Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 110.pdf: 1330597 bytes, checksum: 23ed5e7ab657bb9c29c75987db8a4052 (MD5) Previous issue date: 2008 / Este estudo buscou fazer um diagnóstico da situação atual da determinação da potência do soro antibotrópico e anticrotálico no Brasil, assim como propor e avaliar materiais de referência e metodologias alternativas (potência relativa e inibição da citotoxicidade in vitro) à metodologia oficial, com o objetivo de melhor avaliar a qualidade do soro antibotrópico utilizado no Brasil. Entre os anos de 2000 e 2006 o INCQS analisou 619 lotes de soros antiofídicos. Neste período, oito lotes foram considerados insatisfatórios (1,29%). O desempenho dos Padrões de Referência foi avaliado pela determinação da repetibilidade e da reprodutibilidade através do Coeficiente de Variação (CV). A repetibilidade para o lote BRA/BOT/04 foi de 16,57%, para BRA/BOT/05 de 13,17%, para BRA/CROT/01 de 31,82% e para BRA/CROT/02 de 17,36%. Em um estudo interlaboratorial foi avaliada a reprodutibilidade da DL50 do lote BRA/BOT/05 (CV = 16,76%) e a repetibilidade, que variou entre 7,48% e 10,88% nos diferentes laboratórios. A correlação de Pearson entre as determinações da potência dos soros antibotrópicos feitas pelo INCQS e laboratórios produtores foi de 0,286 o que é considerada uma correlação regular, a correlação das determinações da potência dos soros anticrotálicos foi de 0,002 o que é considerado insatisfatório. Nenhum dos venenos de referência apresentou perda de potência significativa nas condições ideais de armazenamento, demonstrando a boa estabilidade destas preparações. O soro BRAantiBot/01 apresentou uma potência de 6,62 mg/mL, com CV de 11%. A correlação de Pearson entre os valores obtidos pelas metodologias de potência relativa e absoluta foi de 0,785, o que é considerado como uma boa correlação. Foi desenvolvida uma metodologia in vitro para a determinação da atividade citotóxica do veneno de B. jararaca e do soro antibotrópico em células VERO. Esta metodologia se propõe como uma alternativa ao ensaio de letalidade em camundongos, metodologia oficial vigente. O valor da DCt50 do veneno BRABOT/05 foi de 2,92 ug/mL. A precisão interensaios para as determinações da DL50 pelo método dose Citotóxica 50% in vivo apresentou um CV de 12,27% enquanto que para as determinações in vitro da DCt50 o CV foi de 7,19%. A correlação de Pearson entre os resultados obtidos pelas duas metodologias foi de 0,96, o que é considerado uma correlação excelente. A potência de BRAantiBOT/01 pelo método in vitro foi de 3.092,6 mg/mL. A repetibilidade apresentou um CV de 56,81%. Neste trabalho foi proposto que a potência do soro antibotrópico seja expressa em Unidades Neutralizantes (UN) e que cada UN corresponda à capacidade de 1 mL de soro antibotrópico neutralizar 1 mg de Veneno Botrópico de Referência. / This study aims to make a diagnosis of the potency evaluation of bothropic and crotalic antivenoms in Brazil, as well as evaluate the performance of reference materials and alternatives (relative potency and in vitro cytotoxicity inhibition) to the pharmacopeic methods trying to improve the quality of antivenoms used in Brazil. Between 2000 and 2006, 619 lots of antivenoms were tested at INCQS. In this period, eight lots were unsatisfactory (1.29%). The Reference Standards performance was evaluated through the Coefficient of Variation (CV). The repeatability for the lot BRA/BOT/04 was 16.7%, for BRA/BOT/05 was 13.7%, for BRA/CROT/01 was 31.2% and for BRA/CROT/02 was 17.36%. The reproducibility for LD50 determinations of BRABOT/05 was evaluated through an interlaboratorial study and the CV was 16.76%, the repeatability varied between 7.48% and 10.88% in the participant laboratories. The correlation between the potency determinations for bothropic antiserum done by INCQS and manufacturers was 0.286, which is considered fair. The correlation for crotalic antiserum was 0.002 what is considered unsatisfactory. No one of the Reference Venoms lose potency significatively, giving evidence of a good stability profile in shelf conditions. The antiserum BRAantiBot/01 had a potency of 6.62 mg/mL, with a CV of 11%. The correlation between the values obtained through the methodologies of relative and absolute potency was 0.785, which is considered a good correlation. We also developed an in vitro methodology for the determination of the cytotoxic activity of B. jararaca venom and bothropic antivenom on VERO cells. This method is proposed as an alternative to the mice lethality test, the official methodology in vigour. The CtD50 of the reference venom BRABOT/05 was 2,92 ug/mL. The inter-assay precision for the LD50 (in vivo method) had a CV of 12.27%, while for the in vitro method (CtD50) the CV was 7.19%. The correlation between the results obtained by the two methods was 0.96, which is considered an excellent correlation. The potency of BRAantiBOT/01 obtained through the in vitro method was 3,092.6 mg/mL. The repeatability of this method has a CV of 56.81%. In this work, we propose that the bothropic antivenom potency should be expressed in Neutralizing Units (NU) and that each NU correspond to the ability of 1 mL of antivenom to neutralize 1 mg of Bothropic Reference Venom.