Les plaquettes jouent un rôle majeur dans l'hémostase primaire ainsi que dans l'inflammation. Elles contiennent et sécrètent une grande variété de facteurs solubles et parmi les nombreux récepteurs qu'elles expriment à leur surface, les plaquettes expriment les " Toll-Like Receptor " (TLR), récepteurs clés de l'interaction entre l'immunité innée et adaptative. En réponse à un stimulus infectieux, comme le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram-négative, ligand naturel du TLR4, ou des peptides issus d'une partie de la protéine d'enveloppe du VIH (gp41), les plaquettes vont s'activer de manière différentielle. L'activation plaquettaire est variable en fonction de leur activation par à un stimulus hémostatique (exemple : la thrombine) vs. infectieux (exemple : le LPS) ; le panel de cytokines libérées dans le surnageant plaquettaire semble en fait finement régulé. De plus, nous avons démontré la présence intra-plaquettaire de la majorité des protéines composant les voies de signalisation du TLR4 eucaryote. Nous avons ensuite montré que ces voies pouvaient être modulées. L'engagement du TLR4 plaquettaire par deux types biochimiques de LPS entraîne un relargage différentiel des facteurs solubles immunomodulateurs dans le surnageant de culture et que ce surnageant dernier génère une activation différentielle des cellules cibles, comme les cellules mononucléées du sang circulant. Ces travaux montrent que la réponse inflammatoire plaquettaire est régulée en fonction du stimulus. Ainsi, mes travaux s'inscrivent dans la ré-exploration de la fonction inflammatoire des plaquettes sanguines et l'étude du rôle des plaquettes comme cellules de l'immunité innée et inflammatoire

La dérégulation des facteurs NF-κB, impliqués dans la survie cellulaire et l'inflammation, peut entraîner des pathologies inflammatoires chroniques et des cancers. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier des régulateurs négatifs des voies NF-κB conservées au cours de l'évolution, Toll et Imd, chez la drosophile. De nombreux éléments de ces voies sont régulés par ubiquitination. Les « Ubiquitine Specific Proteases » (USPs) constituent ainsi un nouveau champ d'investigation pour rechercher des régulateurs de ces voies. J'ai réalisé le crible d'une collection d'ARN interférents permettant l'inactivation des 21 USPs de drosophile en cellules S2. Ce crible a mis en évidence trois régulateurs négatifs de la voie Imd, dont un montre également une activité sur la voie Toll. Parmi ces candidats, dUSP36, un homologue de la protéine humaine USP36, avait été préalablement sélectionné par un crible génétique au laboratoire. Des études de l'équipe auxquelles j'ai contribué, montrent son rôle in vivo dans la régulation négative de la protéine adaptatrice Imd via son activité catalytique. Afin de caractériser la fonction des deux autres USPs, j'ai mené des expériences de transgénèse chez la drosophile qui prouvent que ces deux USPs répriment la voie Imd en cas d'infection et qu'elles sont requises pour maintenir l'état inactif de la voie Imd en l'absence d'infection. J'ai également entrepris de caractériser l'activité catalytique des deux USPs in vitro. L'originalité de mon travail a consisté à limiter le crible à une famille de gènes, ce qui a permis de détecter de nouveaux régulateurs qui n'avaient pas été mis en évidence dans des cribles antérieurs.

