the dopamine D1 receptor homologous desensitization mechanism, correcting the GRK6 kinase deficit by gene transfer through the intrastriatal injection of a lentiviral vector. We showed that this approach reduces significantly the dyskinesia severity in rat and non-human primate models and restores the L-dopa therapeutic effects. These effects are a consequence of the homologous desensitization mechanisms restoration : indeed GRK6 overexpression provokes specific D1 receptor internalization.Our results are part of a translational research conducted over several years in the laboratory from cell to patient, in order to translate our increased understanding of D1 receptor function abnormalities into therapeutic strategies for L-dopa induced dyskinesia. Our investigations show that it is possible to act on D1 receptor expression at the plasma membrane of striatal neurons via various routes, all resulting into diminished dyskinesia severity.