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3716.pdf: 15456968 bytes, checksum: 4a39e68e7b10a9e50bb83087365cf289 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / Ten herbs used in traditional medicine supported by literature for its effectiveness to osteoarticular diseases were selected to conduct a screening of inhibition activity against the cathepsin K, an important enzyme responsible for cleavage of collagen, the main constituent of extracellular matrix of cartilage and bone. Out of the ten herbs selected (ginger, saffron, camellia, cat s claw, mentrasto , moringa , babaçu , devil s claw, urtica e pequi ), one, gengibre (Z. officinale), should be highlighted by a high inhibitory activity of its extracts and fractions against cathepsin K and due to its ancient use as a therapeutic agent. From the dichloromethane fraction obtained of the crude extract of the rhizome of Z. officinale were isolated and identified 18 compounds (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8-shogaol, 10-shogaol, 6- paradol, 6-gingerdiol, methyl 6-gingerol, methyl 6-shogaol, diacetoxy-6-gingerdiol, methyl diacetoxy-6-gingerdiol, zingerone, gingerenone A, galanolactone, 3-acetoxy- 5-hydroxy-1,7-bis(4 -hydroxy-3 -methoxyphenyl)-heptane and hexahydrocurcumin). From the hexane fraction and essential oil were identified two monoterpenes and four sesquiterpenes. The most active compounds against cathepsin K were gingerols and shogaols with longer alkyl chain. Optimization of the separation of major compounds (6, 8 and 10-gingerol) and an overload study of C18 column was performed using HPLC, obtained as result dozens to hundreds of milligrams of each gingerol with high purity. Structural modifications of 6-gingerol were carried out and of the seven derivatives obtained 4 presented significant increase in inhibition of cathepsin K. Of all the compounds, three, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, were selected for later tests: determinating of the mode the inhibition against cathepsin K, inhibition against cathepsin K and inhibition of nitric oxide (NO) production, in cellular culture. The inhibitions determined were: partially noncompetitive, partially uncompetitive and complete uncompetitive for the SSi6, 10-gingerol and 6-shogaol, respectively. Excellent inhibition activity against the cathepsin K, in cellular culture, can be observed for SSi6 and 6-shogaol. In the inhibition assay of NO production, the 6- shogaol was the only compound that appeared as effective. / Dez plantas utilizadas pela medicina tradicional com indicativos na literatura de suas eficácias frente a doenças osteoarticulares foram selecionadas para a realização de uma triagem de atividade inibitória frente à catepsina K, uma importante enzima responsável pela clivagem do colágeno, principal constituinte da matriz extracelular da cartilagem e ossos. Das dez plantas selecionadas (gengibre, açafrão, camélia, unha-de-gato, mentrasto, moringa, babaçu, garra-do-diabo, urtigão e pequi), uma, gengibre (Zingiber officinale), merece destaque pela alta inibição de seu extrato e frações frente à catepsina K e por seu uso milenar como agente terapêutico. Da fração de diclorometano obtida do extrato bruto dos rizomas de Z. officinale isolou-se e identificou-se 18 substâncias (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8- shogaol, 10-shogaol, 6-paradol, 6-gingerdiol, metil-6-gingerol, metil-6-shogaol, diacetato de 6-gingerdioila, diacetato de metil-6-gingerdioila, zingerona, gingerenona A, galanolactona, 3-acetato de 5-hidroxi-1,7-bis(4 -hidroxi-3 -metoxifenil)-heptila e hexaidrocurcumina). Da fração de n-hexano e do óleo essencial, foram identificados 2 monoterpenos e 4 sesquiterpenos. As substâncias mais ativas frente à catepsina K foram os gingerois e shogaois de maior cadeia alquílica. Otimização da separação das substâncias majoritárias (6, 8 e 10-gingerol) e um estudo de sobrecarga de uma coluna C18 por CLAE, foram realizados, obtendo-se como resultado o isolamento de dezenas a centenas de miligramas de cada gingerol com considerável grau de pureza. Modificações estruturais do 6-gingerol foram realizadas e, das sete substâncias obtidas, 4 tiveram um aumento considerável do poder inibitório. Das substâncias obtidas, três, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, foram selecionadas para ensaios posteriores: determinação do tipo de inibição frente à catepsina K, inibição da catepsina K e inibição da produção de óxido nítrico (NO), em meio celular. As inibições determinadas foram não-competitiva parcial, acompetitiva parcial e acompetitiva completa, para o SSi6, 10-gingerol e 6-shogaol, respectivamente. Excelentes atividades de inibição frente à catepsina K, em meio celular, puderam ser observadas para o SSi6 e 6-shogaol. No ensaio de inibição da produção de NO, o 6- shogaol foi a única substância que se apresentou como efetivo.