Candida albicans est une levure commensale du tube digestif humain mais aussi un opportuniste vrai. Il est à l'origine de candidoses superficielles et de candidoses profondes avec un taux de mortalité élevé (30 à 40% des cas). La transition saprophyte-pathogène s'opère à la suite d'une baisse des défenses immunitaires de l'hôte (locales ou générales), permettant la multiplication des levures. Les travaux développés dans le laboratoire depuis les années 90, ont montré que les glycannes pariétaux des levures sont des stimuli pour la cellule macrophagique. Le but de ce travail a été de déterminer l'implication des glycannes présents dans la paroi des levures dans l'induction et la régulation de la réponse immune. Le développement de la technique de cytométrie de flux appliquée aux levures, a permis d'examiner les glycannes pariétaux susceptibles d'interagir avec la cellule hôte au moment du contact avec les macrophages. Les expériences de stimulation ont montré l'activité stimulatrice des levures vis-à-vis de cellules macrophagiques. Les résultats ont indiqué que, dépendant des récepteurs macrophagiques et des glycannes exprimés, différentes réponses cellulaires sont observées. Ainsi, S. cerevisiae, levure non pathogène, induit une réponse de type pro-inflammatoire. Des réponses cytokiniques opposées sont observées avec C. albicans. Cette balance entre réponse pro- et anti-inflammatoire dépend de la charge de levure intéragissant avec les cellules macrophagiques. Les études portant sur la modulation de l'expression glycannique de surface lors de la phagocytose des levures par les macrophages indiquent que lorsque le ratio levure/macrophage est important, l'expression des β-1,2 oligomannosides est augmentée dans le phagosome, sans exposition des β-glucanes, conduisant à une réponse cellulaire de type anti-inflammatoire. Au contraire, quand la charge en levure est limitée, les β-glucanes sont exposés, conduisant à une réponse pro-inflammatoire. Ainsi, ces résultats indiquent qu'en fonction des associations moléculaires et des ligands glycaniques, une réponse pro- ou anti-inflammatoire est élaborée. Les interactions entre les différents glycannes de la paroi de C. albicans et les récepteurs spécifiques des cellules macrophagiques sont critiques dans l'orientation de la réponse immune de l'hôte et donc dans la pathogénèse de la levure et l'infection.

Depuis leur radiation après le Carbonifère, il y a 325 millions d'années, les insectes ont colonisé la majorité des milieux terrestres. Ce grand pouvoir colonisateur est en partie dû à leur association avec des bactéries symbiotiques intracellulaires, nommés endosymbiotes. Ces derniers complémentent le régime alimentaire de l'insecte et lui permettent de survivre sur des milieux nutritionnellement pauvres ou déséquilibrés. Les endosymbiotes sont transmis maternellement, ce qui assure la pérennité de l'association au cours des générations. Ils sont maintenus dans des cellules spécialisées, les bactériocytes, qui forment à leur tour un organe, le bactériome. L'étude des spécificités moléculaires et cellulaires des bactériocytes est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes de régulation des endosymbiotes. Toutefois, la caractérisation de ces spécificités reste peu élucidée. Afin d'approcher les spécificités moléculaire, cellulaire et immunitaire du bactériome, ainsi que la réponse immunitaire systémique du charançon dirigée contre un pathogène, nous avons construit et séquencé 7 banques d'ADNc provenant du charançon des céréales : Sitophilus oryzae (Coléoptère, Curculionide). L'analyse in silico des banques, appuyée par une étude transcriptomique, a montré que le bactériome présente une forte expression de gènes impliqués dans la survie et le développement cellulaire, et dans le trafic vésiculaire. Le bactériome présente aussi une réponse immunitaire spécifique et modulée, puisqu'à l'exception d'un peptide antimicrobien, la coléoptéricine-A, les effecteurs de l'immunité ne sont pas (ou peu) exprimés. Par ailleurs, nous avons montré que la réponse immunitaire des larves de charançon aux infections bactériennes serait modulée en présence des endosymbiotes. Le deuxième volet de cette thèse s'est focalisé sur le stade adulte du charançon, chez qui les bactéries symbiotiques sont hébergées dans des bactériomes situés à l'apex des caeca mésentériques qui tapissent l'intestin moyen de l'insecte. Cette association est éphémère chez l'adulte qui perd ses endosymbiotes 15 jours après la mue imaginale. Nous avons recherché les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cette élimination, ainsi que les causes écophysiologiques et évolutives sous-jacentes. Par des approches histologiques et transcriptomiques, nous avons démontré que l'élimination des symbiotes est la conséquence de l'activation simultanée de l'apoptose et de l'autophagie. Par ailleurs, nous avons montré que l'élimination du symbiote survient après la formation ultime de la cuticule par l'insecte adulte, et que cette élimination symbiotique était corrélée à une diminution des besoins nutritionnels de l'insecte, notamment en acides aminés aromatiques.

