Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destiné à aider à la détermination du mécanisme de certaines protéines. Cet outil, qui combine un appareil de pinces magnétiques, et un microscope de fluorescence en ondes évanescentes, a été conçu pour permettre à la fois la manipulation mécanique et l'observation de l'activité d'ADN translocases à l'échelle de la molécule unique. Nous présentons d'abord ici la conception, la réalisation et l'expérimentation de ce montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement à ses composants séparés (pinces magnétiques et microscope de fluorescence), et que d'autre part leur réunion dans un appareil unique permet d'obtenir des résultats d'un type nouveau. Nous avons orienté l'étude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de deux protéines : le moteur FtsK de Escherichia coli et l'ARN Polymérase de T7. Nous détaillons dans cette étude les questions importantes encore en suspens concernant le mécanisme et présentons les expériences que nous avons envisagées pour y répondre. Nous relatons ensuite également la difficulté que nous avons rencontrée à obtenir des substrats protéiques adaptés aux expériences que nous avons envisagées, et les solutions que nous avons mises en oeuvre pour y remédier. Enn, nous analysons les résultats obtenus dans des expériences en volume ou en pinces magnétiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements et de préparer la réalisation de nouvelles expériences sur notre montage combiné.

Les techniques de micromanipulation de molécules d’ADN uniques offrent des perspectives nouvelles pour lire et exploiter l’information contenue dans les génomes. Cela inclut le séquençage, la cartographie, le dénombrement de molécules et l'identification de modifications chimiques de l'ADN. Dans ce contexte, l'Équipe ABCDLab de l'ENS a développé une méthode utilisant l’ouverture et la fermeture mécanique répétée d’une molécule d’ADN en épingle à cheveux par pince magnétique. Cet outil permet de déterminer la position d'hybridation de petits oligonucléotides ainsi que celle d'anticorps révélant la position de marques épigénétiques. Un avantage de cette approche est de pouvoir travailler sur la même molécule pour d’une part identifier les marques épigénétiques et d'autre part réaliser une cartographie de sa position dans le génome. Mon travail de thèse consiste à développer un ensemble de méthodes bio-informatique visant à réaliser cette étape de cartographie. Le signal expérimental consiste en lecture des positions d’hybridation d’un, ou de plusieurs petits oligonucléotides sur la molécule étudiée. Cette mesure permet de construire une signature spécifique de la molécule que l’on peut rechercher dans le génome d’origine. Dans ce travail de thèse, j'ai réalisé des expériences avec sur pinces magnétiques pour acquérir des signatures moléculaires sur des molécules sélectionnées en aveugle dans E. coli. J'ai développé un logiciel capable de faire la recherche de ces signatures dans un génome et ensuite effectué l’ensemble du traitement des données pour tester le logiciel. Après plusieurs étapes d’optimisation, j’ai pu retrouver la position génomique des molécules étudiées, établissant ainsi une preuve de concept de cette stratégie de cartographie. Le travail a concerné l'ensemble de la chaîne de mesure : (1) le choix des sondes utilisées pour constituer la signature d’une molécule observée en optimisant un ensemble de critères liés aux conditions expérimentales et à la combinatoire des motifs de séquence. (2) la mise au point d’algorithmes de cartographie adaptés aux caractéristiques expérimentales des mesures. Enfin, j'ai testé ces algorithmes, à la fois sur des données simulées in silico et in vitro sur de l'ADN d'origine bactérienne. Je discuterais en quoi les performances des solutions de cartographie développées ici sont influencées par, d’une part les limites du montage expérimental actuel, et d’autre part les limites des approches bioinformatiques. Je présenterais les voies d’amélioration possibles de ces dernières. Mes travaux établissent qu'identifier des molécules d’ADN uniques par pinces magnétiques est possible dans le contexte d’application épigénétique et en génomique. / Single molecule micromanipulations technic offer new perspectives to read and unravel genome information. This includes sequencing, mapping, molecule counting and identification of DNA modifications. In this respect, ABCDLab team has developed a cutting edge method using repeated mechanical opening and closing of a DNA molecule with a hairpin shape using magnetic tweezers. This tool allows measuring along the DNA molecule the hybridization positions of oligonucleotides a few bases long and also to locate specific antibodies transiently bound to epigenetic markers. With this approach we can identify with the single molecule level epigenetics markers and localized them on the genome. My PhD work consisted of developing a set of bioinformatics methods to perform DNA mapping using magnetics tweezer signal consisting of hybridization positions along the studied molecule. This measurement may be viewed as a fingerprint of the molecule which can be searched on the reference genome. During my thesis, I have realized an experimental test using magnetic tweezers to acquire a set fingerprint data on a set of blinded selected molecules in the E. coli genome. I have developed a software performing a rapid search of these fingerprints inside the genome. Then I have performed the whole data treatment to check the software on the selected molecules. After several rounds of optimization, I have recovered the genetic position of the studied molecules, establishing a proof of concept of this cartography strategy. The work has addressed the whole measuring chain; (1) by choosing the oligonucleotides best adapted to obtain the molecular signature by optimizing the set of experimental constrains and combinatorial motifs of the sequence. (2) by tuning the cartography algorithm to adapt to the experimental measurement constrains. Finally, I have tested these algorithms, both on simulated data in silico and on experimental fingerprint in vitro. I shall discuss how the performances of these cartography solutions that have been developed here are impacted by the experimental limitations of the present technique, and by the bioinformatics limits. I shall present possible improvements to these methods. My studies constitute a proof of concept for genomic and epigenetic applications.