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 742482 bytes, checksum: 16c68ac95e43019b42c1b1b057afd7e3 (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Because of the diversity of its indigenous microbiota, goat milk is considered a good source of new strains of lactic acid bacteria (LAB) with potential for exploitation as alternatives to food biopreservation. The increasing consumer demand for these alternatives justifies studies to investigate the antimicrobial potential of these microorganisms. The present study aimed to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial action range of autochthonous strains of BAL isolated from goat milk that can be potentially used as biopreservatives in food. The bacteriocinogenic activity against Listeria monocytogenes and stability in different environmental conditions were also the target of this study. Fifty-seven isolates of BAL (33 isolates of Enterococcus spp., and 24 isolates of Lactococcus spp.), previously characterized as bacteriocinogenic by genotypic and phenotypic methods, were subjected to macrorestriction with SmaI and PFGE and their profiles were compared with the results of bacteriocinogenic genes previously searched. High genetic diversity was observed for both genders. Although PFGE showed sufficient discriminatory power, isolates with different results for bacteriocinogenic genes were grouped as identical in both genders. Twelve isolates from Lactococcus spp. and eighteen isolates of Enterococcus spp., representing different pulsotypes, were selected for evaluation of the antimicrobial activity range against 46 target microorganisms (including BAL, pathogens and spoilage microorganisms). Lactococcus strains showed a wide spectrum against the targets, especially against L. monocytogenes and Clostridium spp.. Enterococcus spp., similarly, was able to inhibit various targets, acting mainly against Listeria spp. Gram- negative microorganisms also showed sensitivity to isolates of both genders. Six isolates (four Enterococcus spp., and two Lactococcus spp.) were evaluated for bacteriocinogenic potential against L. monocytogenes strains from different serotypes and all of them were inhibited by bacteriocins produced by these LAB. Additionally, bacteriocins produced by these isolates showed a wide range of stability at different pH values and temperatures. The data showed that goat milk can contain a diverse microbiota able to inhibit microorganisms of interest to the food industry and can be potentially employed in biopreservation of foods produced at different processing conditions. / O leite de cabra, devido a diversidade de sua microbiota autóctone, é considerado uma boa fonte de novas cepas de Bactérias Ácido Láticas (BAL) com potencial para exploração como alternativas à biopreservação de alimentos. A crescente demanda dos consumidores por essas alternativas justifica estudos que investiguem o potencial antimicrobiano desses micro-organismos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e o espectro de ação de cepas de BAL antagonistas autóctones de leite de cabra que podem ser potencialmente utilizadas como biopreservantes em alimentos. A atividade bacteriocinogênica contra Listeria monocytogenes e estabilidade das bacteriocinas em diferentes condições ambientais também foram alvo deste trabalho. Cinquenta e sete isolados de BAL (33 isolados de Enterococcus spp. e 24 isolados de Lactococcus spp.), previamente caracterizados como bacteriocinogênicos por metodologias genotípicas e fenotípicas, foram submetidos à macrorrestrição com a enzima SmaI e PFGE e seus perfis foram comparados aos resultados de genes bacteriocinogênicos previamente pesquisados. Alta variabilidade genética foi observada para ambos os gêneros. Embora o PFGE tenha apresentado poder discriminatório suficiente, isolados com diferentes resultados para genes de bacteriocinas foram agrupados como idênticos em ambos os gêneros. Doze isolados de Lactococcus spp. e dezoito isolados de Enterococcus spp., representativos de diferentes pulsotipos, foram selecionados para avaliação do espectro de ação antimicrobiana contra 46 micro- organismos indicadores (incluindo BAL, micro-organismos deteriorantes e patógenos). Os isolados de Lactococcus spp. demonstraram amplo espectro de ação sobre os micro-organismos alvo, com destaque para a atividade contra os patógenos L. monocytogenes e Clostridium spp.. Enterococcus spp., de modo similar, foi capaz de inibir diversos micro-organismos alvo, apresentando atividade principalmente contra Listeria spp. Cepas Gram-negativas também apresentaram sensibilidade aos isolados de ambos os gêneros. Seis isolados (quatro Enterococcus spp. e dois Lactococcus spp.) foram avaliados quanto ao potencial bacteriocinogênico contra cepas de L. monocytogenes de diferentes sorotipos e todos os sorotipos foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas pelas BAL. Adicionalmente, as bacteriocinas produzidas por estes isolados apresentaram ampla faixa de estabilidade em diferentes valores de pH e temperaturas. Os dados obtidos demonstraram que o leite de cabra pode conter uma microbiota bacteriocinogênica diversificada, capaz de inibir micro-organismos de interesse à indústria de alimentos, podendo ser potencialmente empregadas na bioconservação de alimentos produzidos em diferentes condições de processamento.

