Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können. / Cancer patients receiving antibodies as mono-therapy have benefited from these treatments. However, significant improvements could be made if the antibodies were used in combination with conventional chemotherapy. Having learned from the natural oligoclonal antibody response that cancer patients mount to their own tumours, we suppose that cocktails of monoclonal antibodies could be even more active in treating cancer. We have isolated a series of human monoclonal IgM antibodies from cancer patients, which bind to different tumor-specific surface receptors and induce apoptosis in vitro and in vivo. To study the antibody-mediated effects in cocktails, the antibodies were applied in different combinations to pancreas carcinoma cells and analyzed in cytotoxic assays. Depending on their target, it was found that some combinations showed a significant additive or synergistic killing effect, when compared to mono-therapy. We also investigated a combinatorial treatment with chemotherapy on pancreas and colon cancer cells and found that a pretreatment with 5-FU sensitizes the cancer cells to antibody treatment. Based on our own results and data from other laboratories, it is likely that the next phase of antibody immunotherapy will include cocktails of monoclonal antibodies.

Diabetes mellitus Typ 1 und Allergien vom Soforttyp gehören zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des Kindes- und Jugendalters. Diabetes mellitus Typ 1 wird verursacht durch eine autoimmune Zerstörung der Beta-Zellen des Pankreas. Aus immunologischer Sicht wird dieser Prozess durch TH1-Zellen dominiert. Im Gegensatz dazu wird vermutet, dass Allergien vom Soforttyp, wie die allergische Rhinitis, das allergische Asthma und die allergische Urtikaria mit TH2-Zellen assoziiert seien. Die Hypothese, dass TH1- und TH2-Zellen sich gegenseitig in ihrer Aktivität hemmen, ist immer noch gültig. Ziel unserer Fall-Kontroll-Studie war es, die Assoziation zwischen Typ 1 Diabetes und IgE-vermittelten Allergien zu untersuchen. Zur Prüfung unserer Forschungshypothese wurden ein standardisierter, evaluierter Fragebogen sowie verschiedene Laboranalysen herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass Diabetes mellitus Typ 1 mit einem erhöhten Risiko für das gleichzeitige anamnestische Vorliegen IgE-vermittelter allergischer Symptome assoziiert sein könnte. Somit konnten wir bestätigen, dass die noch heute weit verbreitete TH1/TH2-Hypothese eine Vereinfachung tatsächlich viel komplizierterer immunologischer Vorgänge darstellt. Um diese Assoziation im Detail zu prüfen, bedarf es jedoch weiteren populationsbasierten epidemiologischen Studien.:I. Bibliographische Beschreibung 7 II. Abkürzungsverzeichnis 9 1. Einführung 11 1.1 Epidemiologie und Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 1 11 1.2 Epidemiologie und Pathogenese von Allergien vom Soforttyp 13 1.3 Aktueller Forschungsstand zum Thema 14 2. Das Promotionsprojekt 17 2.1 Forschungshypothese und Fragestellung 17 2.2 Patienten und Methoden 17 2.3 Statistische Datenauswertung 19 2.4 Ergebnisse 20 2.5 Einordnung in den aktuellen wissenschaftlichen Diskurs 23 3. Publikationsmanuskript 29 4. Zusammenfassung der Arbeit 43 5. Literaturverzeichnis 47 III. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 55 IV. Curriculum Vitae 57 V. Liste der Veröffentlichungen 59 VI. Danksagung 61

