Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-02Bitstream added on 2014-06-13T19:45:12Z : No. of bitstreams: 1 perini_ap_dr_jabo.pdf: 421844 bytes, checksum: 8711bc62b0ce38924a7b61b38ef31cf7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Foram estudadas modificações feitas no tempo de maturação in vitro de oócitos bovinos, incubação dos espermatozóides e separação dos mesmos por gradiente de densidade de PercollTM, bem como a associação dessas técnicas antes da fecundação para que se consiga desviar a proporção sexual dos embriões para fêmeas. O controle de qualidade foi feito em cada etapa dos procedimentos avaliando-se os parâmetros de motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides, bem como taxa de clivagem e produção in vitro dos embriões. A proporção sexual foi avaliada pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e por transferências de embriões em receptoras. Pela técnica da PCR concluiu-se que a incubação dos espermatozóides em meio FIV sem heparina por 12 horas, desviou 59% o sexo dos embriões para fêmeas, a diminuição do tempo de maturação não desviou e essas duas técnicas associadas a centrifugação em gradiente não aumentaram o desvio da proporção sexual, porém o gradiente de sexagem foi eficaz em sexar 64% dos espermatozóides para fêmeas. Obteve-se uma taxa média de prenhez de 36,73% e uma proporção de fêmeas de 88,88% com embriões produzidos a partir da associação da redução no tempo de maturação dos oócitos ao gradiente de sexagem / Were studied modifications made at the time of in vitro maturation of oocytes, sperm incubation and separation thereof by density gradient PercollTM as well as the combination of these techniques prior to fertilization to be able to divert the sex ratio of embryos females. Quality control was done at each stage of the procedures by evaluating the parameters of motility, vigor and concentration of spermatozoa and rate of cleavage and in vitro production of embryos. The sex ratio was assessed by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and embryo transfer into recipients. By the technique of PCR it was found that incubation of spermatozoa in IVF medium without heparin for 12 hours, 59% deviated sex of embryos for females, the reduction time of maturation is not shifted and associated with these two techniques do not increase the deviation of the sex ratio by gradient centrifugation, but the gradient was effective in sexing 64% of sperm to females. We obtained a mean pregnancy rate of 36.73% and a ratio of 88.88% of females with embryos produced from the combination of the reduction in the time of oocyte maturation to the gradient of sexing

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Resumo: Foram estudadas modificações feitas no tempo de maturação in vitro de oócitos bovinos, incubação dos espermatozóides e separação dos mesmos por gradiente de densidade de PercollTM, bem como a associação dessas técnicas antes da fecundação para que se consiga desviar a proporção sexual dos embriões para fêmeas. O controle de qualidade foi feito em cada etapa dos procedimentos avaliando-se os parâmetros de motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides, bem como taxa de clivagem e produção in vitro dos embriões. A proporção sexual foi avaliada pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e por transferências de embriões em receptoras. Pela técnica da PCR concluiu-se que a incubação dos espermatozóides em meio FIV sem heparina por 12 horas, desviou 59% o sexo dos embriões para fêmeas, a diminuição do tempo de maturação não desviou e essas duas técnicas associadas a centrifugação em gradiente não aumentaram o desvio da proporção sexual, porém o gradiente de sexagem foi eficaz em sexar 64% dos espermatozóides para fêmeas. Obteve-se uma taxa média de prenhez de 36,73% e uma proporção de fêmeas de 88,88% com embriões produzidos a partir da associação da redução no tempo de maturação dos oócitos ao gradiente de sexagem / Abstract: Were studied modifications made at the time of in vitro maturation of oocytes, sperm incubation and separation thereof by density gradient PercollTM as well as the combination of these techniques prior to fertilization to be able to divert the sex ratio of embryos females. Quality control was done at each stage of the procedures by evaluating the parameters of motility, vigor and concentration of spermatozoa and rate of cleavage and in vitro production of embryos. The sex ratio was assessed by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and embryo transfer into recipients. By the technique of PCR it was found that incubation of spermatozoa in IVF medium without heparin for 12 hours, 59% deviated sex of embryos for females, the reduction time of maturation is not shifted and associated with these two techniques do not increase the deviation of the sex ratio by gradient centrifugation, but the gradient was effective in sexing 64% of sperm to females. We obtained a mean pregnancy rate of 36.73% and a ratio of 88.88% of females with embryos produced from the combination of the reduction in the time of oocyte maturation to the gradient of sexing / Doutor

