Dans les tauopathies, telle la maladie d'Alzheimer, la protéine tau devient anormalement hyperphosphorylée ce qui conduit à son accumulation et à son agrégation intracellulaire. Ce processus aboutit progressivement à une perte neuronale et un déclin cognitif. L'immunothérapie anti-tau est de plus en plus considérée comme un traitement potentiel en vue de bloquer la progression des tauopathies.Récemment, l’entreprise UCB BioPharma a montré que l’anticorps D, anticorps ciblant la protéine tau en un épitope central (aa 235 à 250), était en mesure de bloquer, in vitro, l'agrégation intracellulaire de protéines tau, induite par des PHFs purifiés au départ de cerveaux Alzheimer. L’anticorps A, de même isotype, associé à des propriétés de liaison comparables mais reconnaissant la protéine tau en son extrémité N-terminale (aa 15 à 24), n’est pas en mesure de prévenir l’agrégation dans ce même modèle, ce qui souligne l’importance du choix de l’épitope en vue de neutraliser les amorces pathologiques issues de cerveaux Alzheimer.En vue d’étudier les propriétés de l’anticorps D in vivo, nous avons développé deux modèles murins de tauopathies. Premièrement, un modèle étudiant les phénomènes de recrutement et nucléation, basé sur l'injection unilatérale d’un homogénat de cerveau Alzheimer dans l'hippocampe de jeunes souris transgéniques (Tg30tau). Deuxièmement, un modèle permettant l’étude de la propagation intercellulaire de formes pathologiques de tau, par injection unilatérale de fibrilles P301L-K18 dans l’hippocampe de souris transgéniques (hTauP301L). Les tauopathies induites par ces injections intracérébrales ont été quantifiées dans l'hippocampe ipsi et controlatéral, en présence de traitements immunothérapeutiques utilisant les anticorps anti-tau A et D ou un anticorps témoin négatif de même isotype. La quantification des formes hyperphosphorylées et agrégées de tau a été réalisée par des approches immunohistochimique ou biochimique.Dans le modèle de nucléation, l’anticorps D est en mesure de prévenir significativement l’apparition des formes hyperphosphorylées et agrégées de tau à la fois dans l’hippocampe ipsilatéral (injecté avec l’homogénat Alzheimer) et contralatéral. A l’opposé, l’anticorps A n’est pas en mesure de prévenir l’apparition de la tauopathie dans ce modèle. Dans le modèle de propagation, basé sur l'injection unilatérale hippocampique de fibrilles P301L-K18, le traitement immunothérapeutique utilisant l’anticorps D réduit significativement la propagation d’espèces pathologiques de la protéine tau dans l'hippocampe controlatéral.De par l’utilisation de ces deux modèles murins de tauopathies, nous avons pu confirmer in vivo, la capacité de l’anticorps D à neutraliser les espèces pathologiques contenues dans un homogénat de cerveau Alzheimer et avons démontré sa capacité à s’opposer à la propagation intercellulaire de la tauopathie in vivo. Dans le modèle de nucléation, l’anticorps A n’a pas été en mesure de s’opposer à l’apparition de la tauopathie. Les résultats obtenus confirment ceux décrits par l’entreprise UCB BioPharma dans leur modèle d’agrégation in vitro et confirme l’importance considérable du choix de l’épitope en vue de prévenir efficacement le développement de tauopathies in vivo. / In tauopathies, such as Alzheimer's disease, tau protein becomes abnormally hyperphosphorylated which leads to its accumulation and intracellular aggregation. This process gradually leads to neuronal loss and cognitive decline. Anti-tau immunotherapy is increasingly considered as a potential treatment to block tauopathies’s