La levure Candida albicans présente une tolérance élevée aux réarrangements de son génome et en particulier, aux pertes d’hétérozygotie (LOH). Ces LOH sont le plus souvent le résultat de la réparation d’une cassure double-brin de l’ADN (DNA DSB) et jouent un rôle important dans différents aspects de la biologie de C. albicans. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine des LOH, nous avons combiné un système d’induction d’un DNA DSB par la méganucléase I-SceI et un système rapporteur de LOH optimisé pour l’analyse par FACS. La surexpression de I-SceI entraine une forte augmentation du taux de LOH, principalement des conversions géniques. La caractérisation des cellules ayant subi une LOH a permis d’identifier des allèles récessifs délétères et létaux présents à l’état hétérozygote dans le génome de la souche de laboratoire de C. albicans. Ces allèles influent sur la nature des LOH observés suite à un DNA DSB. Nous avons également caractérisé la fidélité de la réparation d’un DNA DSB induit par I-SceIchez C. albicans. Cette étude a permis de décrire des recombinaisons complexes et inattendues se déroulant pendant les événements de break-induced replication et de conversions géniques avec crossover. En parallèle, une collection de 564 plasmides de surexpression pour des gènes impliqués dans les voies de signalisation et dans l’intégrité du génome et de la paroi a été transformée dans une souche possédant les deux systèmes mentionnés ci-dessus. L’analyse des transformants dans des conditions ou non d’expression de I-SceI a permis d’identifier des gènes dont la surexpression augmente le taux basal de LOH ou diminue le taux de LOH élevé du à l’expression d’I-SceI. / The Candida albicans genome displays a high tolerance to rearrangements, notably loss-ofheterozygosity (LOH) events. These events most often result from the repair of DNA double-strandbreaks (DSBs) and are known to play an important role in different aspects of C. albicans biology.To study the molecular mechanisms leading to LOH, we have combined an I-SceI meganuclease-dependent DSB-inducing system with a FACS-optimized reporter system of LOH. Our results show that expression of I-SceI leads to a dramatic increase in the frequency of LOH events,mainly gene conversion events. Characterization of cells having undergone a LOH led us to identify recessive lethal and deleterious alleles present in the heterozygous state in the genome of the C.albicans laboratory strain. These alleles influence the nature of the LOH events that are observed following a DSB. We also characterized the fidelity of the repair following an I-SceI-induced DNA DSB. This revealed unexpected complex recombination events occurring upon both break-induced replication and gene conversion with crossover repair events. In parallel, a collection of 564 over expression plasmids for genes involved in signaling pathways, genome integrity and cell wall integrity has been transformed in a C. albicans strainharboring the I-SceI-dependent DSB-inducing system and FACS-optimized LOH reporter. Analyses of the resulting transformants under conditions that allowed fro I-SceI expression or not, led to the identification of genes whose overexpression results either in an increase of the basal LOH rate or in areduction of the high LOH frequency associated to I-SceI expression.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

De nombreux gènes sont surexprimés au cours de la progression du mélanome malin cutané. Pour mieux comprendre le rôle de ces gènes, des études fonctionnelles sont nécessaires. Mon projet visait à développer une nouvelle stratégie pour produire des souris portant n'importe quel ADN d'intérêt inséré à la place du premier exon du gène Dct. Dct code la dopachrome tautomérase, une enzyme de la voie de biosynthèse de la mélanine, exprimée de façon spécifique dans les mélanocytes et leurs précurseurs. Notre stratégie visait à augmenter la fréquence de recombinaison homologue au locus Dct dans des cellules souches embryonnaires (ES) en induisant une cassure double-brin à ce locus grâce aux propriétés endonucléases de la méganucléase I-SceI de levure. Nous avons créé une lignée de cellule ES qui portent un site unique de reconnaissance de la méganucléase I-SceI inséré dans l'intron 1 du gène Dct. Notre hypothèse était que l'induction d'une cassure double-brin au locus Dct serait recombinogène, et qu'en présence d'une matrice de réparation, la fréquence des recombinaisons homologues à ce locus serait augmentée de façon significative. Nous avons testé cette hypothèse et intégré successivement les gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry au locus Dct. Nos résultats indiquent que, de façon surprenante, l'induction d'une cassure double-brin ne favorise pas la recombinaison homologue au locus Dct. Nous avons analysé l'expression des gènes rapporteurs Lago1 et H2B-mCherry insérés au locus Dct dans des cellules en culture, l'embryon ou chez l'adulte

