The goal of this project was to determine the key regulators of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) potency as part of a cell-based therapy to treat inflammatory and autoimmune diseases. The immunomodulatory capacity of MSCs is dictated by multiple, interacting conditions that take place during the biomanufacturing of these cells, as well as after they are transplanted. Variables such as the source of MSCs and the inflammatory cues in their microenvironment are critical regulators of potency that can be manipulated and optimized prior to their use for an enhanced cell-based therapy. Herein, I took a systematic approach to isolating a single variable in the microenvironment of MSCs to determine its effect on the key immunomodulatory enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). I then manipulated these variables and applied them across multiple MSC donors to determine how their effect varied between cells isolated from different individuals. Finally, I conducted an in vitro potency assay with MSCs and Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) to determine how enhanced IDO due to these variables translated to immune suppression for an enhanced cell product. Upon transplantion, different disease settings have altered microenvironments that can hinder the efficacy of an MSC therapy. The microenvironment in obesity and type 2 diabetes (T2D) has elevated levels of the fatty acid palmitate which shifts the phenotype of MSCs from immune suppressive to pro-inflammatory. I demonstrated that manipulating the microenvironment of MSCs to enhance IDO protein concentration prior to transplant reverses the pro-inflammatory effects of palmitate and restores immune suppression by MSCs. My finding was that the appropriate environmental cues, along with a potent donor, yields a cell-based therapy that can overcome challenges in many disease settings such as obesity and T2D.

Triptofano (TRP), um amino ácido essencial, é metabolizado por duas vias principais, a via das quinureninas e a via serotonérgica. Em ambas as vias há a possibilidade de formação de compostos ativos no sistema imune que se caracterizam pelas ações imunossupressoras e indutoras de tolerância. Na via serotonérgica há a formação de serotonina (5-HT) e em alguns tecidos de melatonina (MEL). Este composto pode ainda ser oxidado por ação de peroxidases aos seus produtos de abertura de anel indólico o AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-metoxiquinuramina) e AMK (N1-acetil-5-metoxiquinuramina). Já na via das quinureninas, o TRP é diretamente metabolizado à N-formilquinurenina (NFK) e este é rapidamente deformilado a quinurenina (QUIN). Neste projeto avaliamos qual o efeito do choque endotóxico induzido por injeção endovenosa de LPS (1 mg/kg) sobre a biodisponibilidade de TRP e formação de seu metabólito QUIN. Este estudo foi realizado em condições controle e na vigência de sobrecarga de TRP (administração subcutânea de 0,8 mg/kg). Utilizamos ratos machos Wistar com 30 dias separados em quatro grupos: GI (controle), GII (LPS), GIII (TRP) e GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/Kg) foi injetado por via subcutânea nos tempos 0 e 2 horas. Quando injetado, LPS (1 mg/kg) foi administrado por via intravenosa no tempo 2 horas. Após 1 hora da última administração, sangue e cérebro foram coletados. O cérebro foi seccionado em três regiões: cerebelo, córtex e mesencéfalo, os quais foram processados para obtenção de homogenatos. Tanto os homogenatos quanto o soro foram tratados com acetona para extração de TRP e seus metabólitos. A análise destes compostos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A administração de TRP elevou significativamente a sua concentração no soro e no SNC. Quando da administração de LPS no grupo que já havia recebido sobrecarga de TRP (GIV) houve uma marcada elevação de TRP e de QUIN séricos e das regiões do SNC, especialmente na região do córtex. Concluímos que na vigência de choque endotóxico há um aumento da biodisponibilidade de TRP, tanto no soro como no SNC e que há um aumento da metabolização deste pela rota das quinureninas, possivelmente via IDO. Estes resultados contribuem para a compreensão da toxicidade de TRP, especialmente relevante no caso em que haja um choque endotóxico concomitante e evidencia o córtex como uma região mais susceptível para os efeitos tóxicos do TRP. / Tryptophan (TRP) is an essential amino acid, metabolized by two main paths; the