Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T10:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 288452.pdf: 18421548 bytes, checksum: 1fce1ff2624a6da0c4283042fc679586 (MD5) / AIDS é um dos principais problemas de saúde pública atuais e acredita-se que a epidemia somente será controlada com uma vacina capaz de impedir ou controlar a infecção causada pelo HIV. Inúmeras estratégias vacinais têm sido investigadas experimentalmente, dentre elas o uso de vírus recombinantes como vetores vacinais, para indução de resposta imune no trato genital, uma das mais importantes portas de entrada do HIV. Neste estudo avaliou-se a indução de células T no trato genital feminino de camundongos BALB/c mediante a administração de vetores adenovirais expressando a proteína Gag de HIV-1. Diferentes protocolos de imunização utilizando vetores adenovirais símios foram avaliados quanto à indução de resposta imune celular Gag-específica em tecidos sistêmicos e de mucosas. A imunização por via intranasal induziu baixa frequência de células T CD8+ Gag-específicas no trato genital e em tecidos sistêmicos. A imunização por via intramuscular foi capaz de induzir frequência de células T CD8+ Gag-específicas de maior magnitude do que a administração por vias de mucosa, sendo esta resposta detectada em diversos tecidos, inclusive no trato genital feminino, por ao menos um ano após a administração da vacina. As células T CD8+ Gag-específicas de origem genital apresentaram elevada expressão de diversos marcadores de ativação celular e secretaram IFN- . A administração intramuscular do vetor adenoviral alterou também a frequência e o fenótipo de células T CD4+ e CD8+ de origem genital. Foi observado que apesar de anticorpos neutralizantes representarem a principal forma de interferência da imunidade pré-existente ao vetor vacinal na indução de células transgene-específicas em tecidos sistêmicos e sangue, no tecido mucoso esta situação é provavelmente também mediada por mecanismos celulares. Em conjunto, estes resultados sugerem que a administração intramuscular de vetores adenovirais símios expressando a proteína Gag de HIV-1 induz resposta imune celular transgene-específica capaz de residir no trato genital feminino por longos períodos, sendo que esta resposta pode ser alterada pela presença de imunidade pré-existente contra o vetor vacinal.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-16T10:22:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287467 bytes, checksum: 347509faadce208197eebdbfc17e054d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T10:22:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287467 bytes, checksum: 347509faadce208197eebdbfc17e054d (MD5) Previous issue date: 2000-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Essa pesquisa foi conduzida em seis fazendas de criação de bovinos leiteiros mestiços holandês-zebu de diferentes graus de sangue, localizadas nas microrregiões de Ponte Nova e Viçosa, Minas Gerais. Os objetivos consistiram em conhecer os níveis de IgG, inibidores de tripsina e lactoferrina encontrados em colostros dos referidos animais. Para isso, as determinações de IgG e de lactoferrina foram feitas através de imunodifusão radial simples e, no caso dos inibidores de tripsina, foi empregada técnica colorimétrica, utilizando-se o substrato sintético D-L, BApNA. Os níveis médios de IgG (154,94 mg/ml) e de inibidores de tripsina (0,9577 mg de tripsina inibida/ml) não foram influenciados pelos diferentes grupos de graus de sangue e se apresentaram muito superiores aos relatados para raças taurinas puras. A grande amplitude verificada para o intervalo de confiança envolvendo níveis médios de IgG não tem implicações práticas, já que seu limite inferior de 134 mg/ml é bastante elevado. Por outro lado, em se tratando de lactoferrina, vacas com mais de 75% de grau de sangue holandês apresentaram concentrações médias mais altas que as pertencentes aos demais grupos de grau de sangue. Para essa última característica, os valores médios verificados em cada grupo (1 a 4) foram, respectivamente, 0,65 mg/ml, 0,82 mg/ml, 1,58 mg/ml e 0,96 mg/ml, mas a alta variabilidade encontrada não permitiu obter uma estimativa média representativa, segundo os diferentes grupos estabelecidos. Concluiu-se, então, que, na maioria das vezes, não se justifica o emprego de métodos artificiais de fornecimento do colostro em se tratando de animais mestiços holandês-zebu. Em tese, bastaria que se recorresse à mamada natural assistida, nas primeiras horas de vida, para assegurar que bezerros mestiços holandês-zebu venham a receber adequadas concentrações de anticorpos colostrais necessários à transferência de imunidade passiva. / Colostrum samples from 88 crossbred holstein-zebu (HZ) dairy cows were analyzed for immunoglobulin G (IgG), trypsin inhibitor (TI) and lactoferrin (LF) concentrations. The first and the last were determined by single radial immunodifusion and TI by colorimetric procedure with D,L-BApNA chromogenic subtract of trypsin. Mean colostral levels of IgG and TI were 145,97 mg/ml and 0,9577 mg of trypsin inhibited/ml, respectively. Both were not influenced by group of crossbred HZ. Additionally, it was observed that the large confidence interval of IgG mean was not important because its low limit (134 mg/ml) is so high. Lactoferrin concentrations were affect by crossbred groups and the means were 0,65 mg/ml, 0,82 mg/ml, 1,58 mg/ml and 0,96 mg/ml for each group of cows. Crossbred cows with >75% HZ showed higher LF concentrations, although a representative general mean could not be obtained due its high variability. Considering these results, mainly IgG concentrations, it was concluded that it is not necessary an artificial method of feeding colostrum to crossbred holstein-zebu calves. Probably, the assisted natural sucking as soon after birth as possible is sufficient to get passive immune transfer.