progression.UCB BioPharma recently showed that antibody D, targeting an epitope in the central region of tau (aa 235-250), is able to block, in vitro, the intracellular seeding of tau proteins induced by PHFs purified from the brain of Alzheimer's patients. The antibody A, same isotype and associated with similar binding properties but recognizing the N-terminal region of tau (aa 15 to 24) is not able to prevent tau seeding in this cell based assay. This observation underlines the importance of the targeted epitope on tau protein in order to neutralize pathological species contained in Alzheimer's brains (Courade et al., 2018).In order to study the properties of antibody D in vivo, we developed two murine models of tauopathies. First, a seeding model based on a unilateral injection of Alzheimer's brain homogenate into the hippocampus of young Tg30tau mice. Secondly, a spreading model to study the propagation of pathological tau seeds, based on unilateral hippocampal injection of P301L-K18 fibrils in hTauP301L transgenic mice. Tauopathies induced in these models were quantified in the ipsi and contralateral hippocampus in the presence of immunotherapeutic treatments with anti-tau antibodies (D, A) or a negative control antibody. Quantification of hyperphosphorylated and aggregated tau was performed by immunohistochemical or biochemical analyses.In the seeding model, antibody D significantly reduces the appearance of hyperphosphorylated and aggregated tau both in the ipsi and contralateral CA1 regions of hippocampus. In contrast, antibody A is not able to prevent the appearance of pathological tau in this model. In the spreading model, immunotherapeutic treatments with antibody D significantly reduces the spread of pathological tau seeds in the contralateral hippocampus.From these two murine models of tauopathies, we confirmed in vivo the ability of antibody D to neutralize the pathological tau species contained in an Alzheimer's brains homogenate and demonstrated its capacity to reduce the intercellular propagation of tauopathies. In the seeding model, antibody A wasn’t able to affect the onset of tauopathy. These results confirm those described by UCB BioPharma based on their in vitro aggregation assay and confirm the importance of the targeted epitope in order to effectively prevent the development of tauopathies in vivo.

La découverte d'antigènes tumoraux capables d'induire des réponses immunes a relancé le développement de l'immunothérapie du cancer. Parmi ceux-ci, les antigènes testiculaires du cancer (Cancer-Testis Antigens (CTA)) sont actuellement des cibles de choix pour la vaccination thérapeutique. Des données récentes obtenues au Laboratoire d'Uro-Oncologie Expérimentale ont montré que l'antigène MAGE-A9 est le CTA le plus fréquemment exprimé dans les tumeurs vésicales puisqu'on détecte son expression dans 60% des tumeurs. Comme cet antigène a jusqu'à maintenant été très peu étudié, le but de ce projet consistait premièrement à évaluer son expression dans divers types de cancers en comparaison avec celle d'autres CTAs plus connus tels que MAGE-A4 et NY-ESO-1. La deuxième partie de ce projet consistait à produire un anticorps contre MAGE-A3, un CTA potentiellement intéressant pour l'immunothérapie de plusieurs cancers, dont celui de la vessie. Comme cet antigène fait partie d'une famille de CTA présentant un haut degré d'homologie, nous avons opté pour une stratégie d'immunisation centrée sur des epitopes divergents. Les résultats ayant mené à la production et à la caractérisation de 3 anticorps monoclonaux seront présentés.