kynurenine and the serotonergic pathways. In both, there is the possibility of generation of biologic active compounds, especially on the immune system leading to immunosuppression and tolerance. In the serotonergic path there is the formation of serotonine (5-HT) and in some tissues of melatonine (MEL). The latter can be oxidized by the action of peroxidases to its indole ring opening product AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-methoxikynuramine) and AMK (N1-acethyl-5-methoxykynuramine). In the kynurenine path, TRP is metabolized to N-formylkynurenine (NFK) that is deformilated to kynurenine (KYN). In this study we evaluated the effect of a endotoxic skock induced by an intravenous injection of LPS (1 mg/kg) on the bioavailability of TRP and formation of KYN. This study was carried out in control conditions and on TRP overload (subcutaneous administration of 0,8 mg/Kg). One month old male Wistar rats were divide in four groups: GI(control), GII(LPS), GIII(TRP) and GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/kg) was subcutaneously injected at zero and 2h times. When injected, LPS (1mg/kg) was intravenously administered at 2 h. After one hour from the last administration, blood and brain were collected. Brain is separated in cerebellum, midbrain and cortex and was lysed for the preparation of homogenates. Both, serum and homogenates were extracted in acetone; TRP and KYN were analyzed by HPLC. TRP overload caused a significant increase in its concentration in serum and brain. When LPS was administered in conjunction with TRP overload (GIV) there was a remarkable increase in TRP and KYN in serum and brain, especially in cortex. Our conclusion is that in the bioavailability of TRP, in serum and in brain, and its metabolization to kynurenine is increased by inflammation. IDO is probably involved in this condition. Our results contribute to the knowledge of TRP toxicity, particularly with a concomitant inflammation and demonstrate the cortex as a region of more susceptibility to TRP toxicity.

Triptofano (TRP), um amino ácido essencial, é metabolizado por duas vias principais, a via das quinureninas e a via serotonérgica. Em ambas as vias há a possibilidade de formação de compostos ativos no sistema imune que se caracterizam pelas ações imunossupressoras e indutoras de tolerância. Na via serotonérgica há a formação de serotonina (5-HT) e em alguns tecidos de melatonina (MEL). Este composto pode ainda ser oxidado por ação de peroxidases aos seus produtos de abertura de anel indólico o AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-metoxiquinuramina) e AMK (N1-acetil-5-metoxiquinuramina). Já na via das quinureninas, o TRP é diretamente metabolizado à N-formilquinurenina (NFK) e este é rapidamente deformilado a quinurenina (QUIN). Neste projeto avaliamos qual o efeito do choque endotóxico induzido por injeção endovenosa de LPS (1 mg/kg) sobre a biodisponibilidade de TRP e formação de seu metabólito QUIN. Este estudo foi realizado em condições controle e na vigência de sobrecarga de TRP (administração subcutânea de 0,8 mg/kg). Utilizamos ratos machos Wistar com 30 dias separados em quatro grupos: GI (controle), GII (LPS), GIII (TRP) e GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/Kg) foi injetado por via subcutânea nos tempos 0 e 2 horas. Quando injetado, LPS (1 mg/kg) foi administrado por via intravenosa no tempo 2 horas. Após 1 hora da última administração, sangue e cérebro foram coletados. O cérebro foi seccionado em três regiões: cerebelo, córtex e mesencéfalo, os quais foram processados para obtenção de homogenatos. Tanto os homogenatos quanto o soro foram tratados com acetona para extração de TRP e seus metabólitos. A análise destes compostos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A administração de TRP elevou significativamente a sua concentração no soro e no SNC. Quando da administração de LPS no grupo que já havia recebido sobrecarga de TRP (GIV) houve uma marcada elevação de TRP e de QUIN séricos e das regiões do SNC, especialmente na região do córtex. Concluímos que na vigência de choque endotóxico há um aumento da biodisponibilidade de TRP, tanto no soro como no SNC e que há um aumento da metabolização deste pela rota das quinureninas, possivelmente via IDO. Estes resultados contribuem para a compreensão da toxicidade de TRP, especialmente relevante no caso em que haja um choque endotóxico concomitante e evidencia o córtex como uma região mais susceptível