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_mattos_ioc_mest_2014.pdf: 25027935 bytes, checksum: 36794f8df745a06c2879690ef1660179 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A susceptibilidade de Rhodnius prolixus ao T. rangeli depende da cepa do parasita e das interações moleculares no intestino e na hemocele do vetor. T. rangeli pode modular a resposta imune do vetor, preparando o hospedeiro à invasão e a sobrevivência dos parasitas na hemocele, superando assim as adversidades encontradas nos diferentes órgãos do inseto. Neste trabalho, são discutidos os mecanismos destas interações, destacando também o papel da microbiota intestinal e outros mecanismos importantes para o desenvolvimento do parasita. Inicialmente nossas investigações foram realizadas para comparar aspectos da imunidade celular e humoral de ninfas de 4º e 5º estádio de R. prolixus em resposta a uma infecção oral com a cepa Macias de T. rangeli. Na infecção oral em 4º estádio (acompanhamento em longo prazo), não foi observada diferença na mortalidade e muda ao comparar com os insetos controle não infectados. Constatou-se um número aumentado de flagelados no intestino das ninfas de 5º estádio durante o curso da infecção. Também, não houve alteração significativa na contagem de microagregados hemocitários (nódulos) em infecções de 4º estádio, enquanto em ninfas infectadas em 5º estádio houve um aumento no número de nódulos. Por outro lado, não houve diferença no número de hemócitos em ambas as infecções Demonstramos nos dois tipos de infecção oral com T. rangeli em R. prolixus, em comparação com os insetos controle não infectados, que o intestino médio atenuou a atividade de fenoloxidase, aumentou as atividades antibacterianas testadas in vitro contra Serratia marcescens, e alterou a expressão relativa de genes que codificam para defensinas (DefA, DefB, DefC), prolixicina e lisozimas (LisAe LisB). Isto sugere a influência destas atividades sobre a contagem de unidades formadoras de colônias, encontradas diminuídas no trato digestivo do inseto. Em uma segunda etapa do estudo, foram comparadas as respostas de defesa em ninfas de 5º estádio de R. prolixus inoculadas com T. rangeli, cepas Macias e H14. A cepa Macias de T. rangeli não aumentou a mortalidade desses insetos, apresentou capacidade de sobreviver e se multiplicar na hemolinfa, aumentou o número de hemócitos, e induziu alta atividade de fenoloxidase. Em contraste, estes mesmos parâmetros medidos em insetos inoculados com a cepa H14 de T. rangeli foram diferentes daqueles encontrados com inoculação de insetos usando a cepa Macias. Conclui-se que R. prolixus responde de forma distinta frente a vias de infecção oral ou por inoculação com T. rangeli, sugerindo que a capacidade infectiva deste protozoário, pode ser alterada por modulação do sistema imune do vetor

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 521.pdf: 1271118 bytes, checksum: 875497805ab7b1625a92ed477fad5b66 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Dengue é considerada a mais importante arbovirose, constituindo um grave problema de saúde pública no mundo. A doença é causada por um Flavivirus com quatro sorotipos (DENV-1, 2, 3 e 4) antigenicamente similares, mas imunologicamente distintos. A circulação simultânea desses sorotipos é apontada como um importante fator de risco para determinação dos casos graves da doença, pois aumenta a probabilidade de ocorrência de infecções secundárias e o surgimento de genótipos mais virulentos. Inquérito sorológico de base populacional conduzido na cidade do Recife, Pernambuco, entre 2005-2006, em 2.833 indivíduos com idades entre 05 e 64 anos, residentes em três áreas com condições sócio-econômicas distintas encontrou prevalência global superior a 80 por cento, indicando elevada transmissão da infecção no município. Esse estudo investigou a imunidade antidengue sorotipo específica em uma amostra aleatória de 324 participantes com sorologia positiva (IgG) de uma das áreas investigadas. Além disso, estimou-se a proporção de susceptíveis aos diferentes sorotipos na população, com base na extrapolação dos resultados da amostra. O teste de neutralização por redução do número de placas (PRNT) foi utilizado na sorotipagem. A freqüência de infecções monotípicas e multitípicas foram analisadas de acordo com grupo etário, sexo, dengue auto-referida e busca por atendimento. Observou-se elevada proporção de indivíduos imunes ao DENV-3 (35,6 por cento; IC: 86,7-96,6) e de infecções multitípicas (61,6 por cento), não tendo sido observado diferenças entre os grupos etários (p=0,395). Houve maior proporção de susceptíveis aos sorotipos DENV-1 (15 anos

