Thesis (Ph.D.)--University of Nevada, Reno, 2004. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

Η απόκριση των κυττάρων στο στρες συνδέεται με την επαγωγή μιας ομάδας πρωτεϊνών που ονομάζονται θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (Hsps). Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν στην κατηγορία των κυτταρικών συνοδών μορίων (chaperons) και προστατεύουν τα κύτταρα από τη μετουσίωση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών τους. Οι περισσότερες Hsps συντίθενται και σε φυσιολογικές συνθήκες και παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ορθή αναδίπλωση, μεταφορά και αποικοδόμηση των πρωτεϊνών του κυττάρου. Οι Hsps κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες σύμφωνα με τα μοριακά τους βάρη. Από τις οικογένειες αυτές η οικογένεια των μικρών Hsps (sHsps), με μοριακά βάρη12-43 kDa, χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας πολύ συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης στο καρβoξυτελικό τους άκρο. Μία από τις πιο καλά μελετημένες sHsps είναι η Hsp27. Η Hsp27, εκτός από το κύριο ρόλο της ως μοριακού συνοδού, εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η διαφοροποίηση, η απόπτωση, ο σχηματισμός του κυτταροσκελετού και η ρύθμιση της οξειδωτικής ισορροπίας των κυττάρων. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας φάνηκε ότι το γονίδιο Cchsp27 εκφράζεται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας και ότι η έκφραση του ρυθμίζεται στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του εντόμου. Πειράματα στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις ενηλίκων ατόμων έδειξαν ότι στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων το Cchsp27 mRNA παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με τον εγκέφαλο των θηλυκών ατόμων. Ακόμη παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Cchsp27 mRNA στους όρχεις από ότι στις ωοθήκες. Τα αποτελέσματα από την έκφραση του γονιδίου στους σιελογόνους αδένες προνυμφών έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης στους σιελογόνους αδένες 24 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, ενώ σταδιακά η έκφραση μειώνεται μέχρι το στάδιο της εκτινασσόμενης προνύμφης. Η έκφραση του Cchsp27 mRNA αυξάνεται στο στάδιο του λευκού προβομβυκίου ενώ στη συνέχεια σταδιακά μειώνεται. Ύστερα από την καλλιέργεια σιελογόνων αδένων παρουσία εκδυσόνης φάνηκε ότι συμβαίνει καταστολή της έκφρασης γονιδίου σε υψηλές συγκέντρωσης της ορμόνης, ενώ παρατηρείται επαγωγή σε συγκέντρωση 10-6 M. Σε ότι αφορά στην καλλιέργεια ωοθηκών και όρχεων παρουσία εκδυσόνης, παρατηρήθηκε μέγιστη επαγωγή του Cchsp27 γονιδίου στις ωοθήκες στα νεοεκκολαπτόμενα θηλυκά, ενώ μέγιστη επαγωγή στους όρχεις παρατηρήθηκε στα αρσενικά άτομα δύο ημερών. Ακολούθως, δημιουργήθηκε ένα διαγονιδιακό στέλεχος που φέρει το υβριδικό γονίδιο hsp27-GFP υπό τον έλεγχο της ευρύτερης 5΄ περιοχής του hsp27 γονιδίου, με σκοπό την μελλοντική μελέτη της κυτταρικής και ενδοκυτταρικής κατανομής της πρωτεΐνης Hsp27 κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 σε συνθήκες ψυχρού στρες. Και τα δύο γονίδια έδειξαν σημαντική έκφραση αυξανόμενου χρόνου επώασης στους 0 οC, με το Cchsp27 να παρουσιάζει υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σχέση με το Cchsp23. / The stress response in cells is connected with the induction of heat shock proteins (Hsps). The Hsps are part of the molecular chaperons system and their role is to protect the cells from the protein denaturation and aggregation. Most Hsps are produced under non-stress conditions and they play a significant role in the correct folding, transmission and degradation of the cell’s proteins. Hsps are being divided into families according to their molecular mass. One of these families is the small heat shock proteins (sHsps) with molecular mass 12-43 kDa. This family is being characterized with a highly conservative domain called α-crystallin, which is located in the C-terminal domain. One of the most well studied sHsp is Hsp27. Hsp27 has an important role as molecular chaperone but also it is implicated in other events such differentiation, apoptosis, cytoskeleton’s formation and the regulation of the oxidized balance of the cell. The results that had arisen from this project, have shown that the Cchsp27 gene is expressed under non-stress conditions during the medfly’s development