I den här studien har metoder för att separera immunoglobulin (IgG) utvecklats med hjälp av kapillärelektrofores (CE) och Ultra högupplösande vätskekromatografi-Mass spektrometri (UHPLC-MS). Vid analysen av peptider från IgG spjälkat av trypsin (IgG TD) detekterades 26 glykopepeptider med UHPLC-MS genom att använda olika gradienter och mobilfaser. Dessutom analyserades fyra olika koncentrations av IgG TD för att testa detektionsgränsen. Resultatet visade att glykopeptider kunde detekteras i alla fyra koncentrationer men antalet detekterade glykopeptider minskade med minskande koncentration. Den sista delen av UHPLC-MS analysen var en selektivitetsanalys där en blandning av bovint serumalbumin spjälkat av trypsin (BSA TD) och IgG TD analyserades i olika koncentrationer. Selektivitetsanalysen visade att ungefär samma antal IgG glykopeptider detekterades som vid analys av IgG TD. Vid CE-analysen användes tre olika kapillärer, varav två av dem var polyvinylalkohol-coated och olika buffertlösningar (BGE) användes. De slutgiltiga resultaten visade 5 toppar som skulle kunna representera IgG gykopeptider men eftersom ingen MS utfördes kunde inga slutsatser dras. Slutligen, användes Matrix-Assisted Laser desorption/ionisation-time-of-flight (MALDI-TOF) för att analysera proverna innan analys och för att jämföra resultaten med UHPLC-MS. / In this study, methods to separate immunoglobulin G (IgG) glycopeptides were developed using capillary electrophoresis (CE) and ultra-high-performance liquid chromatography-Mass spectrometry (UHPLC-MS). In the UHPLC-MS- analysis, 26 glycopeptides were detected during the analysis of trypsin digested IgG (IgG TD) using different gradients and mobile phases. Moreover, a limit of detection study with four different concentrations (0.01, 0.1, 0.5 and 2mg/mL) was performed. Although the number of detected glycopeptides decreased with decreasing concentration, glycopeptides were detected in the 0.01 mg/mL IgG TD sample. Lastly, a selectivity study was performed, in which two trypsin digested Bovine serum albumin (BSA TD) and IgG TD mixtures with different concentrations were analysed. The results showed that approximately the same number glycopeptides were detected as in the IgG sample suggesting that the BSA sample did not interfere with the detection of glycopeptides. Moreover, the CE-analysis included three different capillaries and several background electrolytes (BGEs). Two of the capillaries were polyvinyl alcohol (PVA) coated. The final electropherogram showed five peaks possibly representing IgG glycopeptides but no MS were performed on the CE part leading to no conclusions for the CE-part. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation- time-of flight (MALDI-TOF) was performed throughout the project to control the samples and for comparison to the UHPLC-MS analysis.

Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. <br /> In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. <br /> Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden. / The Leukocyte Receptor Complex (LRC) is a DNA region on human chromosome 19 with a length of approximately 900.000 base pairs. A number of genes, which are located in this chromosomal region, are known to be important for the function of some types of white blood cells (leukocytes). The products of theses genes are proteins, which are located on the surface of these cells and enable them to interact with their environment. These proteins are also called receptors. They can bind to cell surface proteins on other cells and transmit resulting signals into the leukocyte. <br /> During my work I analyzed the chromosomal organization of the LRC in detail. To do so, I reconstructed the whole chromosomal region from smaller overlapping DNA fragments. Due to the DNA sequences contained within these fragments it was possible to put the whole chromosomal region together like a puzzle. The following analyses of the LRC showed that it is mainly composed of three regions, so called clusters. These clusters are characterised by the presence of only one receptor family. These are the immunoglobulin-like transcripts (ILTs) and the killer cell Ig-like receptors (KIR) respectively. In the LRC the KIR- and ILT-Clusters are flanked by additional receptor genes, which are evolutionary related to KIRs and ILTs. The number of receptor genes in the LRC varies between individuals, their can be up to 31 genes on each chromosome. <br /> On the basis of the data obtained in this work as well as data from the human genome project it was also possible to draw conclusions concerning the evolutionary development of the LRC. I developed a hypothesis of the origin of the LRC and discussed this in comparison to other species. <br /> In the second part of my thesis I developed a new technique based on the so-called ’hyper-branched rolling circle amplification′ (HRCA). This technique allows the detection of small differences between two or more DNA molecules, so called ’single nucleotide polymorphisms′ (SNPs). With this newly developed method it is possible to distinguish very similar variants of a gene, e.g. two KIR sequences, and to determine their relative concentration. The method can also be used to detect mutations, which are associated with certain diseases and could therefore be used for diagnostic purposes.

Background. Seasonal allergic rhinitis (SAR) is a chronic disease affecting about 23% of the European population with increasing prevalence rates. Beside classical symptoms (i.e. sneezing, nasal congestion), patients frequently complain about subjective impairments in cognitive functioning during periods of acute allergic inflammation. However, objective evidence for such deficits or the role of potential modulators and underlying mechanisms is limited. The present study aimed to investigate the effect of SAR on attention-related cognitive processes. In addition, relationships between attention performance, sleep and mood disturbances as well as specific disease characteristics as potential modulators of this link were explored. Method. SAR patients (n = 41) and non-allergic healthy controls (n = 42) completed a set of attention tasks during a symptomatic allergy period and during a non-symptomatic period. Influences of sleep, mood, total immunoglobulin E (IgE) levels and individual allergy characteristics on cognitive performance were evaluated. Results. Compared to healthy controls, SAR patients had a slower processing speed during both symptomatic and nonsymptomatic allergy periods. Additionally, they showed a more flexible adjustment in attention control, which may serve as a compensatory strategy. Reduction in processing speed was positively associated with total IgE levels whereas flexible adjustment of attention was linked with anxious mood. No association was found between SAR-related attention deficits and allergy characteristics or sleep. Conclusions. SAR represents a state that is crucially linked to impairments in information processing and changes in attentional control adjustments. These cognitive alterations are more likely to be influenced by mood and basal inflammatory processes than sleep impairments or subjective symptom severity.