A hipertensão arterial (HA) é uma desordem comum com etiologia incerta. Entretanto, sabe-se que a inflamação vascular caracterizada pela infiltração de células do sistema imune é um mecanismo importante no desenvolvimento desta condição. Outro distúrbio hipertensivo conhecido é a pré-eclampsia (PE), uma síndrome específica da gravidez, caracterizada pela ativação excessiva do sistema imunológico materno, levando à inflamação e disfunção endotelial, causando hipertensão. Existem fortes evidências que receptores da imunidade inata (pattern-recognition receptors – PRRs) também tem um importante papel no desenvolvimento da HA e da PE. Os PRRs reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs) ou a ligantes endógenos (danger-associated molecular patterns – DAMPs), ativando diferentes cascatas de sinalização que regulam respostas inflamatórias locais e sistêmicas. Estes receptores incluem retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like helicases (RLHs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) e toll-like receptors (TLRs). Apesar de alguns estudos já terem ligado a ativação excessiva de PRRs à PE, ainda não é claro como essa ativação leva ao desenvolvimento desta complicação. Dessa forma, visando esclarecer se diferentes PRRs estão realmente associados com PE e como isto ocorre, realizamos uma revisão sistemática da literatura sobre o assunto. Vinte e seis estudos estavam de acordo com os critérios de inclusão e foram revisados: 20 que analisaram expressões de PRRs de acordo com a presença de PE e 6 que investigaram a associação de polimorfismos nos genes para PRRs e esta complicação. Poucos estudos analisaram expressões nos genes RIG-I, IFIH1, TLR-1, 5, 6, 7, 8 e 9 em células do sistema imune ou placentas de mulheres com PE (casos) ou mulheres grávidas saudáveis (controles). Sendo assim, ainda é inconclusivo se estes PRRs estão envolvidos no desenvolvimento da PE. Os resultados dos 10 estudos que analisaram expressões do TLR-2 em casos e controles também são contraditórios. A maioria dos estudos que investigaram expressões do TLR-3 e TLR-4 em casos e controles para PE indicam que estes receptores estão aumentados na placenta ou células imunes de mulheres com PE. Até o momento, polimorfismos nos genes TLR-2, 3, e 4 e NOD-2 não parecem estar associados com o desenvolvimento da PE. O receptor interferon-induced with helicase C domain 1 (IFIH1) é uma NLR que tem um papel importante na imunidade inata contra infecções virais. Interessantemente, um estudo prévio realizado pelo nosso grupo demonstrou uma expressão aumentada do gene IFIH1 em células mononucleares de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e HA comparado a pacientes normotensos. Além disso, um estudo prévio sugeriu a associação deste receptor com PE. Sendo assim, visando esclarecer o papel do IFIH1 na HA e PE, comparamos a expressão de IFIH1 e as frequências do polimorfismo rs1990760 neste gene entre mulheres com PE (casos) e mulheres grávidas saudáveis (controles). Em um estudo experimental, também avaliamos o efeito do knockdown do IFIH1 com siRNA em uma linhagem de células endoteliais humanas tratadas com ácido nucléico viral sintético (PIC) na expressão de genes relacionados à inflamação, angiogênese e hipertensão. No estudo de caso-controle, a expressão gênica de IFIH1 foi diminuída em placentas de mulheres com PE (n = 44) comparado ao grupo controle (n = 65) (p= 0,049). Após a exclusão das mulheres negras da amostra, esta diferença entre grupos foi mais pronunciada (p= 0,004). As frequências do polimorfismo rs1990760 não diferiram significativamente entre mulheres com PE (n = 59) e mulheres controles (n = 134). Para o estudo experimental, células HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) foram transfectadas com um siRNA controle ou com dois diferentes siRNAs contra o IFIH1, por 48 h. Em seguida, as HUVECs foram transfectadas com PIC, por 24h, para mimetizar uma infecção viral. Após este período, o RNA total foi extraído para as análises de expressão gênica. O tratamento com PIC induziu um aumento significativo nas expressões de TNF, IFN-, iNOS, VEGF, ANGPT-2 e ET-1 e o bloqueio do IFIH1 foi capaz de prevenir parcialmente o aumento nestes genes. O tratamento com PIC não induziu a expressão gênica de PGE-2 (p >0,05). Todos os resultados de expressão gênicas foram confirmados nos experimentos usando um segundo siRNA contra IFIH1. O aumento nos níveis proteicos de Ang-II-induzidos por PIC pareceram diminuir após bloqueio do IFIH1, mas esta diferença não atingiu significância formal (p= 0,069). Para avaliar se os genes relacionados à hipertensão e angiogênese poderiam ser induzidos em um ambiente inflamatório não viral, as HUVECs foram tratadas com a citocina pró-inflamatória IFN- por 48 h. O tratamento com esta citocina aumentou significativamente as expressões de STAT-1, PGE-2, ANGPT-2 e VEGF. Estes resultados indicam que um ambiente inflamatório não viral é suficiente para ativar a via do IFIH1 em células endoteliais. Dessa forma, estudos adicionais são necessários para definir quais PAMPs ou DAMPs podem ativar IFIH1 nessas células levando a expressão de genes relacionados à inflamação, angiogênese e hipertensão. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a expressão de IFIH1 está diminuída em mulheres com PE, provavelmente contribuindo a patogênese desta complicação. Além disso, experimentos in vitro nas HUVECs demonstraram que o tratamento com PIC é capaz de induzir as expressões de genes relacionadas à inflamação, angiogênese e hipertensão e que o bloqueio do IFIH1 diminui o aumento na expressão destes genes. Este estudo contribuir com um possível novo papel do IFIH1 na patogênese da PE e HA. / Arterial hypertension (AH) is a common disorder with unknown etiology. However, it is known that vascular inflammation characterized by infiltration of immune cells is a key mechanism in the development of this condition. Other recognized hypertensive disorder is preeclampsia (PE), a specific pregnancy syndrome characterized by excessive activation of the maternal immune system, leading to inflammation and endothelial dysfunction, and then causing hypertension. There are strong evidences that innate immunity receptors (pattern-recognition receptors – PRRs) play an important role in the development of AH and PE. PRRs recognize highly conserved pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) as well as endogenous ligands (danger-associated molecular patterns – DAMPs), activating different signaling cascades that regulate local and systemic inflammatory responses. These receptors include retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like helicases (RLHs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) e toll-like receptors (TLRs). Even though some studies have linked an excessive PRR activation to PE, it is still unclear how this activation might lead to the development of this complication. Therefore, aiming to elucidate if different PRRs are indeed associated with PE and how this occurs, we conducted a systematic review of the literature on the subject. Twenty-six studies met the inclusion criteria and were revised: 20 of them analyzed PRR expressions according to PE presence, and 6 studies investigated the association between PRR polymorphisms and this complication. Only few studies analyzed RIG-I, IFIH1, TLR-1, 5, 6, 7, 8 and 9 expressions in immune cells or placentas from PE women (cases) and healthy pregnant women (controls); therefore, it is still inconclusive if these PRRs are involved in PE. Results from the 10 studies that analyzed TLR-2 expressions in cases and controls are contradictory. The majority of the studies that investigated TLR-3 and TLR-4 expressions in cases and controls indicate that these PRRs are increased in placenta or immune cells from PE women. To date, polymorphisms in TLR-2, 3, and 4 and NOD-2 genes do not seem to be associated with PE development. The interferon-induced with helicase C domain 1 (IFIH1) receptor is a NLR that plays an important role in the innate immunity against viral infections. Interestingly, a previous study published by our group demonstrated an increased IFIH1 expression in mononuclear cells from type 1 diabetic patients with AH compared to normotensive patients. Moreover, this receptor also seems to be associated with PE. Hence, to further investigate the role of IFIH1 in AH and PE, we compared IFIH1 expressions and frequencies of the rs1990760 in this gene between PE women (cases) and healthy pregnant women (controls). In an experimental study, we also evaluated the effect of IFIH1 knockdown with siRNA in a human endothelial cell line treated with synthetic viral nucleic acid (PIC) in the expression of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension. In the case-control study, IFIH1 expression was decreased in placenta from PE women (n = 44) compared to the control group (n = 65) (P= 0.049). After exclusion of black women, the difference between groups was more pronounced (P= 0.004). Frequencies of the rs1990760 polymorphism did not differ significantly between PE women (n = 59) e control women (n = 134). In the experimental study, HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) were transfected with either a control siRNA or with two different siRNAs targeting IFIH1 for 48h. Then, HUVECs were transfected with PIC, for 24 h, to mimic a viral infection. After this period, total RNA was extracted for gene expression analyses. PIC treatment induced a significant increase in TNF, IFN-, iNOS, VEGF, ANGPT-2, and ET-1 expressions, and the IFIH1 knockdown was able to partially prevent the up-regulation of these genes. PIC treatment did not influence PGE-2 gene expression (P >0.05). All gene expression results were confirmed in experiments using a second siRNA targeting IFIH1. IFIH1 knockdown seemed to prevent PIC-induced increase of Ang-II protein levels, although this difference did not reach formal statistical significance (P= 0.069). To evaluate if hypertension- and angiogenesis-related genes could be also induced in a non-viral inflammatory environment, HUVECs were treated with the pro-inflammatory cytokine IFN- for 48 h. Treatment with this cytokine significantly increased STAT-1, PGE-2, ANGPT-2 e VEGF gene expressions. These results indicate that a non-viral inflammatory environment is sufficient to activate IFIH1 pathway. Therefore, further studies are necessary to clarify which PAMPs or DAMPs could activate IFIH1 in these cells, leading to the expression of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension. In conclusion, our results suggest that IFIH1 gene expression is decreased in placentas from PE women, probably contributing to PE pathogenesis. Furthermore, the in vitro experiments in HUVECs demonstrated that PIC treatment induces expressions of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension, which is decreased after IFIH1 knockdown. This study adds a new possible role for IFIH1 in the pathogenesis of PE and AH.