Chez les eucaryotes, l'ADN s'associe à des octamères d'histones pour former une structure nucléoprotéique dense appelée chromatine. Sous cette forme compacte, la chromatine agit comme une barrière topologique empêchant des facteurs de transcription par exemple, d'interagir avec l'ADN. Il va donc être essentiel de moduler la structure de la chromatine pour réguler l'accès à l'ADN et donc l'expression des gènes. L'une des stratégies adoptées, implique l'intervention de complexes multi-protéiques, appelés facteurs de remodelage de la chromatine, qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour perturber le positionnement des octamères d'histones par rapport à l'ADN. Les mécanismes sous-jacents, éventuellement variés, sont encore méconnus.<br />Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.

Dans cette thèse, nous avons étudié les aspects mécanique et thermodynamique de la recombinaison homologue, un processus crucial de réparation de l'ADN. Des travaux préliminaires d'observation de molécules d'ADN étirées lors de la recombinaison homologue ont mis à jour la complexité de ce processus et la difficulté de l'observer en fluorescence. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique appelée "pinces magnétiques sensibles au couple" nous permettant de maintenir une molécule unique d'ADN avec une force et un couple connus tout en mesurant son état de torsion avec une résolution de quelques degrés. Nous avons ainsi montré de manière directe que la polymérisation de la recombinase hRad51 a lieu par ajout de monomères chacun déroulant l'ADN de 65° en moyenne. Nous avons également été capables de mesurer le couple d'arrêt de la polymérisation. Une modélisation mécano-chimique nous a finalement permis d'évaluer le potentiel chimique de la polymérisation, en bon accord avec les données biochimiques existantes.