Le système immunitaire est capable de rejeter une tumeur, même si l'interaction entre système immun et tumeurs est et reste complexe. Contrôler à long terme la croissance de la tumeur est un challenge, probablement suite à divers mécanismes de tolérance centrale et périphérique. Différentes approches d'immunothérapie du cancer ont été et sont toujours développées. Nous avons, au laboratoire, investigué et démontré, dans le cadre de deux différents modèles tumoraux murins, les capacités thérapeutiques d’une nouvelle stratégie de vaccinations combinées associant des injections de cellules dendritiques (DC) et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF.<p><p>Notre travail de thèse a consisté à poursuivre l'étude de cette stratégie de vaccins combinés en étudiant plus particulièrement le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans l'efficacité thérapeutique des vaccinations. <p>Les Treg regroupent différentes populations cellulaires immunosuppressives dérivées du thymus qui jouent un rôle clé dans le maintien de la tolérance périphérique. Les Treg naturels dont le mécanisme de suppression principal nécessite un contact cellule-cellule, expriment de façon constitutive les molécules de surface CD4, CD25 et CTLA-4 mais le marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3 qui est indispensable à leur développement et à leur fonction suppressive. Dans un premier temps, nous avons donc caractérisé les Treg de rat pour l'expression de Foxp3 et la nature et spécificité antigénique de leur fonction suppressive. Nos résultats démontrent d’une part, une expression de Foxp3 restreinte aux LT CD25+ natifs et liée à une fonction suppressive s'exerçant par contact cellule-cellule et d’autre part, une spécificité antigénique non-restreinte de ces Treg. <p><p>Ensuite, nous avons utilisé ce modèle de vaccination associant des injections de DC et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF pour analyser comparativement les réponses immunes induites chez les rats vaccinés guéris ou non-guéris et les rats contrôles non vaccinés et identifier les paramètres cruciaux conduisant à l'éradication de la tumeur. Nos résultats ont montré que la principale différence entre rats vaccinés guéris et non guéris ne réside pas dans l'induction de réponses cytotoxiques systémiques spécifiques de la tumeur. Par contre, la guérison est associée à la persistance d'une réponse systémique LT CD4+ TH1 ainsi qu'au recrutement important en intratumoral de LT CD8+ cytotoxiques lié à une faible proportion relative de Treg. <p><p>Comme dans la majorité des études publiées chez l'animal, les DC utilisées dans ces vaccins combinés ont été générées à partir de rats naïfs, par différenciation de précurseurs de la moëlle osseuse en présence de GM-CSF seul. Par analogie avec les vaccins DC administrés aux patients cancéreux, nous avons aussi dérivé des DC à partir de la moëlle osseuse de rats porteurs d’une tumeur (TUM+) et nous avons constaté que ces mêmes vaccins combinés montraient in vivo une efficacité thérapeutique nettement moins bonne que leurs équivalents naïfs. Nous avons établi que cette différence d’efficacité était liée à la présence de Treg fonctionnels dans les vaccins DC dérivés de rats TUM+. Puis, nous avons établi le lien entre la présence de Treg dans les vaccins DC TUM+ et leur moins bonne efficacité thérapeutique en montrant qu'un traitement in vivo des rats TUM+ au témozolomide (TMZ) avant de générer les vaccins DC résultait in vitro, en une moindre expression de Foxp3 et une fonction suppressive diminuée et in vivo, en une bien meilleure survie des rats vaccinés.<p><p>Enfin, dans le but d’une utilisation future en clinique, nous avons développé une approche simplifiée ‘tout in vivo’ de notre modèle de vaccinations combinées, en utilisant la tumeur localement irradiée in vivo comme source d’antigène pour des DC autologues injectées en péri-tumoral et un apport exogène de GM-CSF. Nous avons utilisé des adénovirus associés recombinants porteurs du gène du GM-CSF (AAV1-GM-CSF) pour transduire la tumeur in vivo. Ces injections intratumorales d’AAV1-GM-CSF ont montré de bons résultats en vaccinations combinées puisque 60% des rats ont pu être guéris d’une tumeur 9L pré-implantée. Nous avons ensuite expérimenté l’enrobage des AAV1-GM-CSF dans un polymère biocompatible et thermosensible, le poloxamère, avant de les injecter en intratumoral, sans observer de meilleur effet thérapeutique. Cependant, nous avons constaté que l'utilisation du poloxamère pour enrober du GM-CSF recombinant permettait d'améliorer nettement la survie des rats vaccinés par comparaison à l'utilisation de GM-CSF recombinant seul.