Le xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare caractérisée par une hypersensibilité aux ultraviolets (UV) et une forte incidence des tumeurs cutanées. Les cellules des patients XP sont incapables d’éliminer les lésions induites dans l’ADN par les UV en raison d’un dysfonctionnement du mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER). Plusieurs groupes de complémentation ont été identifiés dans le syndrome XP, parmi lesquels le groupe XP-C représente la majorité des patients à travers le monde.Au cours de mon travail de thèse, j’ai développé un modèle de correction ciblée par recombinaison homologue (RH) d’une délétion de deux nucléotides au niveau de l’exon 9 du gène XPC aboutissant à l’apparition prématurée d’un codon stop. Afin de stimuler la RH, deux types de nucléases ingéniérées sont utilisées : les méganucléases et les TALENs. J’ai observé que la méthylation de la séquence ciblée pouvait affecter l’activité de celles-ci et donc l’efficacité du ciblage de gène. Cependant, deux approches ont été développées pour résoudre ce problème : l’utilisation d’un agent déméthylant (5-aza-2’-désoxycytidine (5azadC)) ou la création d’une endonucléase insensible à la méthylation. L’utilisation des méganucléases en combinaison avec la 5azadC a permis de stimuler la fréquence de coupure de presque 20 fois dans des fibroblastes XPC et la TALEN modifiée permet une augmentation de 40 fois. Avec ces deux stratégies j’ai obtenu des événements de correction génétique par introduction d’une matrice de réparation dans le locus ciblé avec une fréquence proche de 3%. La caractérisation des clones corrigés avec la TALEN XPC montre la correction génomique des deux nucléotides dans l’exon 9, une restauration de l’expression de la protéine XPC et une résistance cellulaire après irradiation UV traduisant le rétablissement des fonctions de la NER. Cette étude représente la première preuve de correction génétique de cellules déficientes en protéine XPC en utilisant une approche ciblée. / Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare inherited genetic disorder characterized by an UV hypersensitivity and a severe predisposition to skin cancers. Cells from XP patients are deficient in nucleotide excision repair (NER) of UV‐induced DNA lesions. Several complementation groups have been identified in the XP syndrome and the XP-C group represents the majority of XP patients around the world. During my PhD work, I developed a model of targeted correction by homologous recombination (HR) in order to correct a deletion of two nucleotides in the ninth exon in XPC gene leading to a premature stop codon. To stimulate HR, I used two types of engineered endonucleases : meganucleases and TALEN. I observed that the target methylation status could affect the endonuclease activities and therefore XPC gene correction. Nervertheless, I developed two approaches to overcome this methylation sensitivity : use of a demethylating agent (5-aza-2-deoxycytidine (5azadC)) or a specific engineering of TALEN. Using 5azadC with meganuclease allowed to stimulate the cutting frequency by nearly 20 fold in XPC fibroblasts and the engineered TALEN allowed a 40 fold-increase in frequency. With both strategies I obtained genetic correction events by repair matrix introduction in the targeted locus with a near 3% frequency. The characterization of corrected clones with the XPC TALEN shows genomic correction in the ninth exon, a restoration of the XPC protein expression and cell survival following UV exposure, thus demonstrating fully recovered normal repair activity by NER. This study represents the first evidence of genetic correction of XPC-deficient cells by a targeted approach.

Les stratégies d'ingénierie du génome par recombinaison homologue basées sur la technologie CRISPR/Cas-9 ont été largement utilisées pour modifier la séquence de gènes chez C. elegans. Cependant, l'efficacité de sélection des animaux modifiés nécessite d'être améliorée. Nous avons développé un nouveau marqueur, le gène miniSOG, qui permet la contre-sélection des animaux non modifiés et que nous avons intégré dans une cassette de double sélection. Les animaux contenant la cassette HySOG sont d'abord sélectionnés pour leur résistance à un antibiotique, l'hygromycine B. HySOG est ensuite excisée et les modifications sont insérées au locus cible. Les souches recombinantes résistent à une exposition à la lumière bleue, qui tue les vers exprimant le gène miniSOG. Nous montrons que la méganucléase I-SceI peut être utilisée pour exciser HySOG et pour introduire des modifications dans la lignée germinale avec la même efficacité que la technologie CRISPR/Cas-9.Des technologies d'ingénierie du génome ont été utilisées pour étiqueter la sous-unité des GABAAR UNC-49 et pour analyser le rôle de MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC et NLG-1/neurologine sur l'agrégation synaptique des GABAAR à la jonction neuromusculaire GABAergique. Nous montrons que MADD-4, une protéine de la matrice extracellulaire sécrétée par les motoneurones, est un nouveau ligand de NLG-1 et de UNC-40 et constitue un organisateur synaptique antérograde des synapses GABAergiques. D'abord, l'isoforme courte de MADD-4, MADD-4B, lie directement NLG-1 et assure sa localisation à la membrane post-synaptique. Ensuite, MADD-4B lie, recrute et active probablement le récepteur UNC-40, qui renforce l'interaction des GABAAR avec NLG-1. / CRISPR/Cas-9-based techniques have been widely used to engineer any gene in C. elegans by homologous recombination. However, the selective efficacy of engineered animals needs to be expanded. We have developed miniSOG as a counter-selection marker in a dual selection strategy. Animals containing the dual selection cassette HySOG are firstly selected by the resistance to the antibiotic hygromycin B. HySOG is then excised and customized gene modifications are inserted into target sites. Recombinant strains are