La pentraxine longue PTX3, récepteur soluble de l'immunité innée, joue un rôle important dans la protection contre certains pathogènes, en favorisant leur élimination et l'initiation de réponses immunitaires protectrices. PTX3 a notamment un rôle protecteur lors d'infections par Aspergillus fumigatus et Pseudomonas aeruginosa. La mucoviscidose, maladie héréditaire grave à transmission autosomique récessive, est caractérisée par des infections pulmonaires récurrentes, notamment par ces deux pathogènes. Nous avons donc émis l'hypothèse que le statut de PTX3 pourrait être altéré chez ces patients. L'expression et l'intégrité de PTX3 ont été analysées dans les expectorations de 51 patients atteints de mucoviscidose et de 7 patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Les résultats montrent que la concentration de PTX3 est augmentée dans les sérums de patients atteints de mucoviscidose. Au contraire, la concentration de PTX3 dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose est considérablement plus faible que celle des patients atteints de BPCO. Cette faible concentration de PTX3 résulte d'un clivage protéolytique par l'élastase du neutrophile et par les protéases sécrétées par Aspergillus fumigatus. De manière intéressante, le domaine N-terminal de PTX3, impliqué dans la protection contre Aspergillus fumigatus, est préférentiellement dégradé par ces protéases. Cette dégradation est spécifique de la pentraxine longue PTX3 car les pentraxines courtes, CRP et SAP, ne sont pas dégradées. Ces résultats indiquent que la protéolyse sélective de PTX3 au niveau des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose peut expliquer, en partie, les infections pulmonaires récurrentes par certains pathogènes.

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), espèce d'élevage majeure en Europe et notamment en France, est l'une des espèces de poisson les mieux connues dans un grand nombre de domaines, y compris l'immunologie. Les virus qui l'infectent ont aussi été bien caractérisés, en particulier deux Novirhabdovirus, le virus de la septicémie hémorragique virale (VSHV) et le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (VNHI), tous deux connus pour provoquer des pertes importantes dans les élevages aquacoles. Quelques travaux, conduits notamment à l'INRA, ont mis en évidence l'existence d'une variabilité génétique de la résistance à ces infections chez la truite (Quillet et al., 2007). Une approche combinant analyse génétique et étude des réponses cellulaires a été développée pour tenter de mieux caractériser la réponse de la truite contre le VSHV. L'objectif est de développer des outils d'amélioration de la santé dans les élevages piscicoles et de mieux comprendre les mécanismes de résistance antivirale chez les vertébrés. Tout d'abord, une démarche de cartographie de QTL (quantitative trait locus) a permis de détecter un QTL majeur de résistance au VSHV dans la région télomérique du groupe de liaison 31 de la truite arc-en-ciel. Ce QTL contrôle la survie des poissons et la croissance in vitro du virus sur explants de nageoire (VREFT), ce qui suggère fortement l'implication de mécanismes innés dans la résistance. Le QTL est retrouvé dans des croisements impliquant des reproducteurs de résistance variée, et peut expliquer jusqu'à 65% (survie) et 49% (VREFT) de la variance phénotypique observée. Enfin, l'effet du QTL est conservé quel que soit le mode d'infection employé (balnéation ou injection intrapéritonéale), suggérant que la résistance n'est pas liée à des particularités des tissus superficiels (peau, mucus), premiers sites de contact entre le virus et son hôte. En parallèle, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir d'ovaires de truites appartenant à des lignées isogéniques présentant des niveaux de résistance variable à l'infection par le VSHV. Une corrélation remarquable est observée entre la résistance à l'infection des lignées cellulaires et la survie des poissons dont elles sont issues, confirmant définitivement le rôle déterminant de mécanismes innés dans la résistance. Ce modèle cellulaire a également permis de montrer que le contrôle précoce de la prolifération virale était une étape clé de la résistance. Le parallélisme entre résistance in vitro et in vivo semble conservé lors de l'infection par un second rhabdovirus, le VNHI, bien qu'aucune corrélation dans la résistance à ces deux infections n'ait été observée dans cette étude. Par ailleurs, le QTL à effet fort identifié pour la résistance au VSHV ne joue pas un rôle majeur dans la variabilité de résistance au VNHI. Ceci suggère que, même si ils concourent à l'activation de voies de signalisation communes, les facteurs clés de la résistance aux deux virus sont différents, et leur expression contrôlée par des zones génomiques distinctes. Les résultats obtenus dans cette étude ont permis de démontrer sans équivoque le rôle clé des mécanismes innés dans la résistance de la truite à l'un de ses principaux virus, et l'existence d'une forte variabilité génétique sous-tendant l'expression des facteurs impliqués. En proposant des bases nouvelles pour aborder l'analyse des interactions hôte-virus chez la truite, ils ouvrent la voie à la découverte de mécanismes potentiellement nouveaux dans la réponse des poissons à ces infections et à une meilleure compréhension de ces mécanismes chez les vertébrés.