para os efeitos tóxicos do TRP. / Tryptophan (TRP) is an essential amino acid, metabolized by two main paths; the kynurenine and the serotonergic pathways. In both, there is the possibility of generation of biologic active compounds, especially on the immune system leading to immunosuppression and tolerance. In the serotonergic path there is the formation of serotonine (5-HT) and in some tissues of melatonine (MEL). The latter can be oxidized by the action of peroxidases to its indole ring opening product AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-methoxikynuramine) and AMK (N1-acethyl-5-methoxykynuramine). In the kynurenine path, TRP is metabolized to N-formylkynurenine (NFK) that is deformilated to kynurenine (KYN). In this study we evaluated the effect of a endotoxic skock induced by an intravenous injection of LPS (1 mg/kg) on the bioavailability of TRP and formation of KYN. This study was carried out in control conditions and on TRP overload (subcutaneous administration of 0,8 mg/Kg). One month old male Wistar rats were divide in four groups: GI(control), GII(LPS), GIII(TRP) and GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/kg) was subcutaneously injected at zero and 2h times. When injected, LPS (1mg/kg) was intravenously administered at 2 h. After one hour from the last administration, blood and brain were collected. Brain is separated in cerebellum, midbrain and cortex and was lysed for the preparation of homogenates. Both, serum and homogenates were extracted in acetone; TRP and KYN were analyzed by HPLC. TRP overload caused a significant increase in its concentration in serum and brain. When LPS was administered in conjunction with TRP overload (GIV) there was a remarkable increase in TRP and KYN in serum and brain, especially in cortex. Our conclusion is that in the bioavailability of TRP, in serum and in brain, and its metabolization to kynurenine is increased by inflammation. IDO is probably involved in this condition. Our results contribute to the knowledge of TRP toxicity, particularly with a concomitant inflammation and demonstrate the cortex as a region of more susceptibility to TRP toxicity.

O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial

In Europa stellt die Multiple Sklerose (MS) die häufigste neuroimmunologische Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) dar. Relevante Daten zum Krankheitsverlauf der MS wurden durch Untersuchungen im Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelits (EAE) gewonnen. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand wandern autoreaktive T-Zellen vom T-Helfer-1 (Th-1) Typ in das ZNS ein und lösen eine gegen Bestandteile der Markscheide gerichtete Entzündung aus. Diese Zellen exprimieren große Mengen des für sie typischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-gamma), was in zahlreichen Zelltypen die Expression des Tryptophan degradierenden Enzyms Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) induziert. Seit 1998 ist bekannt, dass die Inhibition der IDO zu einer durch T-Zellen vermittelten Abstoßung allogener Feten führt. Diese immunregulatorische Funktion von IDO konnte auf den schnellen Abbau der essentiellen Aminosäure Tryptophan und der im folgenden Abbauweg synthetisierten T-Zell-toxischen Metabolite zurückgeführt werden. Da im entzündeten ZNS-Gewebe während der MS und der EAE das IDO induzierende Zytokin IFN-gamma ebenfalls exprimiert wird, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden in wie weit die IDO an der Immunregulation des ZNS unter autoimmuner Neuroinflammation während EAE, beteiligt ist. Mittels HPLC konnte gezeigt werden, dass die relative IDO Aktivität im ZNS während der akuten und der Erholungsphase der Erkrankung signifikant gesteigert ist. Erfolgte ab dem Ausbruch der Erkrankung die systemische Inhibition der IDO Aktivität mit dem spezifischen IDO-Inhibitor 1-Methyl-Tryptophan, so führte dies zu einem signifikant schwereren Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontrolltieren. Mittels Immunzytochemie wurde gezeigt, dass aktivierte Mikroglia IDO im entzündeten ZNS und in Zellkultur nach IFN-gamma Stimulation exprimieren. Aufgrund von RT-PCR Analysen weiterer Enzyme des Kynureninweges konnte dessen Regulation während EAE nachgewiesen werden Entlang dieses Stoffwechselweges werden T-zell-toxische Tryptophanmetabolite gebildet die an der Eliminierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS während der Erholungsphase der EAE