selected based on the resistance to blue light exposure, which otherwise kills miniSOG expressing worms. We demonstrate that meganuclease I-SceI can be used to excise HySOG and to introduce gene modifications in C. elegans germline as efficiently as CRISPR/Cas-9. Genome-engineering techniques have been used to tag the GABAAR subunit UNC-49 with RFP and to analyze the role of MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC and NLG-1/neuroligin on GABAARs clustering at GABAergic NMJs. We showed that MADD-4/Punctin, an extracellular matrix protein secreted by GABAergic neurons, is a new ligand of NLG-1/neuroligin and of UNC-40/DCC and functions as a central anterograde organizer of GABAergic synapses. First, the short isoform of MADD-4, MADD-4B directly binds NLG-1/neuroligin and localizes it in the post-synaptic membrane of GABAergic synapses. Second, MADD-4B binds, recruits and likely activates the netrin receptor UNC-40/DCC, which in turn promotes the interaction of GABAAR with NLG-1/neuroligin and its localization at the synapse.

L’amélioration génétique du blé tendre (Triticum aestivum L.), une des trois céréales les plus cultivées, représente un intérêt stratégique pour la sécurité alimentaire de la population mondiale. Cette amélioration génétique va nécessiter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques mis en jeu, et va aussi réclamer une efficacité accrue dans notre capacité à intervenir finement sur le génome. Les avancées majeures réalisées dans le domaine des biotechnologies ces dernières années permettent d’envisager de nouveaux champs d’action pour appréhender le fonctionnement des caractères d’intérêt agronomique du blé tendre, ainsi que pour son amélioration génétique, et fournissent également de nouveaux outils pour innover dans le domaine de l’édition des génomes. Nous avons cherché dans le cadre de cette thèse à développer des innovations chez blé tendre à partir de trois nouveaux outils issus des biotechnologies. Nous avons tout d’abord montré que l’extinction du gène pds par une stratégie de micro ARN artificiel à partir d’un micro ARN de riz permettait d’obtenir le phénotype attendu, et que l’expression du micro ARN artificiel était reliée à ce phénotype. Nous avons commencé à explorer la possibilité d’utiliser des microARN de blé pour réaliser la même extinction, sans résultat pour l’instant. Nous avons ensuite montré que des coupures spécifiques d’une séquence donnée peuvent être obtenues in vivo chez le blé tendre à l’aide d’une méganucléase, et que lorsque les sites de coupure encadrent une séquence donnée, une délétion du fragment encadré peut être obtenue. Nous avons enfin réalisé les premiers essais du système CRISPR-Cas9 au laboratoire et généré une lignée exprimant le transgène Cas9 de façon constitutive. Des résultats inattendus obtenus dans le cadre de ces expérimentations nous ont de plus permis d’améliorer le procédé de transformation génétique du blé tendre utilisé au laboratoire. Les applications de nos résultats pourront être utilisées pour des expérimentations de validation de gènes et de compréhension des mécanismes moléculaires associés, mais aussi à l’avenir pour intervenir directement et de plus en plus finement sur le génome du blé. Les choix stratégiques en termes de développement technologique et d’innovation dans le domaine des biotechnologies et dans le cadre des objectifs d’un laboratoire public sont discutés. / The genetic improvement of common wheat (Triticum aestivum L.), one of the three most cultivated cereals, is of strategic interest to the food security of the world's population. This genetic improvement will require a better understanding of the molecular and physiological mechanisms involved, and will also require increased efficiency in our ability to modify finely the genome. In recent years, the major advances in biotechnology have made it possible to envisage new fields of action for a deeply understanding of agronomic traits of wheat as well as for genetic improvement, and also provide new tools for innovate in the field of genome editing. In this PhD manuscript, we sought to develop innovations for wheat improvement using three new biotechnology tools. We first demonstrated that the extinction of the pds gene by a strategy of artificial micro RNA succeeded in the obtaining of the expected phenotype and that the expression of the artificial RNA was related to this phenotype. We have begun to explore the possibility of using wheat microRNAs to achieve the same extinction, with no results at this time. We have then shown that specific cuts of a given sequence can be obtained in vivo in wheat using a meganuclease, and that when the cleavage sites frame a given sequence a deletion of the framed fragment may be obtained. We finally carried out the first tests of the CRISPR-Cas9 system in the laboratory and generated a line expressing the Cas9 transgene constitutively. Unexpected results obtained during these experiments have also made it possible to improve the process of genetic transformation of soft wheat used in the laboratory. The applications of our results can be used for gene validation experiments and a better understanding of the molecular mechanisms involved, but also in the future for wheat genome editing. Strategic choices in terms of technological development and innovation in the field of biotechnology and within the framework of the objectives of a public laboratory are discussed.