Le lipopolysaccharide (LPS), un composant de la membrane des bactéries à Gram-négatif, active l’inflammasome non-canonique constitué chez l’homme des caspase-4/5 et chez la souris de la caspase-11 ainsi que de la protéine effectrice GasderminD. Chez l’homme nous ne savons toujours pas si il y a d’autres acteurs impliqués dans cette voie de signalisation. Notre équipe a précédemment démontré que le LPS sous-acylé de Francisella novicida active la caspase-4 humaine mais pas la caspase-11 murine. Cette différence inexpliquée nous a fait émettre l’hypothèse qu’un cofacteur pourrait faciliter la détection du LPS de F. novicida dans les cellules humaines. Afin de tester notre hypothèse, et de manière générale d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans cette voie de signalisation, nous avons réalisé un crible CRISPR/Cas9 pan-génomique sur la base de la survie de monocytes humains de la lignée U937 après transfection de LPS. Notre crible a identifié IRF2 comme étant l’unique protéine impliquée en plus de GasderminD et caspase-4. Les monocytes IRF2-/- étaient complètement résistants à la transfection de LPS et affichaient un niveau de caspase-4 très diminué. Nos résultats démontrent qu’IRF2 est le principal régulateur de l’expression de caspase-4 à l’état basal. De manière intéressante, après un traitement par l’interféron ou une différentiation en macrophages IRF2 n’est plus requis pour la pyroptose. A la place IRF1 et IRF2 coopèrent pour réguler le niveau de caspase-4 et donc la sensibilité au LPS dans le cytosol. Nos travaux ont permis d’identifier les mécanismes de régulation de caspase-4 à l’état basal, en présence d’interféron, et dans des macrophages différenciés. Nous avons montré que IRF1/IRF2 sont des régulateurs clés de la détection du LPS cytosolique et donc du choc septique TLR-4 indépendant / Lipopolysaccharide (LPS), a component of Gram-negative bacteria membrane activates the non-canonical inflammasome involving human caspase-4/5 or its murine ortholog caspase-11 and the cell death effector GasderminD. It is still unclear whether other players act in this cascade especially in human cells. Our lab previously demonstrated that the under-acylated LPS from Francisella novicida activates human caspase-4 but not caspase-11. This difference remains unexplained and led us to hypothesize that a co-factor could assist caspase-4 in the sensing of F. novicida LPS in human cells. To test this hypothesis, and in a more general manner identify new proteins involved in this pathway, we performed a genome wide CRISPR/Cas9 screen based on the survival of human U937 monocytes after LPS delivery into the cytosol. Our screen identified interferon regulatory factor 2 (IRF2) as the only protein beside caspase-4 and GasderminD involved in cell death following under-acylated or E. coli LPS transfection. IRF2-/- monocytes were fully resistant to LPS transfection-mediated death and displayed a large reduction in caspase-4 levels. Our results demonstrate that IRF2 is the master transcriptional regulator of caspase-4 at steady state. Interestingly, upon IFN treatment or macrophage differentiation, IRF2 is no longer fully required for pyroptosis. Instead, IRF1 and IRF2 cooperate to regulate caspase-4 level and LPS susceptibility. Our work identified the caspase-4 regulatory network at steady state and during IFN exposure or macrophage differentiation and IRF1/2 as key regulators of the cytosolic detection of LPS, which plays a role in TLR4-independent endotoxic shock

Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte chroniquement près de 240 millions d'individus dans le monde. L'infection chronique par HBV est un souci de santé publique majeur puisque l'infection peut évoluer au cours du temps vers la cirrhose et/ou l'hépatocarcinome (CHC). Malgré l'existence de traitements efficaces à base d'analogues de nucléos(t)ides permettant de diminuer la charge virale chez les patients, ceux-ci nécessitent une prise médicamenteuse à vie. En effet, malgré la diminution importante du risque de développer un cancer du foie, ces traitements ne permettent pas l'élimination définitive du virus. Les cellules infectées par HBV sont les hépatocytes du foie, qui remplissent la majorité des rôles vitaux de cet organe. La formation