Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La réplication de l’ADN est un phénomène physiologique essentiel à la transmission du patrimoine génétique mais est aussi une source importante de stress endogène. Le stress réplicatif peut conduire à une instabilité génomique et a été mis en évidence à une étape très précoce du développement tumoral et de la sénescence. La recombinaison homologue (RH) est un processus de réparation qui permet la prise en prise en charge du stress réplicatif. De ce fait, un défaut de RH devrait permettre de révéler les stress réplicatifs endogènes. Ainsi, une progression ralentie des fourches de réplication a été observée dans des cellules déficientes pour la RH (RH-), et ce en absence de tout traitement exogène (Daboussi 2008). De plus, de nombreux travaux ont mis en évidence la présence de défauts mitotiques dans les cellules RH-, en absence de tout traitement exogène (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier 2011; Rodrigue 2013). L’origine de ces défauts mitotiques spontanés reste peu claire. En effet, la RH étant un processus préférentiellement actif au cours des phases S et G2, le lien avec la mitose reste à éclaircir. Cette thèse a pour but de comprendre l’impact du stress réplicatif très faible ou endogène sur les phases post-réplicatives du cycle cellulaire. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l’impact de ce stress sur la mitose. Les résultats obtenus montrent que le traitement des cellules contrôle à de très faibles doses d’hydroxyurée (HU) n’affecte pas la progression dans le cycle cellulaire mais induit cependant une diminution de la vitesse de réplication, comparable à celle observée dans les cellules RH-. De plus le traitement des cellules contrôle à des faibles doses d’HU induit l’apparition de défauts mitotiques, notamment des centrosomes surnuméraires, à la même fréquence que dans les cellules RH- non traitées. Inversement, l’ajout de précurseurs de nucléotides dans les cellules RH- permet de supprimer la diminution de la vitesse de réplication ainsi que les centrosomes mitotiques surnuméraires. Ainsi, un stress réplicatif subtil, qui n’impacte pas de façon détectable la progression dans les phases S et G2 du cycle cellulaire, ni l’entrée en mitose, cause cependant des défauts mitotiques sévères. De façon importante, les centrosomes mitotiques surnuméraires peuvent entrainer des mitoses multipolaires, impactant ainsi l’ensemble du génome. Ces données mettent en évidence la connexion qui existe entre la réplication des chromosomes et leur ségrégation. Dans un second temps, j’ai étudié l’impact du stress réplicatif faible ou endogène en phase G2. Cette étude a été réalisée en utilisant des cellules RH-, ainsi qu’un modèle d’induction de faible stress réplicatif après traitement à très faible dose d’HU. La présence de foyers pRPA-Ser33 en phase G2 a été observée dans ces deux modèles, mettant en évidence des zones de stress réplicatif. Après traitement à très faible dose d’HU, nous observons également la présence en phase G2 de foyers 53BP1 et RAD51 qui colocalisent partiellement avec les foyers pRPA-Ser33. L’analyse en spectrométrie de masse après co-immunoprécipitation de la protéine 53BP1 en phase G2 a permis d’établir un lien avec des protéines impliquées dans le contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique ainsi que dans le points de contrôle mitotique, étayant ainsi le lien entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques. Pour finir, l’immunoprécipitation de la chromatine liée à la protéine pRPA-Ser33 en phase G2, suivie d’un séquençage (ChIPseq), a permis de révéler l’absence d’enrichissement au niveau des sites fragiles communs et de mettre en évidence un enrichissement au niveau des régions promotrices de certains gènes, notamment de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent le lien entre le stress réplicatif très faible ou endogène et l’instabilité chromosomique, qui peut mener à l’initiation tumorale. / DNA replication is a physiological process, essential for genetic information transmission but DNA replication is also an important source of endogenous stress. Replicative stress can lead to genomic instability and has been reported in early-stage malignancies and senescence. Homologous recombination is a repair process which can handle replicative stress. Therefore, a defect in homologous recombination could reveal endogenous replicative stresses. Consistently, a slow down in replication fork progression has been observed in homologous recombination deficient (HR-) cells, in absence of any exogenous treatment (Daboussi et al. 2008). In addition, several studies have shown the presence of mitotic defects in HR- cells, in absence of any exogenous treatment (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier et al. 2011; Rodrigue 2013). The origin of these spontaneous mitotic defects is still unclear. Indeed, homologous recombination is preferentially active in S and G2 phases thus, the link with mitosis remains to be elucidated. The aim of this thesis is to