La recombinaison homologue est un mécanisme de réparation de l’ADN extrêmement contrôlé et particulièrement chez les eucaryotes supérieurs. Dans les cellules méiotiques de ces derniers, où les cassures doubles brin de l’ADN sont programmées, les voies de crossing-over de la recombinaison homologue, qui génèrent de nouvelles combinaisons de gènes, sont restreintes. Dans les cellules somatiques, la recombinaison illégitime, qui assure majoritairement la réparation des cassures double brin de l’ADN, limite l’intégration ciblée du transgène par recombinaison homologue. Les entreprises de biotechnologie convoitent de maitriser la recombinaison homologue afin de contrôler d’une part le brassage génomique qui a lieu pendant la méiose, et d’autre part l’intégration du transgène dans le génome. Cette étude a porté sur le développement d’outils afin d’atteindre ces deux objectifs. Afin d’augmenter le brassage du génome, ayant lieu pendant la méiose, une version du promoteur OsDmc1b, active dans les cellules méiotiques, a été caractérisée chez le maïs. Des plantes sur-exprimant le gène ZmSpo11.1, sous contrôle de ce promoteur, ont ainsi été développées afin d’obtenir des lignées potentiellement hyper-recombinantes. Si la surexpression de ZmSpo11.1 permet effectivement d’augmenter le taux de crossing-over, il pourra être utilisé par les sélectionneurs afin d’accélérer l’introgression d’allèles d’intérêt dans des variétés élites. Concernant la mise en place d’une technique de ciblage de gène, deux stratégies, reposant sur l’utilisation de la méganucléase I-SceI, ont été testées. La démarche a nécessité trois éléments : un locus cible contenant le site de coupure I-SceI, une matrice de réparation et la séquence codant I-SceI (ou I-SceI::GR). La première stratégie, consistant à retransformer les lignées présentant le locus cible avec la matrice de réparation et I-SceI, ne semble pas exploitable car aucun évènement de ciblage de gène n’a été mis en évidence. La seconde stratégie, reposant sur l’assemblage des trois éléments par croisement, est beaucoup plus prometteuse. Malgré la faible activité d’I-SceI::GR, des évènements de recombinaison homologue ont été observés dans les tissus foliaires de certaines plantes. Du cal embryogène, développé à partir de ces dernières, a permis de régénérer des plantes présentant des évènements de ciblage de gène. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans l’élaboration contrôlée d’OGM. / Homologous recombination is a DNA repair mechanism highly regulated in higher eukaryotes. In their meiotic cells, where DNA double-stranded breaks are programmed, the crossing-over pathway of homologous recombination, which generates new gene combinations, is limited in activity and genomic distribution. In somatic cells, illegitimate recombination, which mainly ensures DNA double-strand repair, limits the targeted integration of transgenes by homologous recombination. Biotechnology companies aim to master homologous recombination to control on the one hand the genomic mixing that occurs during meiosis, and on other hand, the integration of transgenes into the genome. This study focuses on the development of tools to achieve these two objectives.To increase genome mixing occurring during meiosis, a version of the OsDmc1b promoter active in maize meiotic cells was isolated. Then, plants over-expressing the ZmSpo11.1 gene under control of this promoter have been developed to obtain potentially hyper-recombinant lines. If ZmSPO11.1 overexpression increases the crossing over rate, it can be used by breeders to accelerate the introgression of alleles of interest into elite varieties. For the establishment of a gene targeting technique, two strategies based on the use of the I-SceI meganuclease were tested. These approaches involved the use of three elements which are: a target locus containing the cleavage site of I-SceI, a repair template and the sequence encoding I-SceI (or ISceI::GR). The first strategy, consisting of the retransformation of target locus lines with the repair template and I-SceI, does not seem workable because no gene targeting events were isolated. The second strategy, based on the assembly of the three components by crossing, is more promising. Despite the low activity of I-SceI::GR, homologous recombination events were observed in leaf tissues of certain plants. Embryogenic callus, developed from these plants, permitted the regeneration of plants with gene targeting events. This work opens new perspectives in the development of controlled GMO production.