d'un minichromosome viral au sein de ces cellules infectées appelés ADNccc (pour ADN circulaire-covalemment-clos), est majoritairement responsable de la persistance du HBV. Les traitements actuels utilisés sont principalement des analogues de nucléos(t)ides et ceux-ci n'ont pas ou peu d'effets sur l'ADNccc. La nécessité de développer de nouvelles stratégies antivirales visant à éliminer définitivement HBV a donc conduit de nombreux laboratoires, dont le nôtre, à étudier l'utilisation de stratégies immuno-thérapeutiques incluant des stimulateurs de l'immunité innée (agonistes de TLR7, TLR8, RIG-1.) dans le cadre d'infections chroniques. De nombreuses études ont démontré que l'utilisation de ligands stimulant les récepteurs de l'immunité innée promouvait un fort effet antiviral, médié par la production endogène et locale de cytokines pro-inflammatoires et l'induction de gènes régulés par l'interféron (1SG). Dans ce but, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux potentiels effets antiviraux de l'agonisation des senseurs de l'immunité innée les plus connus, les Toll-like récepteurs (TLR), dans le cadre de l'infection par HBV dans les cellules hépatiques. La stratégie immuno-thérapeutique envisagée, vise à stimuler aussi bien les cellules immunitaires que les hépatocytes infectés. La caractérisation de l'expression de différents senseurs de l'immunité innée, d'une part dans les cellules primaires isolées du foie et d'autre part dans certaines lignées cellulaires correspondantes, nous a permis d'avoir une vue d'ensemble 1) des récepteurs exprimés par les différentes cellules du foie notamment dans les hépatocytes (TLR2/TLR3/TLR4/TLR5) ; 2) d'évaluer la fonctionnalité de ceux-ci pour la production de cytokines (IL-6 ; IP-10) lors de leur agonisation 3) d'évaluer les modèles disponibles parmi les lignées cellulaires les plus proches immunologiquement des cellules hépatiques. Les cellules HepaRG et une nouvelle lignée dérivée des macrophages du foie les iKC par exemple sont plus proches respectivement des hépatocytes et des macrophages primaires hépatiques et sont donc des modèles relevant pour les études immuno-thérapeutiques. L'utilisation de ligands de TLR2 et TLR3 sur des hépatocytes infectés chroniquement par HBV, a montré le plus fort effet antiviral (incluant une médiation par la sécrétion de cytokines et l'induction d'1SG) aussi bien sur la réplication d'HBV que sur l'ADNccc. De plus, cet effet semble stable au cours du temps sans résurgence massive de productions virales. Cette stratégie cible non seulement les hépatocytes infectés, mais également les cellules immunitaires dont les productions cytokiniques ont également un fort effet antiviral. Bien que l'effet in vivo, dans un modèle murin, ait été plus modeste, un ajustement des doses d'agonistes utilisées ainsi qu'un meilleur moyen de délivrance au foie de ligands de TLR2 ou TLR3 pourraient être une stratégie immuno-thérapeutique intéressante. Enfin nous nous sommes intéressés au cas particulier de l'agonisation du TLR9 en présence d'HBV… [etc] / HBV chronically infects 240 million peoples around the world. HBV chronic infection is a major public health problem and can lead to cirrhosis or/and hepatocarcinoma (HCC). Even if some efficient treatments are already available, based in particular on the use of nucleos(t)ides analogues that induce a decrease of viral load in patients, these drugs do not lead to a definitive HBV cure They enable an important decrease of liver cancer risk but need to be taken life-long. HBV infects hepatocytes the major liver cells which are involve in many vital mechanisms into the organism. The HBV minichromosome, which is formed into infected cells also called cccDNA (i.e., covalently-closed-circular DNA), is not affected by nucleos(t)ides treatments and thus is responsible for HBV persistence. The use of immune receptors (e.g. Toll-like receptors/TLR) agonists can lead to 1) an important cytokines/interferon (IFN) secretion; 2) promote immune cells activation/recruitment and 3) induction of many Interferon-Stimulated Genes (ISG). These mechanisms could lead to a greater viral clearance by cccDNA degradation or silencing. The need for new strategies to permanently eliminate HBV infection led many laboratories, including