<p><p>La stratégie de vaccinations combinées que nous avons largement explorée et validée chez le rat serait une alternative intéressante à développer en clinique, particulièrement en combinaison avec un traitement permettant d'éliminer les Treg à la fois dans les vaccins et chez les patients vaccinés.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans la prise en charge des patients atteints de cancer. L’utilisation thérapeutique récente des anticorps anti-"checkpoints", qui renforcent la réponse immunitaire cellulaire naturelle anti-tumorale, a relancé l’intérêt d’approches d’immunothérapie cellulaire spécifique dans les cancers. Malgré tout, l’identification d'antigènes capables de stimuler efficacement des lymphocytes T (LT) anti-tumoraux représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour identifier de tels antigènes, des cellules présentatrices d’antigène (CPA) artificielles (CPAA), capables d’exprimer, après transduction gamma-rétrovirale, des peptides directement codés ou des antigènes entiers, dégradés par ces cellules, comme le feraient des CPA humaines, en peptides présentés au sein de la molécule du CMH de classe I la plus fréquente chez l'homme, HLA-A2.1, ont été développées au laboratoire. Ces CPAA sont capables de stimuler efficacement des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques contre des antigènes tumoraux. Deux grandes approches d’identification des antigènes tumoraux d’intérêt thérapeutique, ont été utilisées. La première est une approche directe d’identification des peptides basée sur l’élution des peptides HLA-A2.1-restreints présentés par nos CPAA et leur analyse par spectrométrie de masse. La seconde est une approche d’immunologie inverse basée sur des prédictions in silico d’épitopes HLA-A2.1-restreints reposant sur des données biochimiques des poches du CMH. Dans les deux approches, des tests fonctionnels d’activation de LTC spécifiques ont été effectués avec nos CPAA. Dans la première étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie en phase liquide, qui a été jusqu'à présent la technologie permettant l'identification rapide de centaines de ligands du CMH dans différentes approches expérimentales. En partant de CPAA codant les peptides immunogènes connus M1m, M1 ou FSP02, des LTC spécifiques de ces peptides ont été obtenus, et nous avons réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. En partant de CPAA codant les protéines entières desquelles ces peptides sont dérivés, des LTC spécifiques des peptides ont également été obtenus mais nous n’avons pas réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. Des peptides très immunogènes, capables de stimuler de fortes réponses immunitaires cellulaires anti-tumorales, peuvent donc échapper à une détection par spectrométrie de masse, rendant ainsi discutable l'utilisation de cette technique pour sélectionner des peptides d’intérêt clinique. Dans la deuxième étude, nous sommes partis de peptides prédits. Nous avons pu monter des réponses immunitaires spécifiques contre les néoépitopes FSP25 et FSP26 prédits in silico, dérivés de la protéine mutée CASP5 (-1) retrouvée chez 60% de patients atteints de cancer colorectal (CCR) à instabilité microsatellitaire (IMS). La CASP5 est impliquée dans l’apoptose et nous avons montré que les patients atteints d’un CCR à IMS présentant cette mutation avaient un moins bon pronostic. Nous avons également montré que chez des patients HLA-A2+ atteints d’un CCR à IMS présentant la mutation, des LTC pouvaient être obtenus contre les épitopes FSP25 et FSP26, capables de lyser spécifiquement la lignée cellulaire HLA-A2.1+ HCT116 dérivée d’un CCR à IMS présentant également la mutation, faisant de la protéine mutée CASP5 (-1) une cible thérapeutique de choix chez ces patients. Dans ces deux études, nos CPAA constituaient un outil de choix pour le développement d’approches d’immunothérapie spécifique personnalisée, soit cellulaire adoptive, pour déterminer quels antigènes devraient être ciblés ou pour directement activer et amplifier in vitro des LT injectés in vivo, soit vaccinale, pour déterminer les antigènes les plus immunogènes à inclure dans un vaccin efficace. / Immunotherapy represents a major advance in cancer patient management. Recent use of anti-checkpoint antibodies, that reinforce the natural cellular anti-tumor immune response, has revived interest for specific cellular