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektorlymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigenspezifischer Effektorzellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain-Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3-Zeta-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusionsproteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Genkonstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro-Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA+ Kolonkarzinomzellinien durch die scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumorzellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFcZeta+ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33+ myeloischen Leukämiezellinie KG1. Die Bestrahlung wurde zur Wachstumsbegrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA+ Tumorzellen mit bestrahlten scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR+ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blutlymphozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumorantigenspezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert wird und ein Potential zur Behandlung minimaler Tumorerkrankungen besteht. / The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 Zeta chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA+ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcZeta+ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcZeta+ YT cells mediated a specific lysis of the CD33+ myeloic leukemia cell line KG1. The irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcZeta+ YT cells against CEA+ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA+ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcZeta+ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR+ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro. The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

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Clinical application of natural killer (NK) cells against leukemia is an area of intense investigation. In human leukocyte antigen-mismatched allogeneic hematopoietic stem cell transplantations (HSCT), alloreactive NK cells exert powerful anti-leukemic activity in preventing relapse in the absence of graft-versus-host disease, particularly in acute myeloid leukemia patients. Adoptive transfer of donor NK cells post-HSCT or in non-transplant scenarios may be superior to the currently widely used unmanipulated donor lymphocyte infusion. This concept could be further improved through transfusion of activated NK cells. Significant progress has been made in good manufacturing practice (GMP)-compliant large-scale production of stimulated effectors. However, inherent limitations remain. These include differing yields and compositions of the end-product due to donor variability and inefficient means for cryopreservation. Moreover, the impact of the various novel activation strategies on NK cell biology and in vivo behavior are barely understood. In contrast, reproduction of the thirdparty NK-92 drug from a cryostored GMP-compliant master cell bank is straightforward and efficient. Safety for the application of this highly cytotoxic cell line was demonstrated in first clinical trials. This novel ‘off-theshelf’ product could become a treatment option for a broad patient population. For specific tumor targeting chimeric-antigen-receptor-engineered NK-92 cells have been designed.

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) microscopy is a novel method of optical imaging for the localization and quantification of target molecules in cells and tissue specimens. The major advantages of SERS over fluorescence are quantification and spectral multiplexing due to the small line width of vibrational Raman bands. The position of the plasmon band of both hollow gold/silver nanoshells and silica-encapsulated gold nanoclusters can be tuned for maximum SERS enhancement upon red laser excitation, which is optimal for minimizing the disturbing autofluorescence of tissue. In this work, silica-encapsulated and non-encapsulated SERS particles were used for the localization of target proteins in prostate tissue specimens. Two different biofunctionalization methods were established for each type of SERS particles. The cross-linking method based on s-NHS/EDC chemistry was modified for covalently conjugating proteins to hollow gold/silver nanoshells and gold nanostars in order to minimize the aggregation of SERS nanoparticles during and after cross-linking. As an alternative to covalent conjugation chemistry, the noncovalent binding of antibodies to the SERS particles via an adapter protein (protein A/G) was established. The influence of several factors that determine the quality of results obtained by SERS imaging, such as the number of immuno-SERS conjugates, incubation time, antigen retrieval and blocking buffer, were investigated. Rapid SERS microscopy with 30 msec acquisition time per pixel was enabled by using silica-encapsulated gold nanoclusters for the localization of p63 proteins on prostate tissue specimens from healthy donors. Two-color SERS experiments for the parallel localization of PSA and p63 were performed with silica-encapsulated and non-encapsulated nanoshells. The quality of the results depends less on the nature of the surface chemistry of the nanoparticles (with or without silica encapsulation), but more on the blocking buffer and the antigen retrieval method. Silica-encapsulated gold nanoclusters were also used for the simultaneous quantification of three cytokines (IL1, IL8 and TNF- α) in a SERS-based sandwich immunoassay with a detection limit of ca. 0.3 pM. Keywords: Raman, SERS microscopy, biocompatibility of nanoparticles, cross-linking, antigen unmasking methods, antigen detection, immunohistochemistry, immunoassay.