CNPQ; Fundação Araucária / As bacteriocinas possuem amplo espectro de atividade antimicrobiana sobre diversas bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos. Diversos gêneros bacterianos produzem enterocinas, dentre estes, o gênero Enterococcus sp. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de enterocinas produzidas por linhagens de Enterococcus faecium, nos pHs 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 e 6.5 onde o meio de cultura foi suplementado com lactose, manose, manitol, glicerol, tween® 20 e tween® 80 com diferentes concentrações. Os testes de antagonismo foram realizados contra a bactéria Listeria innocua CLIP 12612. Diante dos melhores parâmetros para a produção de enterocina, estas foram testadas quanto a estabilidade diante da ação dos produtos químicos SDS, EDTA, Tween® 20, Tween® 80 e NaCl, temperaturas de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C por 30 minutos e 121°C por 15 minutos, diversos pHs 3, 5, 7 e 9, adsorção e sobre sua ação bactericida e/ou bacteriostática. Os resultados obtidos mostram que, os pHs ótimo de produção foram entre 6,0 e 6,5 e as suplementações com maior atividade de inibição foram lactose 20 g/L, glicerol 20 g/L, tween®20 5,0g/L. Estes suplementos também foram acrescidos juntos no meio MRS sendo denominado de MIX. As enterocinas permaneceram estáveis aos pHs analisados e mantiveram sua atividade inibitória após tratamento térmico até 100°C por 30 minutos. Porém, houve uma redução na atividade das enterocinas quando submetida a 121°C por 15 minutos.Dentre os produtos químicos avaliados, o SDS e EDTA foram os que apresentaram maior atividade sendo que a enterocina produzida com o Mix foi a que apresentou maior halo de inibição. Também foi evidenciado efeito bactericida e/ou bacteriostática e a adsorção de maior porcentagem ocorreu entre 60-65% entre ambas enterocinas produzidas. Os resultados obtidos indicam que, as enterocinas produzidas pelas linhagens de Enterococcus faecium possuem potencial de aplicabilidade em alimentos como bioconservadores. / Bacteriocins has a broad spectrum of antimicrobial activity on various pathogenic and deteriorating bacterium in food. Several bacterial genera produce enterocins, between them, the genus Enterococcus sp. The objective of this study was to study the production of enterocins produced by Enterococcus faecium in the pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 and 6.5 where the culture medium was supplemented with lactose, mannose, mannitol, glycerol, tween® 20 and tween 80 with different concentrations. The antagonistic tests used bacterium Listeria innocua CLIP 12612. About the best parameters for the production of enterocin, these were tested for stability against the action of the chemicals SDS, EDTA, Tween® 20, Tween® 80 and NaCl, Temperatures of 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C for 30 minutes and 121°C for 15 minutes, various pHs 3, 5, 7 and 9, adsorption and on their bactericidal and/or bacteriostatic action. The results showed that the pH great of production was between 6.0 and 6.5, and the supplements with larger inhibition activity were lactose 20 g/L, glycerol 20 g/L and tween®20 5.0 g/L. These supplements also were added in the medium MRS, referred to as MIX. The enterocins remained stable at the analyzed pHs and maintained their inhibitory activity after heat treatment at 100°C for 30 minutes. However, had reduction in the activity of the enterocins when submitted to 121°C for 15 minutes. Among the chemicals evaluated, the SDS and EDTA were the ones that presented the highest activity, and the enterocins produced with the Mix showed the highest inhibition halo. It was also evidenced effect bactericidal and/or bacteriostatic, and the highest percentage adsorption occurred between 60-65% between enterocins produced. The results indicate that the enterocins produced by Enterococcus faecium strains have potential applicability in foods as bioconservatives.