immunotherapy approaches in cancers. Nevertheless, the difficulty of identifying highly immunogenic tumor antigens capable of specifically stimulating efficient anti-tumor T lymphocytes (TLs) is a considerable barrier to the development of such approaches. In order to identify such antigens, artificial antigen presenting cells (AAPCs) expressing the most common HLA class I molecule, HLA-A2.1, were developed in the laboratory. After gammaretroviral transduction, these AAPCs also express a directly-encoded peptide of interest or a full-length antigen, degraded by these cells into peptides as human antigen presenting cells (APCs) do. These AAPCs are capable of efficiently stimulating specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against tumor antigens. Two major approaches for the identification of tumor antigens of therapeutic interest have been used. The first one is a direct approach of identification of HLA-A2.1-restricted peptides based on the elution of HLA-A2.1-peptide complexes expressed by our AAPCs and their analysis by mass spectrometry. The second one is a reverse immunology approach based on in silico predictions of HLA-A2.1-restricted epitopes using available MHC pocket biochemical data. In both approaches, functional tests were performed in vitro with our AAPCs to test the immunogenicity of the studied peptides. In the first study, we used tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography, which has been until today the technology of choice for the rapid identification of hundreds of MHC ligands in different experimental approaches. Starting from AAPCs encoding known immunogenic M1m, M1 and FSP02 peptides, specific CTLs could be obtained against these peptides, and we were able to characterize them by mass spectrometry. Starting from AAPCs encoding full length antigens from which these peptides are derived, peptide-specific CTLs were also obtained, but we were unable to characterize them by mass spectrometry. Therefore, highly immunogenic peptides, capable of stimulating strong anti-tumor cellular immune responses, may not be detected by mass spectrometry, rendering questionable the use of this technique for selecting clinically relevant peptides. In the second study, we started from predicted peptides. We were able to mount specific immune responses against FSP25 and FSP26 in silico predicted neoepitopes, derived from the CASP5 (-1) mutated protein found in 60% of microsatellite instability (MSI) colorectal cancer (CCR) patients. CASP5 is involved in programmed cell death and we have shown that MSI CRC patients whose tumors harbored this CASP5 (-1) mutation had less good prognosis. We have also shown that in HLA-A2+ MSI CASP5 (-1)-mutated CRC patients, specific CTLs could be obtained against FSP25 and FSP26 epitopes, capable of specifically lysing HLA-A2+ MSI CRC cell line HCT116 also harboring this mutation. Therefore, the mutated caspase-5 protein might be a therapeutic target of major interest for personalized specific immunotherapy strategies in the context of MSI CASP5 (-1)-mutated CRCs. In both studies, our AAPCs were a tool of choice for the development of personalized specific immunotherapy strategies, either for cellular adoptive approaches, to determine which antigens should be targeted or to directly activate and amplify in vitro antigen of interest-specific TLs which would be transferred in vivo, or for vaccine approaches, to identify the most immunogenic antigens which should be included in an efficacious vaccine

L'immunothérapie utilisant les cellules présentatrices d'Ag (APC) pour induire une réponse lymphocytaire est une stratégie prometteuse dans le traitement des cancers. Cependant plusieurs questions restent en suspens pour améliorer les protocoles cliniques : Quelle APC induit la meilleure réponse ? Comment les Ag doivent-ils être délivrés ? Sous forme de cellules apoptotiques, nécrotiques, ou opsonisées ? <br />Dans cette étude pré-clinique dans le lymphome B, nous avons mis au point des techniques de purification de cellules B, et de préparation des cellules pour les induire en apoptose, en nécrose, ou les opsoniser. Nous avons ensuite étudié les macrophages, les cellules dendritiques myéloïdes et plasmacytoïdes pour leur capacité de capture et de cross-présentation d'Ag provenant des différentes préparations cellulaires. <br />Nos travaux constituent une source de données pour la mise au point d'un protocole clinique dans le lymphome et permettent de mieux comprendre le rôle des PDC dans l'immunité.