and that its expression is being regulated during the insect’s developmental stages. Experiments that were performed in brain, ovaries and testes which were removed from individual adults, have shown that the Cchsp27 gene is expressed highly in the male brain and in testes, comparing with female brain and ovaries respectively. Experiments that were performed in larvae salivary glands have shown significant expression levels of the Cchsp27 gene, 24 hours before jumping stage. The expression levels of the Cchsp27 gene are being reduced until the jumping stage and then they increased in the white pupa stage. The expression levels of the Cchsp27 gene are being reduced for the next three stages. The salivary glands were incubated with the hormone ecdysone and the results from these cultures have shown that in high ecdysone concentrations there is a repression in the gene’s expression whereas in concentration of 10-6 M there has been an induction. Ovaries and testes were incubated also with ecdysone and the results indicate that the maximum Cchsp27 gene induction happens in ovaries that have been removed from newborn females, and in testes that have been removed from males of the age of two days. Also, part of this project was the construction of a transgenic strain that it carries the hybrid gene hsp27-GFP under the regulation of the 5΄upstream region of the hsp27 gene. This strain will be used in the future for the study of the cellular distribution of the Hsp27 protein during the medfly’s development. For the last part of this project we study the expression levels of Cchsp27 and Cchsp23 genes under cold shock conditions. Both genes are expressed and their expression levels are being raised as the time of incubation increases in 0 οC. The expression levels of Cchsp27 gene were higher in comparison with the expression levels of Cchsp23 gene.

The O’Brien lab has demonstrated that Heat shock protein 27 (HSP27)shows attenuated expression in human coronary arteries as the degree of atherosclerosis progresses. Moreover, over-expression of HSP27 reduces atherogenesis in mice. The precise mechanism(s) for HSP27-mediated "atheroprotection" are incompletely understood. Nuclear Factor-kappaB (NF-κB) is a key signaling modulator in atherogenesis. Hence, this project sought to determine if recombinant HSP27 (rHSP27) alters NF-κB signaling to affect atheroprotection. Treatment of THP1 macrophages with rHSP27 resulted in degradation of IκBα, coincided with nuclear translocation of the p65 subunit and produced transcriptional evidence of activation of NF-κB signaling. When the transcriptional profile of THP1 macrophages treated with rHSP27 was analyzed using NF-κB-pathway-specific qRT-PCR arrays, among the regulated genes, IL-10 and GM-CSF mRNA levels were markedly increased, as were parallel translational effects observed. These data provide new mechanistic insights into the atheroprotective effects of HSP27.

Die Glutaminylzyklase QC und ihr Isoenzym isoQC katalysieren die Umwandlung N-terminaler Glutaminylreste an einer Reihe von Neuropeptiden, Peptidhormonen und Chemokinen in Pyroglutamat. Diese post-translationale Modifikation schützt Proteine vor proteolytischem Abbau und trägt auch zu ihrer biologischen Aktivität bei. Im Falle der Alzheimerschen Erkrankung führt QC/isoQC-Aktivität allerdings zur Stabilisierung des Aβ-Peptids und begünstigt damit dessen Akkumulation und Aggregation in Amyloid-Plaques. Beide Enzyme unterscheiden sich in ihrer zelltypspezifischen Expression und ihrer Substratspezifität in vivo. Die QC kommt eher in neuronalen Geweben als sekretorisches Enzym vor, während die isoQC ubiquitär exprimiert wird und im Golgi-Apparat verankert ist. Im Gegensatz zur QC ist die isoQC beispielsweise in der Lage, das proinflammatorische monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1, auch CCL2 genannt) in seinen aktiven Zustand zu überführen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb untersucht werden, inwieweit beide Isoenzyme in chronische Entzündungsprozesse involviert sind. Als Modell für diese Untersuchungen wurde die systemische Cuprizon-Applikation als tierexperimenteller Ansatz für die nicht-invasive Induktion einer Entzündungsreaktion im Gehirn gewählt, um folgende Fragestellungen zu beantworten: 1. Lässt sich die Entzündungsreaktion, die durch Cuprizongabe ausgelöst wird, mittels Iba1-, GFAP- und Hitzeschockprotein 27 (Hsp27)-Immunhistochemie nachweisen? 