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T17:56:02Z No. of bitstreams: 1 thatiane_s_simone_ioc_bcm_0011_2010.pdf: 9522536 bytes, checksum: fa6d5ea74828d496e73423373aedb60d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T17:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thatiane_s_simone_ioc_bcm_0011_2010.pdf: 9522536 bytes, checksum: fa6d5ea74828d496e73423373aedb60d (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Este estudo apresenta os resultados da identificação de epitopos consecutivos responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune humoral em todas as proteínas estruturais (C, prM / M e E) e não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5) dos vírus dengue (DENV) tipos 1,2 e 3 circulantes no Brasil. A metodologia de síntese paralela de peptídeos (do inglês Spot synthesis) foi utilizada para a construção de uma biblioteca composta por 2007 peptídeos e, a tiragem utilizando pool de soros de pacientes com dengue, previamente confirmados através de técnicas laboratoriais, permitiu a identificação de 96 epitopos para os DENV-1, 103 epitopos para os DENV-2 e 106 epitopos para os DENV-3. Tais resultados foram comparados com métodos computacionais que permitem a predição de regiões imunogênicas (DNASTAR e IEDB) e demonstrou que, apesar de serem considerados bons indicadores de antigenecidade de uma proteína, os métodos computacionais requerem mais do que um parâmetro de predição para a confiabilidade dos resultados. Por sua vez, a síntese paralela provou ser altamente sensível e eficiente no mapeamento de epitopos consecutivos, permitindo a síntese em nano-escala de um grande número de peptídeos, de forma simultânea e reprodutível.. A fim de avaliar a capacidade em discriminar as infecções causadas pelos sorotipos de dengue daqueles negativos para esta patologia, foi realizado um teste de reação cruzada dos peptídeos identificados com pool de soros de pacientes com DENV-1, DENV-2 ou DENV-3, seguido pela avaliação utilizando pool de soros negativos para dengue, pool de soro de voluntários previamente vacinados para a febre amarela e pool de soros de pacientes com rubéola, sarampo, leptospirose, malária varíola e indicaram a existência de um total de 195 epitopos comuns ao grupo dengue e 3 epitopos específicos para os DENV-1, 9 para os DENV-2 e 11 para os DENV-3. A modelagem molecular das proteínas dos DENV permitiu a confirmação da localização dos epitopos na superfície da molécula. Esses resultados constituem a primeira descrição completa de epitopos contínuos dos DENV e poderão contribuir para a compreensão da interação anticorpo-epítopo em nível molecular e, conseqüentemente, a patogenicidade do dengue, bem como servir de base para a construção racional de vacinas preventivas e para o desenvolvimento de testes de diagnóstico sorológicas vírus-específicos. / This study shows the results of identification of epitopes responsible for consecutive triggering of humoral immune response in all structural proteins (C, prM / M, and E) and non-structural (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4A, NS4B and NS5) of dengue virus (DENV) types 1,2 and 3 circulating in Brazil. The methodology for parallel synthesis of peptides (English Spot synthesis) was used to construct a library comprising peptides and 2007, using the pull pool of sera from patients with dengue previously confirmed by laboratory techniques allowed the identification of 96 epitopes for DENV-1, 103 epitopes for DENV-2 and 106 epitopes for DENV-3. These results were compared with computational methods which allow predicting immunogenic regions (DNASTAR and iedb) and demonstrated that, although they are considered good predictors of antigenicity of a protein, computational methods require more than one parameter for predicting the reliability of results. In turn, the parallel synthesis proved to be highly sensitive and efficient in the epitope mapping consecutive allowing the nano-scale synthesis of large numbers of peptides, simultaneously and reproducible .. In order to assess the ability to discriminate infections caused by serotypes of dengue those negative for this disease, we performed a test cross-reactivity of peptides identified with pooled sera from patients with DENV-1, DENV-2 and DENV-3, followed by evaluation using pool negative sera to Dengue, pool of serum from subjects previously vaccinated for yellow fever and pool of sera from patients with rubella, measles, leptospirosis, malaria, smallpox and indicated the existence of a total of 195 epitopes common to the group 3 and dengue-specific epitopes for DENV-1, 9 for DENV-2 and 11 for DENV-3. Molecular modeling of the proteins of DENV allowed confirmation of the location of epitopes on the surface of the molecule. These results provide the first complete description of continuous epitopes of DENV and may contribute to the understanding of the interaction of antibody-epitope at the molecular level and, consequently, the pathogenicity of dengue, as well as serve as a basis for the rational construction of preventive vaccines and to development of serological diagnostic tests virus-specific.