Des peptides antigéniques sont présentés à la surface des cellules cancéreuses ou infectées par un virus pour être reconnus par des cellules du système immunitaire. Cette reconnaissance déclenche alors une réponse immunitaire spécifique contre les cellules présentatrices ciblées. L'objectif de ce projet est de stimuler cette réponse immunitaire afin qu'elle soit un moyen thérapeutique pour détruire spécifiquement les cellules cancéreuses ou infectées. Toutefois, les peptides antigéniques ne peuvent pas être administrés tels quels, du fait de leur pauvre stabilité en milieu biologique. Il est donc nécessaire de les modifier afin qu’ils soient plus résistants. Le défi de ce projet est de synthétiser des peptidomimes bio-résistants, capables de reproduire la même réponse immunitaire que celle du peptide antigénique naturel. / Abstract

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'analyse de la réponse lymphocytaire T représente une exploration de plus en plus importante pour la compréhension de la physiopathologie de maladies et le suivi de protocoles d'immunothérapie. La mise en évidence de la production de cytokines par ces cellules permet d'identifier les sous populations de lymphocytes T (LT) et d'analyser leur fonctionnalité et leur état d'activation. L'Elispot est une technique déjà largement utilisée dans le suivi de la réponse vaccinale pour la détection de cellules sécrétrices de cytokines. Bien que la séroprotection soit le critère reconnu pour déterminer l'efficacité de la vaccination antigrippale, un rôle important de la réponse lymphocytaire T a été démontré dans le contrôle de l'infection. Nos travaux ont permis de mettre en évidence que l'utilisation de vaccins totaux pour le suivi de la réponse lymphocytaire T, par l'introduction de leurs excipients, peut induire un biais dans la détection des cytokines. Le thimérosal, conservateur utilisé dans certains vaccins, provoque in vitro lors de la détection d'interféron (IFN) par Elispot l'apparition de petits spots que nous avons associés a l'activation abortive précoce des LT. Leur taille permet cependant d'éliminer automatiquement du comptage ces spots non spécifiques. Contrairement à l'Elispot dont elle est dérivée, la technique Fluorospot permet l'analyse simultanée de plusieurs cytokines et est donc plus adaptée à la détection des profils de sécrétion et de la fréquence des LT polyfonctionnels, associés à un bon pronostic dans plusieurs pathologies. Nos résultats ont permis la validation technique de ce test pour la détection des couples IFN/interleukine (IL)-10 et IFN/IL-2. Grâce au développement au laboratoire d'une lignée produisant de l'IFN et l'IL-10, nous avons montré que le Fluorospot avait une sensibilité supérieure à la cytométrie intracellulaire pour la détection de l'IFN et de l'IL-10. Il était déjà connu que l'IL-10 était difficilement détectable par cytométrie, renforçant l'intérêt du Fluorospot pour détecter les cellules Tr1. L'utilisation du Fluorospot lors du suivi de la réponse vaccinale antigrippale a également permis de démontrer une équivalence de sensibilité avec l'Elispot. Au cours du suivi de ce protocole anti-grippal, nous avons montré à l'aide du Fluorospot que la réponse LT antigrippale était surtout caractérisée par une forte production d'IL-2 et que la détection isolée d'IFN a une faible sensibilité pour la mesure des réponses LT anti-grippales. Il s'agit de la première utilisation de ce test pour le suivi d'un protocole vaccinal démontrant sa robustesse et sa faisabilité dans un contexte clinique. Nos résultats offrent donc une validation complète de la technique Fluorospot, aussi bien du point de vue technique que clinique, ouvrant des perspectives d'utilisation pour le suivi de futurs protocoles. / The detection of cellular response via its different T cell subpopulations was proved to be crucial to better understand mechanisms of pathologies and monitor protocols of immunotherapy. Unicellular cytokine measurement not only allows the assessment of their inherent role on immunological response, but also the detection of T lymphocytes (LT) secretion profile which gives information on subpopulations involved, their activation state and their functionality. Detection of the cytokine secreting cells frequency is achievable with Elispot. This test is widely used in clinical trials to monitor vaccine response to diseases such as influenza. Although seroprotection is the recognized parameter to assess anti-influenza vaccine efficiency, cellular response has been proved to play an important role in infection control. Our results highlighted that the use of the whole vaccine to monitor T cell response may induce bias in cytokine detection. Indeed, their excipients can be considered as contaminants, like Thimerosal which is used as a preservative in some vaccines. We demonstrated that it induced detection of small spots in interferon (IFN) Elispot. We proved that these spots were associated with in vitro early abortive T cell activation. However, their size enabled us to remove these unspecific spots from bona fide spots.Fluorospot test is suited for multiplex cytokine analysis. Thus it is more adapted than Elispot to detect cytokine secretion profiles and polyfunctional T cells frequency. It is worth noting that polyfunctionnal Tcells are associated with a better clinical outcome in several pathologies. Our results led to technical validation of this test for detection of two cytokines couples, IFN/interleukin (IL)-10 and IFN/IL-2. Fluorospot showed a better sensitivity than intracellular staining cytometry (ICS) in detection of IFN and IL-10 produced by a cell line transfected with the cDNA encoding these cytokines. Moreover, Fluorospot demonstrated a similar sensitivity than Elispot when used to monitor the immunological response to an anti-influenza vaccine. Furthermore, using this technique, we showed that anti-influenza T cell producing IL-2 were the dominant population of T cells. Isolated IFN producing T cells were less sensitive than the detection of IL-2 to detect specific T cell response against influenza. Therefore our results provided a full validation of Fluorospot test, for the technical part as well as for the clinical part. These conclusions open perspectives of using this method to monitor protocols in a near future.