2. Sind QC und isoQC an durch Cuprizon ausgelösten entzündlichen Prozessen beteiligt? 3. Unterscheiden sich QC- und isoQC-knock-out (ko)-Mäuse hinsichtlich der Entzündungsreaktion unter Cuprizongabe? Dazu wurden Wildtyp (WT)-Mäuse (n = 6), QC-ko (n = 3) und isoQC-ko (n = 3) Mäuse einer sechswöchigen Gabe von 0,3 % Cuprizon im Futter unterzogen, was Tagesdosierungen von 12,9–13,5 mg Cuprizon pro Tier entspricht. Das Cuprizon als Kupferchelator löst einen Demyelinisierungsprozess ähnlich der histopathologischen Veränderungen bei Multipler Sklerose aus, der mit Chemotaxis von Immunzellen und Aktivierung von Gliazellen einhergeht. Als Kontrollgruppe wurden je vier unbehandelte Geschwistertiere der Genotypen WT, QC- und isoQC-ko-Mäuse herangezogen. In der Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1. Die Gliazellaktivierung wurde mit einer immunhistochemischen Färbung von Iba-1, einem Marker für Mikroglia, saurem Gliafaserprotein (GFAP) als Astrozytenmarker und dem Nachweis von Hitzeschockprotein 27 untersucht. Die Mikroglia- und Astrozytenaktivierung wurde durch Ermittlung des prozentualen Gliaanteils pro Fläche der jeweiligen Hirnregion erfasst, Hsp27-exprimierende Gliazellen wurden in jeder untersuchten Hirnregion an standardisierten mikroskopischen Aufnahmen des BZ-9000 Mikroskops der Firma Keyence unter Zuhilfenahme der BZ-II-Analyzer-Software manuell ausgezählt. Die ermittelten Flächen und Zellzahlen wurden mit der Graph-Pad-Prism 6-Software mittels ungepaarter t-Tests statistisch ausgewertet. Zu den Hirnstrukturen, die auf eine Entzündungsreaktion hin untersucht wurden, gehören das Corpus callosum, das Cingulum, die externe Kapsel, das Septum, das Striatum und dessen Faserbündel, der Cortex, die anteriore Kommissur, das ventrale Pallidum sowie der Hippocampus. Sowohl in Iba-1-, GFAP- und Hsp27-Färbung konnte bei den WT-Tieren in nahezu allen untersuchten Hirnregionen eine signifikante Erhöhung des Mikro- und Astroglia-Gewebeanteils sowie der Hsp27-Expression in Astrozyten nach Cuprizongabe gezeigt werden. Mikro- und Astrogliaaktivierung wurden bereits in früheren Studien mit Cuprizon-Applikation nachgewiesen, die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt die Wirksamkeit der Cuprizongabe und verdeutlicht die Entzündungsantwort auf zellulärer Ebene. Die Hsp27-Expression in Astrozyten konnte in dieser Arbeit erstmalig im Cuprizonmodell nachgewiesen werden und stellt eine neue, zelluläre Komponente der Entzündungsreaktion dar. 2. Mit Nachweis des Einflusses der isoQC auf die Aktivierung von CCL2 in peripheren Entzündungsmodellen vermutete man eine Beteiligung der Glutaminylzyklasen auch bei entzündlichen Prozessen im Gehirn. Es zeigte sich, dass QC-ko- und isoQC-ko-Tiere ohne Cuprizongabe im Mittel höhere gliäre Gewebeanteile und Hsp27-Expression aufwiesen als die unbehandelten WT-Geschwistertiere. In der hier stichprobenartig untersuchten Kohorte deutet dies auf eine Funktion der Glutaminylzyclasen für die Aktivierung von Gliazellen und eine teilweise Grundaktivierung in nativen QC-/ isoQC-ko-Tieren hin. Auf die Cuprizonbehandlung reagierten die ko-Tiere weniger stark als WT-Tiere mit Steigerung der Mikro- und Astrogliaaktivität oder erhöhter Hsp27-Expression. Das Fehlen der Glutaminylzyclasen führt somit möglicherweise zur Dämpfung einer chronischen Entzündungsantwort. 3. Inwiefern beide Glutaminylzyklasen zur vermuteten Entzündungshemmung beitragen, war ein weiterer Teil der Promotionsarbeit. Betrachtete man die Mikroglia in unbehandelten Tieren, zeigte sich in isoQC-ko-Mäusen eine höhere Grundaktivität als in WT- und QC-ko-Genotyp. Die dadurch im Verhältnis geringere Steigerung der Mikrogliaaktivität nach Cuprizongabe bei den isoQC-ko-Tieren im Vergleich zu Tieren des WT oder QC-ko-Genotyps könnte auf die fehlende Aktivierung des CCL2 zurückgeführt werden. Der isoQC-ko-Genotyp zeigte auch bei der Hsp27-Färbung unter den drei untersuchten Genotypen die geringste Steigerung der Hsp27-Expression nach Cuprizongabe, sodass die isoQC möglicherweise bei der Stimulation zur Expression dieses Hitzeschockproteins beteiligt ist. In den Iba-1-Färbungen zeigte sich auch, dass bei den QC-ko-Tieren unter Cuprizonapplikation Mikroglia in geringerem Maße aktiviert wird als bei WT- und isoQC-ko-Mäusen. Außerdem