Dans ce manuscrit nous abordons les propriétés mécaniques de fibres de chromatine à l'échelle de la molécule unique. La chromatine est la structure nucléoprotéique qui contient le génome des cellules eucaryotes. À ce titre, cette fibre est soumise à de nombreuses contraintes mécaniques, telle la torsion, lors des processus de transcription, de réplication ou bien encore de réparation. Une revue des connaissances concernant la chromatine est présentée dans un premier chapitre. En particulier, nous introduisons l'influence d'une histone, appelée histone de liaison. Cette protéine permet à la fibre d'accéder à un niveau de compaction supérieur. Ensuite nous donnons les outils théoriques et expérimentaux d'étude du substrat chromatinien. Nous détaillons les propriétés topologiques de la chromatine. Le dispositif d'étude que nous avons utilisé, les pinces magnétiques, est décrit. Il permet d'exercer sur une fibre unique des contraintes mécaniques de tension et de torsion controlées. Enfin nous présentons les résultats obtenus sur des fibres de chromatine reconstituées en présence ou non de l'histone de liaison. À l'aide des pinces magnétiques, nous avons pu mettre en évidence le fait que l'histone de liaison ne modifie pas l'élasticité torsionnelle remarquable de la chromatine, même si la fibre est dans un état plus condensé. Sous forte déformation torsionnelle positive, le nucléosome subit une transition chirale qui permet de relâcher la contrainte topologique appliquée à la fibre. Nous avons pu montrer que ce changement conformationnel peut tout à fait se dérouler au sein des fibres contenant l'histone de liaison. Les implications biologiques de ces phénomènes sont examinées. La capacité propre à la chromatine à supporter la contrainte de torsion pourrait avoir un rôle dans le maintien de l'organisation chromatinienne lors du cycle cellulaire.

Hautement conservé, de la bactérie jusqu'à l’Homme, la recombinaison homologue est indispensable à la survie de tout organisme vivant. Chez l’humain, la protéine hRad51 (human Rad51) y joue un rôle clé en s’autoassemblant au site de cassure sur les extrémités simple-brin d’une molécule d’ADN endommagée pour former le filament nucléoprotéique. Ce filament est capable à lui seul d’effectuer la plupart des opérations nécessaires au bon déroulement de la recombinaison homologue; il va permettre la reconnaissance d’homologie, l’appariement des séquences homologues et l’invasion de brins requise pour la synthèse de l’ADN manquant.La recombinaison homologue est un processus complexe impliquant de multiples partenaires. Pour mieux comprendre le rôle du filament nucléoprotéique au sein de la réaction, on se propose d’étudier ce dernier en l’absence de tout partenaire. Plus précisément, on observe le comportement mécanique de filaments hRad51-ADNdb en fonction des conditions chimiques. La formation du filament nucléoprotéique modifie la conformation de l’ADN sur lequel il s’assemble, l’allongeant de 50% et le déroulant de 43% dans le cas d’une molécule double-brin. Les pinces magnétiques sont un outil permettant de contrôler la force et la torsion appliquées à une unique molécule d’ADN double-brin (ADNdb), elles sont donc l’outil idéal pour sonder les propriétés mécaniques de filaments nucléoprotéiques. Le système des pinces magnétiques a été modifié afin de mesurer des paramètres mécaniques précédemment inaccessibles tel que le couple ressenti ou exercé par le filament. Le but de cette thèse a été d’étudier les propriétés mécano-chimiques des filaments nucléoprotéiques tout en essayant de tracer le paysage énergétique qui régit les transitions de ces systèmes. / Highly conserved throughout the species, homologous recombination is crucial to the survival of any living organism. In humans, the hRad51 protein (human Rad51) plays a key role by self-assembling at the break site on the single stranded extremities of damaged DNA molecules thus forming the nucleoprotein filament. This filament is able by itself to accomplish most of the necessary operations of homologous recombination; it allows the homology search, the pairing of the homologous sequences and the strand exchange.Homologous recombination is a complex process involving many partners. In order to better understand the role of the nucleoprotein filament in this process, we propose to study it in the absence of any partners. We will focus on the study of the mechanical properties of hRad51-dsDNA filaments as a function of chemical conditions. The formation of the nucleoprotein filament modifies the conformation of the DNA molecule on which it assembles, stretching it by 50% and unwinding it by 43% in the case of a double stranded DNA. The magnetic tweezers are a tool allowing the control of the force and torsion applied to a single dsDNA molecule; they are therefore the ideal tool to probe the mechanical properties of nucleoprotein filaments. We modified the magnetic tweezers as to allow the measurement of previously inaccessible mechanical parameters such as the torque applied or felt by the filament. The goal of this thesis has been to study the mechano-chemical properties of nucleoprotein filaments while drawing the energy landscape that governs the various transitions of these systems.