CNPQ; Fundação Araucária / As bacteriocinas possuem amplo espectro de atividade antimicrobiana sobre diversas bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos. Diversos gêneros bacterianos produzem enterocinas, dentre estes, o gênero Enterococcus sp. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de enterocinas produzidas por linhagens de Enterococcus faecium, nos pHs 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 e 6.5 onde o meio de cultura foi suplementado com lactose, manose, manitol, glicerol, tween® 20 e tween® 80 com diferentes concentrações. Os testes de antagonismo foram realizados contra a bactéria Listeria innocua CLIP 12612. Diante dos melhores parâmetros para a produção de enterocina, estas foram testadas quanto a estabilidade diante da ação dos produtos químicos SDS, EDTA, Tween® 20, Tween® 80 e NaCl, temperaturas de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C por 30 minutos e 121°C por 15 minutos, diversos pHs 3, 5, 7 e 9, adsorção e sobre sua ação bactericida e/ou bacteriostática. Os resultados obtidos mostram que, os pHs ótimo de produção foram entre 6,0 e 6,5 e as suplementações com maior atividade de inibição foram lactose 20 g/L, glicerol 20 g/L, tween®20 5,0g/L. Estes suplementos também foram acrescidos juntos no meio MRS sendo denominado de MIX. As enterocinas permaneceram estáveis aos pHs analisados e mantiveram sua atividade inibitória após tratamento térmico até 100°C por 30 minutos. Porém, houve uma redução na atividade das enterocinas quando submetida a 121°C por 15 minutos.Dentre os produtos químicos avaliados, o SDS e EDTA foram os que apresentaram maior atividade sendo que a enterocina produzida com o Mix foi a que apresentou maior halo de inibição. Também foi evidenciado efeito bactericida e/ou bacteriostática e a adsorção de maior porcentagem ocorreu entre 60-65% entre ambas enterocinas produzidas. Os resultados obtidos indicam que, as enterocinas produzidas pelas linhagens de Enterococcus faecium possuem potencial de aplicabilidade em alimentos como bioconservadores. / Bacteriocins has a broad spectrum of antimicrobial activity on various pathogenic and deteriorating bacterium in food. Several bacterial genera produce enterocins, between them, the genus Enterococcus sp. The objective of this study was to study the production of enterocins produced by Enterococcus faecium in the pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 and 6.5 where the culture medium was supplemented with lactose, mannose, mannitol, glycerol, tween® 20 and tween 80 with different concentrations. The antagonistic tests used bacterium Listeria innocua CLIP 12612. About the best parameters for the production of enterocin, these were tested for stability against the action of the chemicals SDS, EDTA, Tween® 20, Tween® 80 and NaCl, Temperatures of 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C for 30 minutes and 121°C for 15 minutes, various pHs 3, 5, 7 and 9, adsorption and on their bactericidal and/or bacteriostatic action. The results showed that the pH great of production was between 6.0 and 6.5, and the supplements with larger inhibition activity were lactose 20 g/L, glycerol 20 g/L and tween®20 5.0 g/L. These supplements also were added in the medium MRS, referred to as MIX. The enterocins remained stable at the analyzed pHs and maintained their inhibitory activity after heat treatment at 100°C for 30 minutes. However, had reduction in the activity of the enterocins when submitted to 121°C for 15 minutes. Among the chemicals evaluated, the SDS and EDTA were the ones that presented the highest activity, and the enterocins produced with the Mix showed the highest inhibition halo. It was also evidenced effect bactericidal and/or bacteriostatic, and the highest percentage adsorption occurred between 60-65% between enterocins produced. The results indicate that the enterocins produced by Enterococcus faecium strains have potential applicability in foods as bioconservatives.