O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 ºC e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 µM). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 µM), baixa (12,5 µM) e também um controle (0 µM). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2'-7'diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando p≤0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX® células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. / Oxidative status may influence spermatozoa by distinct mechanisms, from capacitation to oocyte fertilization. However, reactive oxygen species (ROS) could be beneficial or harmful depending on cellular context. Due to the low levels of antioxidant enzymes of cryopreserved semen, associated to successive manipulations prior to in vitro fertilization (IVF), it is momentous to understand the mechanism involved on sperm status in such conditions and the further impact on embryo development. The present study aimed to assess the possible impact of a dose-dependent model for sperm oxidative stress on embryo development. In experiment 1, straws from five Nelore bulls were subjected to a 1 hour incubation at 38,5 ºC and 5% CO2, with increase doses of hydrogen peroxide (0; 12,5; 25; e 50 &microM). At the end of incubation period, motility parameters were evaluated by Computed Assisted System Analysis (CASA). Based on the results of the experiment 1, experiment 2 was designed to study a high (50 µM) and a low (12,5 µM) dose of hydrogen peroxide and also a control (0 µM). Sperm samples were incubated with each dose for 1 hour and subsequently used for in vitro fertilization (D=0). Samples were analyzed by CASA, oxidative status (CellROX® green and 2'-7' diclorofluorescein diacetate - DCFH), mitochondrial potential (JC-1), chromatin (LA) and sperm capacitation status (chlortetraciclin). Embryos were evaluated based on fast cleavage rate (30 hours pos-insemination), cleavage rate (D=3), development rate (D=5) and blastocyst rate (D=8). Statistical analysis was performed by polynomial regression model, considering significant a p≤0,05. A dose-dependent deleterious effect of hydrogen peroxide was observed on most motility variables evaluated by CASA, including the percentage of motile cells. Similarly, a dose-dependent increase was observed on the percentages of positive cells for CellROX®, capacitated sperm and also for LA. A decrease on the percentage of cleaved embryos and blastocyst was observed as hydrogen peroxide increased. Interestingly, a blockage was detected during the 2-4 cell stage. In these conditions when exposed to oxidative environment, sperm may present disabled motility characteristics, oxidative status and premature capacitation and such abnormalities result on impaired embryo development, from the first cleavage to blastocyst.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Alfonso Gutiérrez Ádan / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos / Doutor

O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 &ordm;C e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 &micro;M). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 &micro;M), baixa (12,5 &micro;M) e também um controle (0 &micro;M). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2&#x27;-7&#x27;diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando p&le;0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX&reg; células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. / Oxidative status may influence spermatozoa by distinct mechanisms, from capacitation to oocyte fertilization. However, reactive oxygen species (ROS) could be beneficial or harmful depending on cellular context. Due to the low levels of antioxidant enzymes of cryopreserved semen, associated to successive manipulations prior to in vitro fertilization (IVF), it is momentous to understand the mechanism involved on sperm status in such conditions and the further impact on embryo development. The present study aimed to assess the possible impact of a dose-dependent model for sperm oxidative stress on embryo development. In experiment 1, straws from five Nelore bulls were subjected to a 1 hour incubation at 38,5 &ordm;C and 5% CO2, with increase doses of hydrogen peroxide (0; 12,5; 25; e 50 &microM). At the end of incubation period, motility parameters were evaluated by Computed Assisted System Analysis (CASA). Based on the results of the experiment 1, experiment 2 was designed to study a high (50 &micro;M) and a low (12,5 &micro;M) dose of hydrogen peroxide and also a control (0 &micro;M). Sperm samples were incubated with each dose for 1 hour and subsequently used for in vitro fertilization (D=0). Samples were analyzed by CASA, oxidative status (CellROX&reg; green and 2&#x27;-7&#x27; diclorofluorescein diacetate - DCFH), mitochondrial potential (JC-1), chromatin (LA) and sperm capacitation status (chlortetraciclin). Embryos were evaluated based on fast cleavage rate (30 hours pos-insemination), cleavage rate (D=3), development rate (D=5) and blastocyst rate (D=8). Statistical analysis was performed by polynomial regression model, considering significant a p&le;0,05. A dose-dependent deleterious effect of hydrogen peroxide was observed on most motility variables evaluated by CASA, including the percentage of motile cells. Similarly, a dose-dependent increase was observed on the percentages of positive cells for CellROX&reg;, capacitated sperm and also for LA. A decrease on the percentage of cleaved embryos and blastocyst was observed as hydrogen peroxide increased. Interestingly, a blockage was detected during the 2-4 cell stage. In these conditions when exposed to oxidative environment, sperm may present disabled motility characteristics, oxidative status and premature capacitation and such abnormalities result on impaired embryo development, from the first cleavage to blastocyst.