beteiligt sein könnten und somit die aktivierten Th1 Zellen im ZNS einen antiinflammatorischen Rückkopplungsmechanismus auslösen. / Multiple sclerosis (MS) is the most widespread neuroimmunological disease of the central nervous system (CNS) in Europe. By applying the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), important insights into the disease course of MS have been gained. At present it is accepted that at the onset of the disease myelin-reactive T helper type 1 (Th1) cells infiltrate the CNS and induce autoimmune neuroinflammation. Activated Th1 cells express high amounts of the cytokine interferon-gamma (IFN-gamma). This pro-inflammatory signaling molecule is known to induce the expression of the tryptophan-degrading enzyme Indolmaine 2,3- Dioxygenase (IDO) in several cell types. Since 1998 it is known that inhibition of IDO induces the T cell-mediated rejection of allogeneic concepti in mice. The mechanism of this immunregulatory function of IDO was shown to be due to the degradation of the essential amino acid tryptophan and the subsequent synthesis of T cell toxic metabolites. Since the IDO-inducing cytokine IFN-gamma is also expressed within inflamed CNS tissue during MS and EAE, the present work investigated the role of IDO in immunregulation of the CNS during autoimmune neuroinflammation in the EAE model. A significant increase in relative IDO activity within the CNS during the acute and remission phases of EAE was identified by HPLC analysis. Systemic inhibition of IDO activity by the specific IDO inhibitor 1-methyl-tryptophan reduced the remission and exacerbated the progression of the disease in comparison to control animals. Activated microglia were identified by immunocytochemistry as IDO-expressing cells within the acute inflamed CNS and in cell culture after IFN-gamma stimulation. Enzymes following IDO in the kynurenine pathway were shown by RT-PCR to be up-regulated in the disease course. The analyzed enzymes are known to produce T cell toxic tryptophan metabolites and might therefore be involved in the elimination of autoreactive T cells from CNS tissue. In conclusion, the presented data support the view that autoreactive Th1 cells in the CNS induce a self-limiting negative feedback mechanism which limits the spread of inflammation, thereby reducing bystander damage in the CNS.

Em alguns casos, pacientes que sobreviveram a uma sepse grave podem desenvolver um quadro de imunossupressão, caracterizado pela expansão dos linfócitos T reguladores (Tregs). Porém, apesar de inúmeros avanços, os mecanismos associados à expansão das Tregs, ainda não estão completamente esclarecidos. Nesse sentido, trabalhos recentes demonstraram que a atividade da enzima Indoleamina 2,3-Dioxigenase (IDO), responsável pela formação da quinurenina a partir da degradação do aminoácido essencial triptofano, está relacionada à diferenciação das Tregs e com o desenvolvimento de um quadro de tolerância. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da IDO no desenvolvimento da imunossupressão induzida pela sepse. Os resultados demonstraram um aumento da expressão proteica e da atividade enzimática da IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse grave. Para avaliar o desenvolvimento da imunossupressão, os camundongos foram desafiados com células do melanoma B16-F10. A inibição farmacológica da IDO promoveu redução do crescimento tumoral nos camundongos que sobreviveram à sepse, por um mecanismo dependente da redução na diferenciação das Tregs e das células C11b+ Ly6G+ no baço e da ativação de células CD8+ produtoras de IFN- ?, no linfonodo drenate da região tumoral. Adicionalmente, foi demonstrado que, o receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR) está associado ao aumento da expressão da IDO, nos camundongos que sobreviveram à sepse. Ainda, os resultados demonstraram que células CD11C+ são as principais responsáveis por expressar a IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse. Por fim, células CD11C+ isoladas do baço de camundongos que sobreviveram a sepse, foram mais efetivas em induzir a diferenciação das Tregs quando comparadas a células CD11C+ provenientes de camundongos naive. Em conjunto, os resultados sugerem que a ativação do AhR pela quinurenina é importante para expressão da IDO nas células CD11C+ encontradas no baço de camundongos que sobreviveram à sepse, o que por sua vez, está associado com a expansão das Tregs e com o desenvolvimento do quadro de imunossupressão. / Immunosuppression has been shown to be one long-term sequels of severe sepsis, which is mainly characterized by the expansion of regulatory T cells (Tregs). However, the mechanisms underlying Tregs expansion after sepsis remain poor understood. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme that initiates the kynurenine pathway of tryptophan degradation, has been implicated in promoting Tregs generation. Therefore, we propose to investigate the role of IDO in the development of sepsis-induced immunosuppression. The results presented here demonstrated that there is an increase in both IDO protein expression and IDO enzymatic activity in spleen of sepsis-surviving mice. Employing a melanoma mouse model as a second challenge in sepsis-surviving mice, we found that pharmacological inhibition of IDO suppressed the enhanced tumor growth observed in sepsis-surviving mice. Importantly, inhibition of IDO decreased the expansion of Tregs in sepsis-surviving mice, leading to reduced CD11b+ Ly6G+ cells frequency in spleen and activation of INF-? production by CD8+ in draining lymph, after tumor challenge. Moreover, the results suggest that aryl hydrocarbon receptor (AhR) is associated with increased IDO expression found in sepsis-surviving mice. Furthermore, we identified that a CD11C+ population of cells are expressing IDO in spleen of sepsis surviving mice. In addition, CD11C+ cells isolated from spleen of sepsis-surviving mice, presented a higher capacity to induce a regulatory phenotype in naïve CD4+ CD25- T than CD11C+ isolated from naïve mice. Taken together, our results suggest that AhR activation by kynurenine during acute phase of sepsis is important to IDO expression in a specific CD11C+. This new sepsis-induced CD11C+ IDO+ population is important to Treg cells expansion and immunosuppression development in sepsis-surviving mice.

Em alguns casos, pacientes que sobreviveram a uma sepse grave podem desenvolver um quadro de imunossupressão, caracterizado pela expansão dos linfócitos T reguladores (Tregs). Porém, apesar de inúmeros avanços, os mecanismos associados à expansão das Tregs, ainda não estão completamente esclarecidos. Nesse sentido, trabalhos recentes demonstraram que a atividade da enzima Indoleamina 2,3-Dioxigenase (IDO), responsável pela formação da quinurenina a partir da degradação do aminoácido essencial triptofano, está relacionada à diferenciação das Tregs e com o desenvolvimento de um quadro de tolerância. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da IDO no desenvolvimento da imunossupressão induzida pela sepse. Os resultados demonstraram um aumento da expressão proteica e da atividade enzimática da IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse grave. Para avaliar o desenvolvimento da imunossupressão, os camundongos foram desafiados com células do melanoma B16-F10. A inibição farmacológica da IDO promoveu redução do crescimento tumoral nos camundongos que sobreviveram à sepse, por um mecanismo dependente da redução na diferenciação das Tregs e das células C11b+ Ly6G+ no baço e da ativação de células CD8+ produtoras de IFN- ?, no linfonodo drenate da região tumoral. Adicionalmente, foi demonstrado que, o receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR) está associado ao aumento da expressão da IDO, nos camundongos que sobreviveram à sepse. Ainda, os resultados demonstraram que células CD11C+ são as principais responsáveis por expressar a IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse. Por fim, células CD11C+ isoladas do baço de camundongos que sobreviveram a sepse, foram mais efetivas em induzir a diferenciação das Tregs quando comparadas a células CD11C+ provenientes de camundongos naive. Em conjunto, os resultados sugerem que a ativação do AhR pela quinurenina é importante para expressão da IDO nas células CD11C+ encontradas no baço de camundongos que sobreviveram à sepse, o que por sua vez, está associado com a expansão das Tregs e com o desenvolvimento do quadro de imunossupressão. / Immunosuppression has been shown to be one long-term sequels of severe sepsis, which is mainly characterized by the expansion of regulatory T cells (Tregs). However, the mechanisms underlying Tregs expansion after sepsis remain poor understood. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme that initiates the kynurenine pathway of tryptophan degradation, has been implicated in promoting Tregs generation. Therefore, we propose to investigate the role of IDO in the development of sepsis-induced immunosuppression. The results presented here demonstrated that there is an increase in both IDO protein expression and IDO enzymatic activity in spleen of sepsis-surviving mice. Employing a melanoma mouse model as a second challenge in sepsis-surviving mice, we found that pharmacological inhibition of IDO suppressed the enhanced tumor growth observed in sepsis-surviving mice. Importantly, inhibition of IDO decreased the expansion of Tregs in sepsis-surviving mice, leading to reduced CD11b+ Ly6G+ cells frequency in spleen and activation of INF-? production by CD8+ in draining lymph, after tumor challenge. Moreover, the results suggest that aryl hydrocarbon receptor (AhR) is associated with increased IDO expression found in sepsis-surviving mice. Furthermore, we identified that a CD11C+ population of cells are expressing IDO in spleen of sepsis surviving mice. In addition, CD11C+ cells isolated from spleen of sepsis-surviving mice, presented a higher capacity to induce a regulatory phenotype in naïve CD4+ CD25- T than CD11C+ isolated from naïve mice. Taken together, our results suggest that AhR activation by kynurenine during acute phase of sepsis is important to IDO expression in a specific CD11C+. This new sepsis-induced CD11C+ IDO+ population is important to Treg cells expansion and immunosuppression development in sepsis-surviving mice.

A presente pesquisa tem por objetivo estudar a produção das pinturas de paisagens do artista Ido Finotti, especificamente as paisagens de cerrado e rios da região do Triângulo Mineiro, principalmente da cidade de Uberlândia e seu entorno, Uberaba e Araguari, realizadas por ele entre os anos de 1947 a 1980, e compreender a sua poética identificando os elementos que o artista elencou para a construção da visualidade de paisagem como identidade regional, fazendo reflexões artísticas e históricas em diálogo com noções gerais da ideia de paisagem na história da arte universal e na história da arte brasileira através dos principais pintores do gênero paisagem. Para a formulação dessas reflexões, no primeiro momento discorremos sobre a trajetória de Ido Finotti para conhecê-lo em suas duas fases: a inicial como pintor decorador de paredes nas décadas de 1920 a 1940, e a posterior como artista pintor em óleo sobre tela. No segundo momento, buscamos autores nacionais e estrangeiros das áreas de artes visuais, história, história da arte, filosofia e geografia que produziram a literatura sobre a ideia e o tema de paisagem na pintura, fizemos um levantamento e leitura inicial de algumas obras do artista, das quais 142 são paisagens, realizamos entrevistas e coleta de artigos de jornais e revistas e reunimos documentos, folhetos e catálogos relacionados ao artista e suas obras. O cruzamento dessas fontes escritas e visuais possibilitou a construção textual do trabalho de pesquisa aqui apresentado. / This research studies the landscape paintings of the artist Ido Finotti, specifically the Brazilian cerrado vegetation and rivers landscape paintings, in the region of Triângulo Mineiro, mainly Uberlândia and the surrounding cities as Uberaba and Araguari. The artist produced the landscape paintings from 1947 to 1980. This study searches to understand the poetic in the paintings and identify the elements that the artist chose to create the visuality of landscape to build a regional identity. Therefore, it links the artistic and historical reflections with the general ideas about the landscape painting in the Universal History of Art and in the Brazilian History of Art through the main landscape painters. First, this work shows the trajectory of the artist Ido Finotti and the two phases of his paintings: as a decorative painter of walls from 1920 to 1940, then as an oil painter artist on canvas. Second, the national and foreign authors studied were from several fields: Visual Arts, History, History of the Art, Philosophy and Geography, but had produced literature on the idea and the subject of landscape in the painting. The initial reading was about some workmanships of Ido Finotti, which included 142 landscapes paintings; interviews; articles, periodicals and magazines collected; documents, brochures and catalogues gathered. The comparison between the written and visual sources made possible the textual construction of this research. / Dissertação (Mestrado)

O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial

No description available.