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_souza_ioc_mest_2014.pdf: 1831146 bytes, checksum: 04aa0a5bc9247dd22f10b502b36fa8d1 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / β - 1,3 - glucanases estão envolvidas na digestão de insetos que utilizam como fonte nutricional detritos ou plantas . Nesse trabalho, nós investigamos o papel dos genes da família 16 das glicosídeo hidrolases (GHF 16) em larvas de Ae. aegypti e sua possível participação na digestão de leveduras. O genoma de Ae. aegypti contém seis genes (Aae GH16. 1 – Aae GH16. 6) que codificam para proteínas da família GH16 , contendo de 2 a 6 éxons. Análises filogenéticas sugerem que em Nemá toceros ocorreram duplicações em alguns genes que contê m a região catalítica conservada nessa família de proteínas (Aae GH16. 1, 2, 3, 5, 6). Ess a s proteínas são similares a outras proteínas de insetos com atividades glucanásicas. A proteína Aae GH16. 4 parece estar relacionad a a proteínas ligantes de β - 1,3 - glucana, não possuindo os resíduos catalíticos conservad os e peptídeo sinal. β - , 1,3 - glucanases e proteínas ligantes de β - glucana são proteínas homológas e parecem ter sido originadas a partir do mesmo gene ancestral , antes da diversificação dos holometábolos. Larvas de Ae. aegypti possuem atividades de β - 1,3 glucanases na cabeça, tubo digestivo e resto do corpo. A s atividade s encontradas no tubo digestivo não foram atribuídas à dieta das larvas. Essas atividades possuem uma faixa de pH ótimo entre 5 - 9 e massas moleculares de 41 kDa a 150 kDa. Larvas de Ae. aegypti se desenvolvem a partir da eclosão dos ovos até a fase adulta em uma dieta exclusiva contendo leveduras Ustilago sp (vivas ou autoclavadas), porém esta condição não provocou uma indução das atividades de β - 1,3 - glucanases. O homogenato do tubo digestivo das larvas parece lisar a parede das leveduras após 4 h de incubação. Todos os genes da família GH16 foram expressos em todos os tecidos e apresentaram diferentes padrões de expressão. Larvas silenci adas para os genes AeGH 16. 5 da GHF 16 apresentaram fenótipos de curvas de sobrevivência e taxas de pupação inferiores aos controles. Sob condições de estresse, o fenótipo observado nas larvas se agrava consideravelmente, principalmente nos genes AeGH16.1 e AeGH16.6. Nos experimentos de ensaios enzimáticos d e β - 1,3 - glucanases, insetos silenciados para o gene AeGH16. 5 apresent aram uma atividade muito inferior comparado s aos silenciados para AeGH16.6 ou a os grupos controles (GFP e água) em amostras de tubo digestivo. Ensaios nesses grupos utilizando o resto d o corpo não sofreram alterações. O perfil cromatográfico do tubo digestivo também foi analisado, e novamente insetos silenciados para AeGH16. 5 apresent aram um pico de atividade menor que os demais , sugerindo que esse gene codifica a  - 1,3 - glucanase intestinal em larvas de Ae.aegypti / Insect β - 1 , 3 - glucanases are involved in digestion of detritus and plant hemicellulose. We investigated the role of GH16 genes in Ae.aegypti larvae , and its putative participation in digestion of fungi. The genome of Ae.aegypti contains six genes coding for GHF16 proteins (Aae GH16.1 – Aae GH16.6), containing 2 - 6 exons. Phylogenetic analysis suggest s that Aae GH16.1 , 2, 3, 5 and 6 , which contain the GHF16 conserved catalytic residues , are related to other insect glucanases . These genes apparently suffered duplications in the genomes of Nematocera. Aae GH16.4 is related to β - 1,3 - glucan binding proteins, which have no catalytic activity. β - 1,3 - glucanases and β - glucan binding proteins are homologous proteins, which originated by gene duplication prior to the origin of the Holometabola. Ae.aegypti larvae contain β - 1, 3 - glucanase activity in the head, gut and rest of body. Gut activity is not acquired from food. These activities have optimum pH about 5 - 6 and molecular masses between 41 and 150 kDa. Ae.aegypti develops well from egg to adults feeding on ly on live or autoclaved yeasts and activity of β - 1, 3 - glucanases is not induced by both diets. Larval gut homogenates lyse live Ustilago sp af ter 4 hours of incubation. All GH16 genes showed different levels of expression in the larval head, gut or rest of body. Larvae k nock - down of gene AeGH16. 5 of GHF 16 showed phenotype with survival curve and rate of pupation lower than control s (GFP and water) . However, under stress conditions severe mortalities are observed in AeGH16.1 and AeGH16.6 knocked - down larvae . Enzy matic assays of β - 1 , 3 - glucanase in AeGH16.5 silenced larvae exhibited lower activity in the gut and no change in the rest of body . Chromatographic activity profiles from gut samples after GH16.5 silencing showed lower activity, suggesting that this gene codes for the larval digestive  - 1 , 3 - glucanase