ergab die Auswertung der Hsp27-Expression von Astrozyten eine im Vergleich stark erhöhte Hsp27-Expression vor Cuprizongabe bei den QC-ko-Tieren. Das Fehlen der vorwiegend neuronal vorkommenden QC in den hier untersuchten zentralnervösen Strukturen hat möglicherweise gravierendere Auswirkungen auf zelluläre entzündliche Prozesse als das Fehlen der isoQC, die, ubiquitär vorkommend, weniger spezifische Aufgaben in Neuronen innehaben könnte. Die Arbeit zeigt, dass sich das Cuprizon-Modell eignet, einen chronischen Entzündungsprozess im Gehirn nachzustellen, um nachgeschaltete inflammatorische zelluläre Reaktionen eines Organismus zu untersuchen. Die Betrachtung von Mikrogliaaktivierung und Hsp27-Expression scheint für die Untersuchung des Cuprizon-Modells besser geeignet zu sein als die Auswertung der Astrogliaaktivität, da die fein nuancierten Unterschiede zwischen den betrachteten Glutaminylzyklasen in den GFAP-Färbungen weniger gut nachweisbar waren. Um die oben dargelegten Ergebnisse besser statistisch untermauern zu können, sollte in fortführenden Untersuchungen eine höhere Anzahl an Tieren pro Versuchsgruppe angestrebt werden.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Glutaminylzyklasen 1 1.2 Das Cuprizon-Modell 3 1.2.1 Einführung in das Demyelinisierungsmodell 3 1.2.2 Aktivierung von Gliazellen 4 1.3 Mechanismen von Entzündungsreaktionen 5 1.3.1 Mikroglia 6 1.3.2 Astroglia 7 1.3.3 Hsp27 8 1.4 Zielstellung 9 2 Material und Methoden 10 2.1 Vorgehen bei der Cuprizonbehandlung 10 2.2 Versuchstiere 10 2.3 Präparation und Aufarbeitung des Hirngewebes 11 2.4 Auswahl der Schnittebenen 12 2.5 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen 16 2.6 Durchführung der Fluoreszenz-Färbungen 19 2.7 Geräte 20 2.8 Hard- und Software 20 2.9 Auswahl von Färbungen und Hirnregionen für die Auswertung 21 2.9.1 Auswahl und Auswertung der Iba1-Färbung 21 2.9.2 Auswahl und Auswertung der GFAP-Färbung 23 2.9.3 Auswahl und Auswertung der Hsp27-Färbung 24 3 Ergebnisse 25 3.1 Nachweis der Mikroglia-Aktivierung mittels Iba1-Färbung 26 3.1.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Mikroglia 30 3.1.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei Wildtyp-Mäusen 33 3.1.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei QC-ko-Mäusen 35 3.1.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Mikrogliaaktivierung bei isoQC-ko-Mäusen 36 3.1.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Mikrogliaaktivität nach Cuprizonbehandlung 38 3.2 Nachweis der Astroglia-Aktivierung mittels GFAP-Färbung 40 3.2.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Astroglia 44 3.2.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei Wildtyp-Mäusen 46 3.2.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei QC-ko-Mäusen 48 3.2.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Astrogliaaktivierung bei isoQC-ko-Mäusen 49 3.2.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Astrogliaaktivität nach Cuprizonbehandlung 50 3.3 Nachweis von Hsp27-Expression nach Cuprizonbehandlung 51 3.3.1 Vergleich der unbehandelten Genotypen hinsichtlich des Gewebeanteils von Hsp27-exprimierenden Astrozyten 53 3.3.2 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei Wildtyp-Mäusen 56 3.3.3 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei QC-ko-Mäusen 57 3.3.4 Einfluss der Cuprizonbehandlung auf die Hsp27-Expression in Astrozyten bei isoQC-ko-Mäusen 58 3.3.5 Vergleich der behandelten Genotypen hinsichtlich der Hsp27-Expression in Astrozyten nach Cuprizonbehandlung 59 4 Diskussion 61 Verweise X Zusammenfassung der Arbeit XXII Persönlicher und wissenschaftlicher Werdegang XXIV Eigenständigkeitserklärung XXV Danksagung XXVII

Although, severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) represents one of the biggest challenges in the world today, the exact immunopathogenic mechanism that leads to severe or critical Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) has remained incompletely understood. Several studies have indicated that high systemic plasma levels of inflammatory cytokines result in the so-called “cytokine storm”, with subsequent development of microthrombosis, disseminated intravascular coagulation, and multiorgan-failure. Therefore, we reasoned those elevated inflammatory molecules might act as prognostic factors. Here, we analyzed 245 serum samples of