O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

O entendimento dos mecanismos de representação e processamento de odores pelo sistema olfatório é uma das questões centrais da neurociência moderna. Os odores são codificados pela circuitaria interna do bulbo olfatório em padrões espaço-temporais refletidos pela atividade de suas células de saída, as células mitrais e tufosas, que transmitem os resultados das computações dessa estrutura inicial de processamento a regiões corticais superiores. A arquitetura das conexões existentes no bulbo olfatório apresenta inibição lateral em duas camadas diferentes de sua estrutura laminar, intermediadas por dois tipos distintos de interneurônios. Na camada glomerular, mais externa, a inibição lateral é mediada pelas células periglomerulares e na camada plexiforme externa, mais interna, a inibição lateral é mediada pelas células granulares. O papel desses dois níveis distintos de inibição lateral e os mecanismos segundo os quais eles atuam moldando os padrões espaço-temporais de resposta do bulbo olfatório a odores diferentes são ainda pouco conhecidos. O objetivo deste trabalho foi construir um modelo de rede neural biologicamente plausível do bulbo olfatório para investigar como dois tipos diferentes de interneurônios, atuando em estágios distintos de processamento, podem contribuir para a discriminação de odores e a coordenação dos padrões de disparo das células mitrais. O modelo de rede construído, com representação de odores pela atividade das células mitrais e baseado nas interações recíprocas entre essas células e os interneurônios inibitórios, mostrou que a inibição gerada pelas células periglomerulares pode melhorar o contraste entre odores similares, facilitando a discriminação de odores, enquanto que a inibição das células granulares atua no refinamento da resposta de saída da informação olfatória. / The understanding of odor representation and processing mechanisms by the olfactory system is one of the central questions of modern neuroscience. Odors are encoded by the olfactory bulb circuitry in terms of spatiotemporal spiking patterns. These are reflected in the activity of the mitral cells, which are the output cells of the olfactory bulb that transmit the information processed in this early structure to higher cortical regions. The architecture of the olfactory bulb connections presents lateral inhibition at two different layers of its laminar structure, mediated by two distinct types of interneurons. In the glomerular layer, lateral inhibition is mediated by periglomerular cells. In the external plexiform layer, lateral inhibition is mediated by granule cells. The role of these two different lateral inhibition levels and the mechanisms whereby they shape the spatial and temporal patterns of the olfactory bulb response to different odors is not well known. The aim of this work was to build a biologically plausible neural network model of the olfactory bulb to investigate how two different types of interneurons, acting at different processing stages, could contribute to odor discrimination and the coordination of the mitral cells spiking patterns. The results of simulations of the network model shown that the inhibition generated by periglomerular cells can provide contrast enhancement and odors discrimination, while the granule cell inhibition can refine the output response of the olfactory information.

Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-05-05T18:44:25Z No. of bitstreams: 1 fernanda arnhoud pagnussatt - inibio do crescimento de espcies do complexo fusarium.pdf: 1615887 bytes, checksum: daa606d7216768f4d2df2f8137006ec3 (MD5) / Approved for entry into archive by cleuza maria medina dos santos (cleuzamai@yahoo.com.br) on 2016-05-05T20:35:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernanda arnhoud pagnussatt - inibio do crescimento de espcies do complexo fusarium.pdf: 1615887 bytes, checksum: daa606d7216768f4d2df2f8137006ec3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-05T20:35:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernanda arnhoud pagnussatt - inibio do crescimento de espcies do complexo fusarium.pdf: 1615887 bytes, checksum: daa606d7216768f4d2df2f8137006ec3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fusarium é um gênero de fungo comumente encontrado em grãos e alimentos a base de cereais e reconhecido produtor de uma ampla gama de micotoxinas. A necessidade de aumentar a segurança alimentar norteia a busca por substâncias naturais como alternativa ao uso de fungicidas químicos. Compostos fenólicos têm demonstrado propriedades antifúngicas e antimicotoxigênicas e a incorporação dessas substâncias em sistemas carreadores, tais como lipossomos, pode preservar ou mesmo potencializar este efeito. Em função disso, o objetivo do trabalho foi estudar a atividade antifúngica de compostos fenólicos extraídos de Spirulina sp. LEB-18 na forma livre e encapsulada visando aplicá-los para diminuir o impacto da contaminação micotoxicológica em grãos por espécies filogenéticas do complexo Fusarium graminearum (Fg). Primeiramente, algumas rotas metabólicas foram avaliadas através da determinação de compostos estruturais (glicosamina e ergosterol) e da atividade de enzimas do metabolismo primário de 12 isolados de Fg em presença do extrato fenólico. A concentração necessária para inibir 50% o crescimento micelial (IC50) foi obtida em valores correspondentes entre 3 a 8% (v/v) de extrato fenólico e a glicosamina foi o indicativo de inibição que melhor representou o efeito inibidor sobre o crescimento fúngico. Padrões de ácidos fenólicos foram testados e comparados ao extrato fenólico de Spirulina, sendo observado que o ácido gálico foi o que apresentou maior efeito inibidor, porém