Durant ces dernières années, la modélisation en physique est restée aveugle aux développements de disciplines sœurs ; en particulier la mécanique ou plutôt la robotique qui développe des outils puissants comme la cinématique inverse et les moteurs physiques (ou moteurs de jeux). Ces techniques sont couramment employées dans les jeux vidéo pour des résultats très réalistes. Je propose ici de montrer que nous pouvons simuler des assemblages d'ADN et de protéines (fibre de chromatine et à plus grande échelle des chromosomes) comme des systèmes articulés avec un moteur physique. Je montre aussi qu'il est possible d'étendre le thermostat local de Langevin à un thermostat global pour accélérer l'échantillonnage de l'espace des configurations du système ADN-protéines dans l'ensemble canonique. Ce nouveau thermostat est particulièrement intéressant lorsqu'il est utilisé avec un moteur physique. Plus précisément, je montrerai que la simulation que j'ai développée reproduit les résultats expérimentaux de manipulation de molécules uniques sous pinces magnétiques et permet de faire des prédictions. Enfin, cette simulation offre des perspectives intéressantes pour la modélisation des noyaux d'organismes allant de la drosophile à l'humain et la compréhension des toutes dernières données sur l'architecture des génomes.

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable. / G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié le fonctionnement de différents facteurs de remodelage de la chromatine (RSC et ISWI), en utilisant les techniques de pinces magnétiques, TPM et AFM. Les facteurs de remodelage sont des enzymes qui sont responsables de la régulation de l'accessibilité de la chromatine (ADN compacté dans le noyau cellulaire). Dans une première partie, nous présentons la structure de l'ADN et sa compaction à l'intérieur de la cellule. Ensuite, nous abordons le remodelage de la chromatine en nous focalisant sur le remodelage ATP-dépendant. Après, nous présentons les techniques classiques employées en molécule unique pour étudier l'interaction ADN/protéines, ainsi que les montages expérimentaux utilisés. Tous ces montages expérimentaux nous ont permis de bien caracteriser la translocation des facteurs de remodelage sur l'ADN nu, et de proposer un mécanisme d'action possible utilisé par la famille SWI/SNF et la famille ISWI.

Au cours de cette thèse , nous avons étudié le fonctionnement des topoisomérases de type II en utilisant un dispositif de micromanipulation de molécules uniques d'ADN. Les topoisomérases sont des enzyme responsables de la régulation de la topologie de l'ADN in vivo, en particulier lors de la réplication, la transcription et la condensation des chromosomes. Dans une première partie, nous introduisons le formalisme topologique nécessaire à la compréhension de la structure adoptée à grande échelle par la molécule d'ADN, puis nous présentons les techniques usuelles qui permettent d'étudier la topologie de ces molécules. Dans une seconde partie, nous présentons le dispositif de micromanipulation d'ADN que nous avons utilisé. Celui-ci, basé sur l'utilisation de pinces magnétiques, permet de sonder directement les propriétés élastiques en tension et en torsion d'une molécule unique d'ADN, mais aussi d'étudier la caténation ou le tressage de molécules d'ADN. Ainsi, il offre la possibilité d'étudier en temps réel l'activité d'enzymes appelées topoisomérases qui décatènent ou modifient l'état de super-enroulement de l'ADN. Dans la troisième partie, nous présentons les résultats que nous avons obtenus sur différentes enzymes de la classe des topoisomérases de type II. Nous montrons que les expériences de molécules unique permettent une étude très fine du cycle enzymatique des topoisomérases. Par ailleurs, nous mettons en évidence le fait que la topoisomérase 4 opère une reconnaissance de son substrat, basée sur l'angle entre segments dans un croisement d'ADN. Enfin, nous présentons des expériences qui visent à comprendre les propriétés thermodynamiques particulières de ces enzymes.