Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-25T12:12:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T12:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos nematófagos são controladores naturais de nematoides parasitos de plantas e animais. São amplamente usados no controle biológico de nematoides parasitos gastrintestinais (NPG) de ruminantes por reduzir formas de vida livre nas pastagens. O processo de captura de nematoides segue uma ordem de eventos que envolve atração, adesão, penetração e degradação da cutícula do nematoide. As fases de penetração e degradação, envolvem a produção e secreção de enzimas extracelulares capazes de hidrolisar a cutícula dos nematoides, causando sua morte. Proteases de Arthrobotrys cladodes (CG719) foram purificadas por cromatografia de troca aniônica (Mono Q) e gel filtração em coluna Protein-Pak em sistema HPLC. A atividade nematicida das proteases foi testada em larvas infectantes (L 3 ) de nematoides parasitos gastrintestinais de ruminantes. O efeito sobre a bainha e cutícula das larvas foi observado por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As proteases purificadas chamadas de proteases de Arthrobotrys cladodes I (AcPI) e proteases de Arthrobotrys cladodes II (AcPII), têm massa molecular estimada de 56 e 39 kDa, respectivamente. A atividade enzimática dessas proteases foi maior em pH neutro a alcalino (7-8) e em temperaturas de 55 a 60°C. Ambas foram inativadas pelo inibidor fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) sugerindo pertencerem ao grupo das serina proteases. As proteases apresentaram maior atividade enzimática na presença do íon metálico Ca +2 . A fração de protease, purificada por cromatografia de troca aniônica, apresentou atividade larvicida provocando a morte de 53% das L 3 de NPG após 24 h de exposição. As AcPI e AcPII causaram mortalidade de 31 e 27% das L 3 , respectivamente, após 24 h, sugerindo ação aditiva na degradação da cutícula dos nematoides. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão, foram observadas alterações morfológicas, descamações, danos na camada basal, epicutícula, “annulis”, “furrows”, “alae”, hipoderme, e musculatura. Em algumas regiões, a camada cortical foi inteiramente destruída. Lesões provocaram extravasamento de líquido intracelular e perda de tecido. Proteases extracelulares secretadas por A. cladodes foram eficientes na penetração e degradação da cutícula de nematoides. Estas enzimas romperam a integridade física e fisiológica da dupla cutícula de L 3 de NPG. Isto pode permitir o desenvolvimento de fármacos para agir, diretamente, sobre helmintos ou, de forma sinérgica, com medicamentos comerciais. / Nematophagous fungi are natural enemies of parasitic nematodes of plants and animals. They are widely used in biological control of gastrointestinal nematodes (GIN) of ruminants by reducing free-living forms in pastures. The nematode capture process follows an order of events that involves attraction, adhesion, penetration and degradation of nematode cuticle. The phases of penetration and degradation, involve the production and secretion of extracellular enzymes capable of hydrolyzing the cuticle of the nematodes, causing their death. Proteases from Arthrobotrys cladodes (CG719) were purified by anion exchange chromatography (Mono Q) and gel filtration on a Protein-Pak column by HPLC system. The nematicidal activity of the proteases was tested in infective larvae (L3) of gastrointestinal parasitic nematodes of ruminants. The effect on the sheath and cuticle of the larvae were observed by scanning and transmission electron microscopy. The purified proteases called Proteases from Arthrobotrys cladodes I (AcPI) and Proteases from Arthrobotrys cladodes II (AcPII), have an estimated molecular mass of 56 and 39 kDa, respectively. The enzymatic activity of these proteases was higher at neutral to alkaline (7-8) pH and at temperatures of 55 to 60°C. Both were inactivated by the phenylmethylsulfonyl fluoride inhibitor (PMSF) suggesting that they belong to the serine proteases group. The proteases showed higher enzymatic activity in the presence of the Ca +2 metal ion. The protease fraction, purified by anion exchange chromatography, showed larvicidal activity causing the death of 53% of L 3 from GINs after 24 h of exposure. AcPI and AcPII caused mortality of 31 and 27% of L 3 , respectively, after 24 h, suggesting additive action in the degradation of the nematode cuticle. In scanning and transmission electron microscopy morphological changes, peeling, basal layer, epicuticle, annulis, furrows, alae, hypodermis, and musculature were observed. In some regions the cortical layer was entirely destroyed. Lesions caused extravasation of intracellular fluid and loss of tissue. Extracellular proteases secreted by A. cladodes were efficient in penetration and degradation of the nematode cuticle. These enzymes disrupted the physical and physiological integrity L 3 of GIN double cuticle. This may allow the development of drugs to act directly on helminths or, synergistically, with commercial drugs.

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5α e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 864 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 α and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 874 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5α e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 864 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 α and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 874 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.