patients with COVID-19, collected at hospital admission. We assessed the levels of heat shock protein 27 (HSP27), soluble suppressor of tumorigenicity-2 (sST2) and 20S proteasome at hospital admission and explored their associations with overall-, 30-, 60-, 90-day- and in-hospital mortality. Moreover, we investigated their association with the risk of ventilation. We demonstrated that increased serum sST2 was uni- and multivariably associated with all endpoints. Furthermore, we also identified 20S proteasome as independent prognostic factor for in-hospital mortality (sST2, AUC = 0.73; HSP27, AUC = 0.59; 20S proteasome = 0.67). Elevated sST2, HSP27, and 20S proteasome levels at hospital admission were univariably associated with higher risk of invasive ventilation (OR = 1.8; p < 0.001; OR = 1.1; p = 0.04; OR = 1.03, p = 0.03, respectively). These findings could help to identify high-risk patients early in the course of COVID-19.

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Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C'est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j'ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d'inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d'Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j'ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J'ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2.

La fibrose pulmonaire peut être induite par différentes agressions comme certaines chimiothérapies et notamment la bléomycine. Elle est souvent idiopathique (FPI) sans étiologie retrouvée. Cette maladie, qui n’a pas de traitement efficace et un pronostic sombre, débute dans les régions sous-pleurales. Elle est caractérisée par la présence de myofibroblastes responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire qui va s’accumuler de façon disproportionnée. Ce dépôt excessif de collagène conduira à une perte des fonctions mécaniques du poumon et une limitation des échanges gazeux. L’origine des myofibroblastes est encore discutée mais une hypothèse récente propose que les cellules épithéliales puissent, sous l’influence de Transforming Growth Factor (TGF)-β1, une cytokine majeure du processus fibrosant, se transformer en myofibroblastes par un procédé nommé transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Dans ce travail, nous nous sommes intéressés dans un premier temps au rôle de la plèvre dans l’initiation de la FPI en développant un nouveau modèle de fibrose pleurale, puis nous avons étudié l’implication de la petite protéine de choc thermique HSP27 dans l’EMT. Enfin, nous nous sommes intéressés à la toxicité d’un dérivé de la bléomycine, la déglyco-bléomycine. Nous avons montré dans le premier projet que la bléomycine, quelque soit son mode d’administration, pouvait, si elle était associée à la présence de nanoparticules de carbone dans l’espace pleural (particules présentes dans la fumée de cigarette et dans la pollution), induire une fibrose pleurale progressive. Cette fibrose pleurale ne se limitait pas à une accumulation de collagène au niveau de la plèvre mais se propageait dans les régions sous-pleurales. Cette invasion de la fibrose s’expliquait par la capacité des cellules mésothéliales à subir une EMT. Dans une deuxième étude nous avons montré qu’HSP27 était fortement surexprimée au niveau de la plèvre et dans le parenchyme pulmonaire lors de la fibrose pulmonaire idiopathique et également dans nos différents modèles animaux de fibrose pulmonaire et pleurale. Nous avons montré in vitro qu’HSP27 était aussi fortement surexprimée au cours de l’EMT et que sa surexpression seule suffisait à induire une EMT. Au contraire, l’inhibition de son expression in vitro bloquait l’induction d’une l’EMT par le TGF-β1 et in vivo empêchait le développement de la fibrose pleurale et la migration des cellules mésothéliales dans le parenchyme pulmonaire. Enfin dans la troisième partie de notre travail, nous avons démontré chez le rongeur que la déglyco-bléomycine, dérivé de la bléomycine, avait le même effet anti-tumoral que cet anticancéreux mais sans sa toxicité pulmonaire fibrosante. Notre travail met en lumière le rôle probable de la plèvre dans l’initiation de la fibrose pulmonaire idiopathique. Nous espérons que nos travaux sur HSP27 et sur la déglyco-bléomycine vont pouvoir rapidement déboucher sur des applications