ours, to explore the use of immunotherapeutic treatments in a context of chronic infection, including innate immune stimulators (e.g. TLR7, TLR8 or RIG-I agonist are under clinical trials). To this end, we got interested on the potential anti-HBV effects of many TLR agonists in liver cells. Our strategy is to stimulate both infected hepatocytes and immune cells. We first characterized the expression of innate immune sensors in primary liver cells as well as in some liver cell lines. This allowed us to: 1) identify which sensors are expressed by liver cells, especially in hepatocytes (TLR2, TLR3, TLR4, TLR5); 2) evaluate their ability to produce cytokines (IL-6, IP-10) upon agonisation; 3) evaluation of cell lines model which are immunologically closed to the primary liver cells. HepaRG and a new liver macrophage cell line call iKC are immunologically close to their primary cells and appear to be relevant models for immune-therapeutics studies. The use of TLR2 and TLR3 agonists on HBV chronically infected hepatocytes showed a strong antiviral effect (i.e., decrease of HBV replication and cccDNA level) mediated directly by NF- kB-inducible and ISG genes activation and indirectly by cytokines secretion. Furthermore, this effect was shown stable over time without any viral replication rebound. This strategy targets not only infected hepatocytes but also immune cells, whose cytokines production also has a strong antiviral effect. Despite a weak in vivo effect in mice, a tuning in agonist doses used and better liver delivery could be an interesting immune-therapeutic strategy. Finally, we were investigated the particular case of TLR9 agonisation in presence of HBV. We showed an interaction between synthetic or not DNA ligands such as CpG ODN and HBV particles. This interaction leads in one hand, to HBV entry inhibition in hepatocytes, on the other hand, to a blockage of ligand delivery to TLR9 in pDC, which is not due to an inhibition of the TLR9 pathway, but to a lack of access of the ligand to its receptor. These two mechanisms are responsible for a decrease of viral infection during its establishment and a decrease in IFN synthesis by pDC, respectively. A decrease in IFN production, which this time was linked to a bona fide inhibition of the TLR9 pathway, in the presence of the sub-viral particles HBsAg was still observed, without retention of TLR9 ligand of the latter. It would seem, therefore, that use of TLR agonists represent an interesting strategy in setting up new anti-HBV immune-therapeutic approaches. However, their improvement will depend on the evaluation of viro-induced inhibitory mechanisms as well as better ways of in vivo delivering these ligands

Pseudomonas aeruginosa est responsable d'infections persistantes chez les patients atteints de mucoviscidose, suggérant une capacité à mettre en échec les défenses immunitaires innées. Par ailleurs, nous savons que les cellules de l'hôte produisent de la kynurénine, exerçant un contrôle sur l'homéostasie du système immunitaire. Or, la bactérie elle-même produit de la kynurénine. Des résultats préliminaires de notre équipe ont montré que lors d'une infection pulmonaire aiguë chez la souris par une souche de P. aeruginosa ne produisant pas de kynurénine, il y a une perte de virulence (diminution de la mortalité des souris et de la charge bactérienne pulmonaire). Le but de notre travail est donc d'examiner le rôle du métabolisme de la kynurénine durant l'interaction entre P. aeruginosa et les cellules de système immunitaire, en particulier les neutrophiles et les macrophages. Nous avons montré que la plupart des souches de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose produisent un niveau élevé de kynurénine. De plus, une forte activation transcriptionnelle de kynA (le premier gène de la voie des kynurénines de P. aeruginosa) a été observée lors du contact avec les cellules de l'immunité, en particulier les neutrophiles et les macrophages. Durant la coculture des neutrophiles humains avec différentes souches mutantes de P. aeruginosa, produisant des niveaux variables de kynurénine, nous avons démontré que la kynurénine favorise la survie des bactéries. De plus la production de formes réactives de l'oxygène (FRO) par la NADPH oxydase des neutrophiles activés (évaluée par chimiluminescence en présence de luminol ou d'isoluminol ou par test de réduction du cytochrome c sensible à la superoxyde dismutase) est inhibée par des doses croissantes de kynurénine synthétique. Cette inhibition n'est due ni à un défaut de phagocytose ni à une inhibition directe de la NADPH oxydase. En utilisant des systèmes de production in vitro de FRO, nous avons montré que la kynurénine est un « scavenger » du peroxyde d'hydrogène et, dans une moindre mesure, des anions superoxydes. Ce « scavenging » a lieu principalement en intracellulaire lors de la stimulation par les bactéries, probablement dans le phagosome. Nous avons également confirmé que les neutrophiles n'expriment pas le récepteur de la kynurénine, le récepteur d'aryl-hydrocarbone (AhR). A l'inverse, les macrophages expriment ce récepteur et son expression est induite par la kynurénine 48h après activation par P. aeruginosa ou par du LPS (lipopolysaccharide). La kynurénine a également un impact sur la polarisation des macrophages, étudiée par cytométrie en flux, en stabilisant le phénotype immunosuppresseur M2c. Enfin, la première enzyme de la voie des kynurénines de P. aeruginosa a été produite, purifiée et caractérisée. Nous avons démontré que KynA est une enzyme allostérique, avec un K' pour le L-tryptophane de 10,8 mM, une Vm de 2862 nM/min, et un Kcat de 4,09 M de N-formylkynurénine/min/M d'enzyme, indiquant une possible régulation au niveau enzymatique de la voie des kynurénines. Par ailleurs, l'analogue du substrat (le L-1-methyl-tryptophane) inhibe légèrement l'enzyme pure, mais n'a pas d'effet sur une culture bactérienne. Pour conclure, nous avons montré au cours de ce projet que la voie des kynurénines de P. aeruginosa est un des mécanismes qui permet à cette bactérie d'échapper au système immunitaire inné. La voie des kynurénines de P. aeruginosa pourrait donc être une nouvelle cible thérapeutique. L'enzyme recombinante KynA purifiée est un nouvel outil qui pourrait permettre de cribler des inhibiteurs spécifiques. / Pseudomonas aeruginosa is responsible for persistent infections in cystic fibrosis patients, suggesting an ability to circumvent innate immune defenses. Many host cells produce kynurenine, which is known to control immune system homeostasis. Interestingly this bacterium uses the kynurenine pathway to catabolize tryptophan. In addition, preliminary results of our laboratory showed that during acute pulmonary infection in mice with a strain of P. aeruginosa which does not produce kynurenine, there is a loss of virulence (reduction of mice mortality and pulmonary bacterial burden). The aim of this study is to investigate the role of kynurenine metabolism in the interaction between P. aeruginosa and immune system cells, in particular neutrophils and macrophages. We showed that most strains of P. aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients produce a high level of kynurenine. Moreover, a strong transcriptional activation of kynA (the first gene involved in the kynurenine pathway in P. aeruginosa) was observed upon contact with immune cells and particularly with neutrophils and macrophages. In addition, using coculture of human neutrophils with various mutant strains of P. aeruginosa producing variable levels of kynurenine, we demonstrated that kynurenine promotes bacterial survival. Increasing amounts of synthetic kynurenine inhibits reactive oxygen species (ROS) production by the NADPH oxidase of activated neutrophils, as evaluated by chemiluminescence with luminol or isoluminol or superoxide dismutase-sensitive cytochrome c reduction assay. This inhibition is due neither to a phagocytosis defect nor to direct NADPH oxidase inhibition. Using in vitro ROS-producing systems, we showed that kynurenine scavenges hydrogen peroxide and, to a lesser extent, superoxide anions. Kynurenine's scavenging effect occurs mainly intracellularly after bacterial stimulation, probably in the phagosome. We also confirmed that neutrophils do not express the kynurenine receptor, the arylhydrocarbon receptor (AhR). Conversely, macrophages express this receptor and the kynurenine induces its expression after 48h of activation by P. aeruginosa or LPS (lipopolysaccharide). After activation, kynurenine impacts also macrophage