A hipertensão arterial (HA) é uma desordem comum com etiologia incerta. Entretanto, sabe-se que a inflamação vascular caracterizada pela infiltração de células do sistema imune é um mecanismo importante no desenvolvimento desta condição. Outro distúrbio hipertensivo conhecido é a pré-eclampsia (PE), uma síndrome específica da gravidez, caracterizada pela ativação excessiva do sistema imunológico materno, levando à inflamação e disfunção endotelial, causando hipertensão. Existem fortes evidências que receptores da imunidade inata (pattern-recognition receptors – PRRs) também tem um importante papel no desenvolvimento da HA e da PE. Os PRRs reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs) ou a ligantes endógenos (danger-associated molecular patterns – DAMPs), ativando diferentes cascatas de sinalização que regulam respostas inflamatórias locais e sistêmicas. Estes receptores incluem retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like helicases (RLHs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) e toll-like receptors (TLRs). Apesar de alguns estudos já terem ligado a ativação excessiva de PRRs à PE, ainda não é claro como essa ativação leva ao desenvolvimento desta complicação. Dessa forma, visando esclarecer se diferentes PRRs estão realmente associados com PE e como isto ocorre, realizamos uma revisão sistemática da literatura sobre o assunto. Vinte e seis estudos estavam de acordo com os critérios de inclusão e foram revisados: 20 que analisaram expressões de PRRs de acordo com a presença de PE e 6 que investigaram a associação de polimorfismos nos genes para PRRs e esta complicação. Poucos estudos analisaram expressões nos genes RIG-I, IFIH1, TLR-1, 5, 6, 7, 8 e 9 em células do sistema imune ou placentas de mulheres com PE (casos) ou mulheres grávidas saudáveis (controles). Sendo assim, ainda é inconclusivo se estes PRRs estão envolvidos no desenvolvimento da PE. Os resultados dos 10 estudos que analisaram expressões do TLR-2 em casos e controles também são contraditórios. A maioria dos estudos que investigaram expressões do TLR-3 e TLR-4 em casos e controles para PE indicam que estes receptores estão aumentados na placenta ou células imunes de mulheres com PE. Até o momento, polimorfismos nos genes TLR-2, 3, e 4 e NOD-2 não parecem estar associados com o desenvolvimento da PE. O receptor interferon-induced with helicase C domain 1 (IFIH1) é uma NLR que tem um papel importante na imunidade inata contra infecções virais. Interessantemente, um estudo prévio realizado pelo nosso grupo demonstrou uma expressão aumentada do gene IFIH1 em células mononucleares de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e HA comparado a pacientes normotensos. Além disso, um estudo prévio sugeriu a associação deste receptor com PE. Sendo assim, visando esclarecer o papel do IFIH1 na HA e PE, comparamos a expressão de IFIH1 e as frequências do polimorfismo rs1990760 neste gene entre mulheres com PE (casos) e mulheres grávidas saudáveis (controles). Em um estudo experimental, também avaliamos o efeito do knockdown do IFIH1 com siRNA em uma linhagem de células endoteliais humanas tratadas com ácido nucléico viral sintético (PIC) na expressão de genes relacionados à inflamação, angiogênese e hipertensão. No estudo de caso-controle, a expressão gênica de IFIH1 foi diminuída em placentas de mulheres com PE (n = 44) comparado ao grupo controle (n = 65) (p= 0,049). Após a exclusão das mulheres negras da amostra, esta diferença entre grupos foi mais pronunciada (p= 0,004). As frequências do polimorfismo rs1990760 não diferiram significativamente entre mulheres com PE (n = 59) e mulheres controles (n = 134). Para o estudo experimental, células HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) foram transfectadas com um siRNA controle ou com dois diferentes siRNAs contra o IFIH1, por 48 h. Em seguida, as HUVECs foram transfectadas com PIC, por 24h, para mimetizar uma infecção viral. Após este período, o RNA total foi extraído para as análises de expressão gênica. O tratamento com PIC induziu um aumento significativo nas expressões de TNF, IFN-, iNOS, VEGF, ANGPT-2 e ET-1 e o bloqueio do IFIH1 foi capaz de prevenir parcialmente o aumento nestes genes. O tratamento com PIC não induziu a expressão gênica de PGE-2 (p >0,05). Todos os resultados de expressão gênicas foram confirmados nos experimentos usando um segundo siRNA contra IFIH1. O aumento nos níveis proteicos de Ang-II-induzidos por PIC pareceram diminuir após bloqueio do IFIH1, mas esta diferença não atingiu significância formal (p= 0,069). Para avaliar se os genes relacionados à hipertensão e angiogênese poderiam ser induzidos em um ambiente inflamatório não viral, as HUVECs foram tratadas com a citocina pró-inflamatória IFN- por 48 h. O tratamento com esta citocina aumentou significativamente as expressões de STAT-1, PGE-2, ANGPT-2 e VEGF. Estes resultados indicam que um ambiente inflamatório não viral é suficiente para ativar a via do IFIH1 em células endoteliais. Dessa forma, estudos adicionais são necessários para definir quais PAMPs ou DAMPs podem ativar IFIH1 nessas células levando a expressão de genes relacionados à inflamação, angiogênese e hipertensão. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a expressão de IFIH1 está diminuída em mulheres com PE, provavelmente contribuindo a patogênese desta complicação. Além disso, experimentos in vitro nas HUVECs demonstraram que o tratamento com PIC é capaz de induzir as expressões de genes relacionadas à inflamação, angiogênese e hipertensão e que o bloqueio do IFIH1 diminui o aumento na expressão destes genes. Este estudo contribuir com um possível novo papel do IFIH1 na patogênese da PE e HA. / Arterial hypertension (AH) is a common disorder with unknown etiology. However, it is known that vascular inflammation characterized by infiltration of immune cells is a key mechanism in the development of this condition. Other recognized hypertensive disorder is preeclampsia (PE), a specific pregnancy syndrome characterized by excessive activation of the maternal immune system, leading to inflammation and endothelial dysfunction, and then causing