inferior ao extrato fenólico de Spirulina. A incorporação do extrato fenólico em lipossomos alterou a dinâmica das regiões polares e apolares da fosfatidilcolina da membrana lipídica, influenciando a região fosfato do lipídio e aumentando a fluidez dos metilenos presentes na cauda apolar da membrana. Este efeito está relacionado com a inibição superior a 90% no crescimento de isolados do complexo Fg em presença de lipossomos contendo 8% de extrato fenólico (v/v). A produção de glicosamina foi reduzida de 11,5 mg g-1 para 6,1 mg g-1 no meio com lipossomo puro e extrato fenólico incorporado ao lipossomo, respectivamente, e aumentou em 15 vezes e 6 vezes a inibição da produção das micotoxinas NIV e 15AcDON. Ficou demonstrado que a técnica de encapsulamento garantiu a manutenção das propriedades de compostos bioativos, com atividade antifúngica e antimicotoxigênica superior ao extrato fenólico livre. / Fusarium is a fungal strain commonly found in grains and foods from cereals and a recognized mycotoxin producer. The need to increase food safety leads the search for biologically active natural substances as an alternative to the sinthetic fungicides. Phenolic compounds have demonstrated antifungal and antimicotoxigenic properties and the incorporation of these substances in carrier systems such as liposomes, may can preserve or even enhance this effect. As a result, this work aimed to study the antifungal activity of phenolic compounds extracted from Spirulina sp. LEB-18 in free and encapsulated form in order be applied in the reduction of the impact of micotoxin contamination in grains by Fusarium graminearum (Fg). First, the possibility affected metabolic pathways potentially affected were evaluated by determining structural compounds (glucosamine and ergosterol) and the enzymatic activity corresponding to primary metabolism of Fg 12 isolates in the presence of phenolic extract. The half inhibition concentration of fungal growth (IC50) was obtained in phenolic extracts concentrations between 3-8% (v/v) and glucosamine was the inhibition indicative which best represented the inhibitory effect on fungal growth. Phenolic acids standards were tested comparatively to Spirulina phenolic extract, and among them, being gallic acid showed the greatest inhibitory effect. However, this effect was lower than the Spirulina phenolic extract. The phenolic extract incorporation in lipossomes change the dynamics of the lipid membrandes of phosphatidylcholine polar and nonpolar regions, influencing the lipid phosphate region and increasing the fluidity of methylenes present in apolar hydrophobic acyl chains. This effect is related to the Fg growth inhibition of the complex isolates, wich was greater than 90% in the presence of liposomes containing 8% phenol extract (v/v). The production of glucosamine was reduced from 11.5 mg. g-1 to 6.1 mg. g-1 in the medium with pure liposome and phenolic extract incorporated into the liposome, respectively and increased by 15 and 6 times the inhibition of the mycotoxins NIV and 15AcDON. This showed that encapsulation technique ensured the maintenance of bioactive compounds with antifungal activity and antimicotoxigenic properties above the free phenolic extract.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:33:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_BrunaZucolotoda_M.pdf: 3730198 bytes, checksum: aee2e21aa8a8998b409bff4636299519 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A versatilidade enzimática foi abordada nesta dissertação desde a triagem de microorganismos para a seleção de biocatalisadores adequados, e estudos de interações intermoleculares presentes em sistemas complexos de promiscuidade enzimática, até avaliação da inibição de enzimas relacionadas a ocorrência de diversas enfermidades. As triagens enzimáticas de micro-organismos isolados de água de drenagem de mina de prospecção de cobre permitiram a identificação de hidrolases e monoxigenases, sendo que as cepas de bactérias que apresentaram as melhores atividades oxidativas mostraram-se promissoras para oxidação de diversas classes de sulfetos, em ensaios de biocatálise convencional. A atuação promíscua de lipases foi avaliada frente a oxidação de cetonas cíclicas em meio orgânico, e as interações intermoleculares deste sistema foram estudadas por RMN, onde foi observado características de um sistema organizado em micelas reversas. A partir destas evidências, foi proposto que a condição necessária para a reação enzimática é o confinamento da enzima num ambiente aquoso restrito limitado por uma barreira molecular de ácido graxo. Finalmente a inibição da atividade enzimática de proteína tirosina fosfatases foi avaliada com implementação de uma metodologia fluorimétrica rápida e eficiente. Logo, este trabalho apresentou uma visão ampla no campo da enzimologia com o emprego de biocatalisadores, sejam eles enzimas isoladas ou células íntegras, em estudos relacionados a aspectos químicos, bioquímicos e terapêuticos das enzimas / Abstract: In this thesis the enzymatic versatility was evaluated in microorganisms selecting specific biocatalysts, in studies of intermolecular interactions of complex systems focusing enzyme promiscuity, and last in enzyme inhibition related to the occurrence of various diseases. The enzymatic screening of microorganisms isolated from copper mine water drainage led to the identification of hydrolases and monooxygenases, and bacterial strains with relevant oxidative activities were further investigated in larger scale oxidation of several sulfides. The promiscuous activity of lipases was evaluated in organic medium catalyzing the oxidation of cyclic ketones. The supramolecular interactions involved in these reactions were studied by NMR, revealing the