thérapeutiques chez l’homme. / Pulmonary fibrosis could be induced by a number of injuries like chemotherapy (i.e. bleomycin) or could be idiopathic (IPF). This disease has currently no treatment. IPF classically starts in sub-pleural areas and is characterized by the presence of myofibroblasts producing the extracellular matrix that will accumulated into the parenchyma resulting in impaired lung functions and respiratory failure. The origin of the myofibroblasts is still debated but one recent hypothesis suggests that epithelial cells could become myofibroblasts through the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). This process is initiated by Transforming Growth Factor (TGF)-β1 one of the most, if not the most important cytokine involved in fibrotic process. In this work we focused on the role of the pleura in the onset of IPF and developed a new pleural fibrosis model in mice. We studied the implication of the heat shock protein 27 (HSP27) in pulmonary fibrotic processes. We then focused on the pulmonary toxicity of the deglyco-bleomycin a product derived from the anticancerous bleomycin. We demonstrated in the first part of our work that bleomycin was able, in combination with the presence of carbon nanoparticules in the pleural space (found in cigarette’s smoke and pollution), to induce a progressive pleural fibrosis. This pleural fibrosis was associated with a progression of the disease within the subpleural area as observed in IPF patients. This invasion within the parenchyma was explained by the fact that mesothelial cells undergo an EMT. In the second part of our work, we showed that HSP27 was overexpressed in the parenchyma and the pleura of IPF patients and also in all our pleural and pulmonary fibrosis models in rodents. Furthermore we established in vitro that HSP27 was also overexpressed during EMT and that its overexpression was sufficient to induce EMT. Additionally HSP27 inhibition blocks TGF-β1 induced EMT in vitro and blocks pleural fibrosis development and mesothelial cells migration within the parenchyma in vivo. In the last project we demonstrated that deglyco-bleomycin had the same anti-tumoral effect than bleomycin in vivo and was devoided from its pulmonary toxicity. This work highlights the potential role of the pleura in initiating IPF and may open fields for the development of new therapeutics by preventing pulmonary fibrosis initiation but also progression.

No

HIF1α et HIF2α sont des protéines largement impliquées dans le développement de pathologies posant des problèmes majeurs de santé publique, comme le cancer. Leur activité, qui est régulée prioritairement par leur stabilité via le système ubiquitine-protéasome, coordonne de nombreux processus cellulaires susceptibles de favoriser le développement de ces maladies. Un enjeu récent de la recherche thérapeutique est d'identifier des partenaires protéiques pouvant réguler les protéines HIFα, afin de mettre au point des thérapies ciblées. Les protéines de choc thermique (HSPs) sont une classe de protéines dont une des fonctions essentielles est de réguler l'homéostasie protéique dans la cellule, en interagissant avec le protéasome. Certaines d'entre elles, HSP27 et HSP90, ont la faculté de pouvoir réguler spécifiquement la stabilité de nombreuses protéines souvent elles-mêmes impliquées dans l'apparition de ces pathologies. L'objectif de ce travail était de savoir si ces deux HSPs peuvent contrôler la stabilité de la protéine HIF2α. Nos résultats suggèrent qu'HSP27 pourrait stimuler la dégradation de HIF2α en favorisant son ubiquitination. Ce résultat est surprenant, en raison du rôle connu d'HSP27 dans la progression tumorale. Il est donc nécessaire de le confirmer et d'en préciser les processus biologiques sous-jacents. D'autre part, nos autres résultats semblent confirmer qu'HIF2α est une protéine cliente d'HSP90. De plus, nous montrons pour la première fois que l'inhibition d'HSP90 par le 17-DMAG diminue la production de VEGF dépendante de HIF2α. Des travaux récents suggèrent qu'HIF2α a un rôle prédominant dans la progression tumorale, et peut constituer une cible globale de choix dans plusieurs types de cancer. Il conviendrait d'évaluer la capacité des inhibiteurs d'HSP90 à supprimer des fonctions de HIF2α nouvellement décrites, comme son rôle dans la maintenance des cellules souches cancéreuses.