hypertension. There are strong evidences that innate immunity receptors (pattern-recognition receptors – PRRs) play an important role in the development of AH and PE. PRRs recognize highly conserved pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) as well as endogenous ligands (danger-associated molecular patterns – DAMPs), activating different signaling cascades that regulate local and systemic inflammatory responses. These receptors include retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like helicases (RLHs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) e toll-like receptors (TLRs). Even though some studies have linked an excessive PRR activation to PE, it is still unclear how this activation might lead to the development of this complication. Therefore, aiming to elucidate if different PRRs are indeed associated with PE and how this occurs, we conducted a systematic review of the literature on the subject. Twenty-six studies met the inclusion criteria and were revised: 20 of them analyzed PRR expressions according to PE presence, and 6 studies investigated the association between PRR polymorphisms and this complication. Only few studies analyzed RIG-I, IFIH1, TLR-1, 5, 6, 7, 8 and 9 expressions in immune cells or placentas from PE women (cases) and healthy pregnant women (controls); therefore, it is still inconclusive if these PRRs are involved in PE. Results from the 10 studies that analyzed TLR-2 expressions in cases and controls are contradictory. The majority of the studies that investigated TLR-3 and TLR-4 expressions in cases and controls indicate that these PRRs are increased in placenta or immune cells from PE women. To date, polymorphisms in TLR-2, 3, and 4 and NOD-2 genes do not seem to be associated with PE development. The interferon-induced with helicase C domain 1 (IFIH1) receptor is a NLR that plays an important role in the innate immunity against viral infections. Interestingly, a previous study published by our group demonstrated an increased IFIH1 expression in mononuclear cells from type 1 diabetic patients with AH compared to normotensive patients. Moreover, this receptor also seems to be associated with PE. Hence, to further investigate the role of IFIH1 in AH and PE, we compared IFIH1 expressions and frequencies of the rs1990760 in this gene between PE women (cases) and healthy pregnant women (controls). In an experimental study, we also evaluated the effect of IFIH1 knockdown with siRNA in a human endothelial cell line treated with synthetic viral nucleic acid (PIC) in the expression of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension. In the case-control study, IFIH1 expression was decreased in placenta from PE women (n = 44) compared to the control group (n = 65) (P= 0.049). After exclusion of black women, the difference between groups was more pronounced (P= 0.004). Frequencies of the rs1990760 polymorphism did not differ significantly between PE women (n = 59) e control women (n = 134). In the experimental study, HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) were transfected with either a control siRNA or with two different siRNAs targeting IFIH1 for 48h. Then, HUVECs were transfected with PIC, for 24 h, to mimic a viral infection. After this period, total RNA was extracted for gene expression analyses. PIC treatment induced a significant increase in TNF, IFN-, iNOS, VEGF, ANGPT-2, and ET-1 expressions, and the IFIH1 knockdown was able to partially prevent the up-regulation of these genes. PIC treatment did not influence PGE-2 gene expression (P >0.05). All gene expression results were confirmed in experiments using a second siRNA targeting IFIH1. IFIH1 knockdown seemed to prevent PIC-induced increase of Ang-II protein levels, although this difference did not reach formal statistical significance (P= 0.069). To evaluate if hypertension- and angiogenesis-related genes could be also induced in a non-viral inflammatory environment, HUVECs were treated with the pro-inflammatory cytokine IFN- for 48 h. Treatment with this cytokine significantly increased STAT-1, PGE-2, ANGPT-2 e VEGF gene expressions. These results indicate that a non-viral inflammatory environment is sufficient to activate IFIH1 pathway. Therefore, further studies are necessary to clarify which PAMPs or DAMPs could activate IFIH1 in these cells, leading to the expression of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension. In conclusion, our results suggest that IFIH1 gene expression is decreased in placentas from PE women, probably contributing to PE pathogenesis. Furthermore, the in vitro experiments in HUVECs demonstrated that PIC treatment induces expressions of genes related to inflammation, angiogenesis and hypertension, which is decreased after IFIH1 knockdown. This study adds a new possible role for IFIH1 in the pathogenesis of PE and AH.

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas. Programa de Pós-Graduação em Direito / Made available in DSpace on 2012-10-20T01:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:56:11Z : No. of bitstreams: 1 182940.pdf: 3589766 bytes, checksum: 44a1ba6dca5df0d86ea85603970544fe (MD5) / Análise da natureza jurídicas das imunidades tributárias no direito brasileiro, partindo de sua surgimento e evolução no direito brasileiro, positivação pela Constituição Federal de 1988 e a interpretação dada pela jurisprudência brasileira sobre os pontos mais polêmicos, com especial atenção a jurisprudência do Supremo Tribunal Federal.