understand the impact of a low or endogenous replicative stress on post-replicative phases. First, I studied the impact of a low or endogenous replicative stress on mitosis. Control cells were treated with very low hydroxyurea doses, that did not affected cell cycle progression but did slow down the replication fork progression to the same level than unchallenged HR- cells. Importanntly, exposure of the control cells to these low hydroxyurea doses generated the same mitotic defects, notably extra centrosomes, and to the same extent than in untreated HR- cells. Reciprocally, supplying nucleotide precursors to HR- cells suppressed both their replication deceleration and mitotic extra centrosome phenotypes. Therefore, subtle replication stress that does not impact S and G2 phase progression nor the entry in mitosis, nevertheless causes severe mitotic defects. Importantly, mitotic extra centrosome can lead to multipolar mitosis and then impact the whole genome stability. These data highlight the crosstalk between chromosome replication and segregation. Secondly, I studied the impact of low or endogenous replicative stress on G2 phase. This study was done using HR- cells as well as control cells treated with very low HU doses to induce a very low replicative stress. In both of these models, the presence of pRPA-Ser33 foci was observed in G2 phase, highlighting replicative stress regions. After very low HU treatement, we observed 53BP1 and RAD51 foci in G2 phase. These foci partially colocalized with pRPA-Ser33 foci in G2 phase. Mass spectrometry analyse after 53BP1 coimmunoprecipitation allowed to etablish a link between proteins involved in mitotic spindle assembly control and in mitotic checkpoint. These data support the link between replicative stress and mitotic defects. Lastly, the immmunoprecipitation of the chromatin interacting with pRPA-Ser33 in G2 phase, followed by sequencing (ChIPseq) allowed to reveal the absence of common fragile site enrichment and to highlight an enrichment at promoter regions of genes involved in cell cycle and cell death regulation. These data underline the link between very low or endogenous replicative stress and chromosomal instability, which can lead to tumorigenesis.

Dans cette thèse, nous avons étudié les aspects mécanique et thermodynamique de la recombinaison homologue, un processus crucial de réparation de l'ADN. Des travaux préliminaires d'observation de molécules d'ADN étirées lors de la recombinaison homologue ont mis à jour la complexité de ce processus et la difficulté de l'observer en fluorescence. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique appelée "pinces magnétiques sensibles au couple" nous permettant de maintenir une molécule unique d'ADN avec une force et un couple connus tout en mesurant son état de torsion avec une résolution de quelques degrés. Nous avons ainsi montré de manière directe que la polymérisation de la recombinase hRad51 a lieu par ajout de monomères chacun déroulant l'ADN de 65° en moyenne. Nous avons également été capables de mesurer le couple d'arrêt de la polymérisation. Une modélisation mécano-chimique nous a finalement permis d'évaluer le potentiel chimique de la polymérisation, en bon accord avec les données biochimiques existantes.

De nombreux gènes sont surexprimés au cours de la progression du mélanome malin cutané. Pour mieux comprendre le rôle de ces gènes, des études fonctionnelles sont nécessaires. Mon projet visait à développer une nouvelle stratégie pour produire des souris portant n'importe quel ADN d'intérêt inséré à la place du premier exon du gène Dct. Dct code la dopachrome tautomérase, une enzyme de la voie de biosynthèse de la mélanine, exprimée de façon spécifique dans les mélanocytes et leurs précurseurs. Notre stratégie visait à augmenter la fréquence de recombinaison homologue au locus Dct dans des cellules souches embryonnaires (ES) en induisant une cassure double-brin à ce locus grâce aux propriétés endonucléases de la méganucléase I-SceI de levure. Nous avons créé une lignée de cellule ES qui portent un site unique de reconnaissance de la méganucléase I-SceI inséré dans l'intron 1 du gène Dct. Notre hypothèse était que l'induction d'une cassure double-brin au locus Dct serait recombinogène, et qu'en présence d'une matrice de réparation, la fréquence des recombinaisons homologues à ce locus serait augmentée de façon significative. Nous avons testé cette hypothèse et intégré successivement les gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry au locus Dct. Nos résultats indiquent que, de façon surprenante, l'induction d'une cassure double-brin ne favorise pas la recombinaison homologue au locus Dct. Nous avons analysé l'expression des gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry insérés au locus Dct dans des cellules en culture, l'embryon ou chez l'adulte