presence of reverse micelles in a highly organized system. Therefore confinement of the enzyme in a restricted aqueous environment limited by a narrow molecular barrier of fatty acids in an organic medium is the necessary condition for this enzymatic reaction to occur. Finally, inhibition of enzymatic activity of protein tyrosine phosphatases was assessed with the implementation of a quick and efficient fluorimetric method. The data presented herewith provide a broad vision of enzyme application, as isolated enzymes or whole cells, in studies addressing chemical, biochemical and therapeutic issues / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tosetto_GiseleMantei_D.pdf: 7845574 bytes, checksum: c216dd147ba44b14c8004a51300ce14b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O objetivo geral deste trabalho foi avaliar os efeitos de algumas substancias organicas presentes no melaco de cana-de-acucar sobre cepas de leveduras de uso industrial. O Capitulo I refere-se a uma breve introducao e historico da fermentacao alcoolica. No Capitulo II, foi analisado amostras de melacos industriais, provenientes de 10 unidades produtoras de acucar e alcool, localizadas nos estados de Sao Paulo, Minas Gerais, Goias e Parana, com a finalidade de determinar e quantificar alguns compostos organicos presentes no mesmo. Para tanto foi utilizada a tecnica de Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (CLAE). No Capitulo III foram realizados ensaios para escolher as cepas de melhor desempenho em condicoes de estresse, utilizando-se o planejamento fatorial 23 tipo estrela com triplicata no ponto central. Os fatores estudados foram: a pressao osmotica (utilizando KCl), temperatura e concentracao inicial de Alcool. As cepas Y904 e SA1 foram as que mais se destacaram. No Capitulo IV foram avaliados os efeitos dos compostos organicos (acidos cafeico, galico, latico, piruvico, siringico, vanilico, acetico, formico, butirico e Hidroximetilfurfural) sobre as cepas SA1 e Y904, atraves de fermentacoes em triplicata, utilizando meio sintetico controle e variando as concentracoes de cada composto. Dentro das concentracoes estudadas, apenas os acidos galico, latico, acetico, formico, butirico e Hidroximetilfurfural demonstraram influencia sobre as cepas. A avaliacao do efeito acumulativo das substancias quando se trabalha com reciclo de celulas esta descrita no Capitulo V. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos por oito vezes consecutivas (8 ciclos). O acido latico foi a substancia que mais interferiu no rendimento em etanol (YP/S) e na produtividade, parametros estes de maior importancia nos processos industriais para producao de alcool. Por outro lado, o acido formico apresentou a menor interferencia e efeito negativo para praticamente todos os parametros estudados. Finalmente no Capitulo VI, foram analisados os efeitos dos acidos latico e formico sobre o comportamento cinetico das cepas SA1 e Y904. Os testes foram realizados em biorreator de bancada, por dez horas de fermentacao. O acido latico aumentou tanto a inibicao pelo substrato como pelo produto, mostrando-se ser uma substancia com alto grau de toxicidade para as celulas de leveduras das linhagens estudadas. " RANAXTAU/EJAXGU" / fermentacao alcoolica, cinetica, substratos industriais, compostos organicos, inibicao, levedura / Abstract: The general objective of this project was the evaluation of the effects of some organic substances present in molasses, sugar cane on strains of yeast for industrial use. Chapter I refer to a brief introduction and history of alcoholic fermentation. In Chapter II, samples of industrial molasses were examined, from 10 units producing sugar, located in the states of Sao Paulo, Minas Gerais, Goias, and Parana, in order to determine and quantify some organic compounds present in them. In order to this, the technique for High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used. In Chapter III trials were conducted to choose the strains of better performance in terms of stress, using a 23 factorial planning star type with triplicate in central point. The studied factors were: the osmotic pressure (using KCl), temperature and initial concentration of alcohol. The strains Y904 and SA1 were those which stressed most. In Chapter IV were assessed the effects of organic compounds (caffeic, gallic, lactic, pyruvic, syringic, vanillic, acetic, formic, butyric and Hidroximetilfurfural acids) on the strains SA1 and Y904 by the fermentation in triplicate, using synthetic medium and control varying concentrations of each compound. Within the concentrations studied, only the gallic acid, lactic acid, acetic acid, formic, butyric and Hidroximetilfurfural demonstrated influence on the strains. The assessment of the cumulative effect of the substances when working with recycle cell is described in Chapter V. All experiments were performed in triplicate and repeated by eight consecutive times (8 cycles). The lactic acid is the substance that interfere most in income in ethanol (YP/S) and productivity, these parameters of most importance in industrial processes to produce alcohol. Moreover, the formic acid showed the smallest negative interference for almost all parameters studied. Finally in Chapter VI, were analyzed the effects of lactic acid and formic on the behavior of kinetic strains SA1 and Y904. The tests were performed in bench bioreactor for ten hours of fermentation. The lactic acid increased by inhibiting both the substrate and the product, showing to be a substance with a high degree of toxicity to the strains of yeast cells studied. YQTFU" /" alcoholic fermentation, kinetics, industrial substract, organic compounds, inhibition, yeast / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química