Objectifs : Les lymphocytes T régulateurs de par leur rôle primordial dans l'homéostasie de la réponse immune sont des cellules idéales pour une immunothérapie antigène-spécifique dans les maladies auto-immunes. Les lymphocytes T régulateurs de type 1 ou Tr1 sont caractérisées par une forte sécrétion d'IL-10, cytokine qui joue un rôle déterminant dans leur capacité à supprimer des réponses immunes pathologiques dans différents contextes. L'objectif de ma thèse est d'évaluer le potentiel thérapeutique de cellules Tr1 spécifiques du collagène de type II (col-Treg) dans deux modèles de polyarthrite rhumatoïde (PR) chez la souris. Méthode : Les clones Col-Treg ne possèdent pas de marqueurs membranaires spécifiques mais sont caractérisés par un profil cytokinique particulier (IL10highIL4negIFN-γint) et par leur capacité de suppression in vitro. Tout comme les Tregs naturels, ils expriment une quantité importante de GITR, de CD39 et de Granzyme B. Une simple injection de cellules Col-Treg réduit l'incidence et les symptômes cliniques de l'arthrite à la fois de manière préventive et curative, avec un impact significatif sur les anticorps anti-collagène de type II. En outre, l'injection de Tr1 antigène spécifique in vivo diminue de manière significative la prolifération des cellules T antigène spécifique. Conclusion : Nos résultats démontrent le potentiel thérapeutique des cellules Col-Treg dans deux modèles d'arthrite expérimentale prouvant que les cellules Col-Treg représente une nouvelle approche thérapeutique de choix pour le traitement des patients atteint de polyarthrite et réfractaires aux traitements actuels. / Objectives : Regulatory T (Treg) cells play a crucial role in preventing autoimmune diseases and are an ideal target for therapies to suppress inflammation in an antigen-specific manner. Type 1 Treg cells (Tr1) are defined by their capacity to produce high levels of IL10, which contributes to their ability to suppress pathological immune responses in several settings. The aim of my PhD was to evaluate the therapeutic potential of collagen type II-specific Tr1 (Col-Treg) cells in two models of rheumatoid arthritis (RA) in mice. Methods : Col-Treg clones were isolated and expanded from Collagen-specific TCR transgenic mice. Their cytokine secretion profile and phenotype characterization were studied. The therapeutic potential of Col-Treg cells was evaluated after adoptive transfer in collagen-antibodies- and collagen-induced arthritis models. The in vivo suppressive mechanism on effector T cell proliferation was also investigated. Results : Col-Treg clones are characterized by a cytokine profile (IL10highIL4negIFN-γint) and mediate contact-independent immune suppression. They also share with natural Tregs high expression of GITR, CD39 and Granzyme B. Single infusion of Col-Treg cells reduced incidence and clinical symptoms of arthritis both in preventive and curative settings, with a significant impact on collagen type II antibodies. Importantly, injection of antigen-specific type 1 Treg cells decreases significantly the proliferation of antigen-specific effector T cells in vivo. Conclusion : Our results demonstrate the therapeutic potential of Col-Treg cells in two models of RA, providing evidence that Col-Treg could be an efficient cell-based therapy for RA patients refractory to current treatments.