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICEs) sont des éléments génétiques mobiles bactériens largement reconnus en tant qu'importants vecteurs de la transmission des gènes de résistance aux antibiotiques. Comme tous les éléments génétiques mobiles, ils participent grandement à la plasticité génomique de leur hôte, en permettant le transfert horizontal de gènes conférant des avantages pour l'adaptation de leur hôte à différentes conditions environnementales. Les ICEs se transfèrent horizontalement par conjugaison, par un mécanisme similaire à celui emprunté par les plasmides conjugatifs. Cependant, au contraire des plasmides, les ICEs ne possèdent pas un intermédiaire circulaire extrachromosomique réplicatif : ils s'intègrent plutôt dans le chromosome de leur hôte par recombinaison site-spécifique, à la manière d'un prophage. Une conséquence de ces deux caractéristiques est qu'ils sont également transmis verticalement lors de la division cellulaire de leur hôte. Lorsque soumis à certaines conditions, les ICEs s'excisent de leur hôte sous forme d'une molécule circulaire qui est le substrat pour leur transfert conjugatif vers un nouvel hôte. Une fois transférée, la molécule de l'ICE est recircularisée et s'intègre dans le chromosome. Les ICEs de la famille SXT/R391 sont largement distribués dans les souches de Vibrio cholerae et dans les ?-protéobactéries apparentées et ont été isolées dans une diversité d'endroits géographiques. Les membres de cette famille comportent un large squelette de gènes conservés qui codent pour leurs fonctions principales d'intégration/excision, de transfert conjugatif et de régulation. À l'intérieur de ce squelette sont retrouvées des régions.variables - dont la nature et les combinaisons diffèrent d'un élément à l'autre - qui codent pour des fonctions accessoires telles les résistances aux antibiotiques. Le patron de combinaisons des régions variables entre différents ICEs a mené à l'hypothèse qu'ils sont soumis à de fréquents échanges de matériel génétique par recombinaison. L'intégration site-spécifique de tous les membres de cette famille dans le même locus chromosomique permet la coexistence de deux ICEs semblables mais non identiques dans la même cellule, ce qui fournit un substrat à la recombinaison inter-ICE et permet la formation d'éléments hybrides. Cette thèse présente l'étude d'un nouveau système de recombinaison homologue identifié dans le squelette des ICEs SXT/R391 et sa participation dans la formation d'ICEs hybrides. Ce système de recombinaison, composé de la recombinase Bet et de l'exonucléase Exo est apparenté au système de recombinaison Red du bactériophage ? et est retrouvé chez tous les membres de la famille SXT/R391. La première portion du projet a visé l'identification des déterminants génétiques impliqués dans la formation d'hybrides. Les résultats obtenus démontrent que les ICEs hybrides peuvent être formés par trois voies différentes : i) Bet/Exo, d'une manière indépendante de RecA, ii) RecA et iii) Bet/Exo et RecA, de manière coopérative. Les résultats démontrent également que l'excision des éléments du chromosome ainsi que leur transfert conjugatif vers une nouvelle cellule ne sont pas nécessaires pour former des hybrides. Cette portion du projet met en évidence que les ICEs de la famille SXT/R391 sont capables de promouvoir leur propre diversité à l'aide du système de recombinaison homologue RecA-indépendant qu'ils codent. La deuxième partie du projet s'est portée sur la régulation de l'expression du système de recombinaison Bet/Exo. Les résultats obtenus démontrent que la transcription des gènes de recombinaison est induite en présence d'agents causant des dommages à l'ADN, par le biais des activateurs de transcription de l'ICE, SetC et SetD. Ces activateurs sont sous le contrôle du répresseur principal SetR, dont la répression est levée par les conditions qui induisent la réponse SOS de l'hôte, et sont responsables de l'expression concertée des gènes d'intégration/excision et de transfert conjugatif. Bien que la transcription des gènes de recombinaison soit fortement induite en présence d'agents induisant la réponse SOS, l'analyse de leur profil traductionnel démontre que leur traduction est fortement régulée. Des atténuateurs de traduction putatifs positionés en amont de Bet et Exo pourraient être responsables de ce niveau additionnel de régulation. L'analyse de l'organisation génétique du locus de recombinaison a mis en évidence que bet et exo font partie d'un opéron polycistronique comprenant 12 autres gènes du squelette conservé des ICEs SXT/R391, dont les fonctions ne sont pas connues. Finalement, une analyse in silico visant à identifier tous les systèmes de recombinaison apparentés au sein des génomes séquencés de bactéries, plasmides et virus a permis de démontrer qu'un nombre important de ces systèmes existent chez une diversité d'espèces bactériennes appartenant à des taxons éloignés. Bien que la majorité de ces systèmes soient codés par des bactériophages, plusieurs sont retrouvés sur des plasmides conjugatifs. L'ensemble des résultats présentés dans cette thèse permet une meilleure compréhension de l'évolution des éléments génétiques mobiles bactériens, et plus particulièrement des éléments intégratifs et conjugatifs de la famille SXT/R391.