polarization, analysed by flow cytomerty, by stabilizing immunosuppressive phenotype M2c. Finally, the first enzyme of the kynurenine pathway of P. aeruginosa was produced, purified and characterized. We demonstrated that KynA is an allosteric enzyme, with a K' of 10,8 mM of L-tryptophan, a Vm of 2862 nM/min and a Kcat of de 4,09 M of N-formylkynurenine/min/M of enzyme, indicating a possible regulation at the enzymatic level of the kynurenine pathway. Furthermore, the substrate analogue (L-1-methyl-tryptophan) inhibits slightly the pure enzyme, but has no effect on bacterial culture. In conclusion, the kynurenine pathway allows P. aeruginosa to circumvent the innate immune response. The kynurenine pathway of P. aeruginosa could be a new therapeutic target. Purified recombinant enzyme KynA is a new tool that could help to screen specific inhibitors.

La méthylation et déméthylation de l'ADN jouent un rôle majeur dans la stabilité des génomes, l'empreinte génomique, la paramutation et le développement. En revanche, le rôle de cette régulation épigénétique a été peu étudiée dans les interactions hôtes-pathogènes. Dans ce projet de thèse, nous avons tout d'abord montré que la méthylation de l'ADN régule négativement la résistance d'Arabidopsis thaliana à une souche de Pseudomonas syringae pathogène. Nous avons également identifié un grand nombre de gènes de l'immunité ciblés directement par la méthylation de l'ADN dirigée par petits ARN dans leurs régions promotrices. Nous proposons que cette régulation génique permettrait de maintenir une faible expression basale de ces gènes et d'éviter ainsi des effets délétères qui seraient causés par une expression constitutive de la réponse immunitaire. De plus, nous montrons que la déméthylase active REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) facilite l'activation transcriptionnelle de gènes de l'immunité en laissant potentiellement des éléments de régulation en cis accessibles à des facteurs de transcription. Nous avons également démontré que ce facteur contribue à la résistance à P. syringae chez Arabidopsis, caractérisant ainsi la première déméthylase eucaryote dans la résistance antibactérienne. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la méthylation de l'ADN maintient une faible expression basale de gènes de l'immunité en absence de pathogène, tandis que la déméthylation active assure une induction rapide de ces gènes au cours de la réponse immunitaire en favorisant potentiellement le recrutement de facteurs de transcription sur la chromatine. / DNA methylation and demethylation are regulatory processes involved in genome stability, genomic imprinting, paramutation and development. Until recently, very little was known about the role of these epigenetic processes in plant disease resistance and in the transcriptional control of immune-responsive genes. Here we provide evidence that DNA methylation negatively regulates antibacterial resistance against a virulent Pseudomonas syringae strain in Arabidopsis. Accordingly, we have identified a subset of defense genes that are targeted and repressed by RNA-directed DNA methylation (RdDM), presumably to prevent trade-off effects that would be caused by their constitutive expression and/or sustained induction. In addition, we found that the active DNA demethylase facilitates the transcriptional activation of some of these defense genes by pruning DNA methylation at their promoter regions and leaving cis-elements accessible for transcription factor binding. In addition, we show that the active demethylase REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) positively regulates late immune responses including Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP)-triggered callose deposition and salicylic acid (SA)-dependent defense response. We also demonstrate that ROS1 restricts Pto DC3000 propagation in Arabidopsis leaf secondary veins, providing the first example for a role of an active DNA demethylase in antibacterial resistance. Based on these findings we propose that DNA methylation maintains a low basal expression of some immune-responsive genes in normal growth condition, while active DNA demethylation ensures a rapid and pervasive induction of these genes upon bacterial pathogen detection.