Os resultados da produção in vitro de embriões (PIVE) sofrem variações que podem ser decorrentes do efeito do touro utilizado. Fatores paternos afetam o desenvolvimento embrionário desde as primeiras clivagens até após a ativação do genoma embrionário (AGE). Pouco se sabe sobre os mecanismos que promovem a diferença de fertilidade in vitro entre touros, muito menos as consequências no desenvolvimento do embrião. Por tanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar o momento em que ocorre divergência entre embriões oriundos de touros com diferença de fertilidade e as causas para tal divergência. Para isto, 10 touros (Alta fertilidade, AF, n=5, Baixa fertilidade, BF n=5) foram retrospectivamente selecionados a partir de um banco de dados de 3 anos de um laboratório comercial de PIVE, com aproximadamente 140 touros, baseados nas taxas de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocistos/taxa de clivagem). Embriões produzidos com o sêmen de cada um dos touros foram avaliados e classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (não clivados, 2 células, 3-4 células, 6 células, 8 células) às 24, 36, 48, 60, 72 horas pós inseminação (hpi) para estabelecer a cinética de desenvolvimento embrionário. A avaliação da taxa de fecundação foi feita a partir da contagem dos pronucleos, a taxa de clivagem foi realizada no dia 3 (D3) de cultivo in vitro, e as taxas de desenvolvimento embrionário e a taxa de blastocisto (Grau I e Grau II, GI e GII respectivamente) foram avaliadas no dia 7 (D7). Embriões no estágio de 8 células e blastocistos foram coletados de cada touro e manipulação para avaliação da abundância de 96 transcritos. Além disso, blastocistos foram avaliados quanto a contagem total de células e a fragmentação de DNA (TUNEL). Não foram encontradas diferenças em relação à cinética de desenvolvimento nos momentos observados (p&gt;0,05), nem na taxa de clivagem (AF=86,7%; BF= 84,9%; p= 0,25), entretanto, o grupo de alta fertilidade apresentou maior taxa de fecundação (72%) do grupo de baixa (62%) e também menor taxa de poliespermia (AF=16,2% BF=29,2%). Como esperado, a taxa de blastocisto (AF=29,4%; BF= 16,0%; p&lt;0,0001), e a taxa de desenvolvimento embrionário (AF=33,9 % BF= 18,9%; p&lt;0,0001) foram maiores no grupo de alta fertilidade. No estágio de oito células, 30 transcritos foram diferencialmente representados entre os grupos experimentais (p&lt;0,10). Apenas PGK1, PPIA e TFAM tiveram maior representação no grupo de alta fertilidade. Genes relacionados a estresse embrionário (9/27, 33%), proliferação celular (8/27, 30 %), metabolismo lipídico (6/27, 22%), e outras funções celulares (4/27, 15%) foram mais representados no grupo de baixa fertilidade. Blastocistos apresentaram apenas 12 genes diferencialmente representados (p&lt;0,10), sendo apenas ACSL3, ELOV1, IFNT mais representados no grupo de alta fertilidade. Não foram encontradas diferenças entre os grupos na contagem de células totais, fragmentação de DNA ou porcentagem de blastocistos GI (p&lt;0,05). Os resultados demonstraram que mesmo não sendo observados efeitos paternos na cinética embrionária inicial, a fertilidade in vitro dos touros influencia a abundância de transcritos no estágio de oito células e blastocisto, sendo desde último, em menor proporção. Um aumento da representação de genes relacionados a estresse oxidativo e apoptose no momento de AGE sugere que o desenvolvimento do embrião é prejudicado no grupo de baixa fertilidade, consequentemente resultando em uma menor taxa de blastocistos. / The use of different sires influences in vitro embryo production (IVP) outcome. Paternal effects are observed from the first cleavages until after embryonic genome activation (EGA). Little is known about the mechanisms that promote in vitro fertility differences, even less about the consequences on embryo development. Therefore, the objective of the present work was to identify divergence moment between embryos from high and low fertility bulls and identify the causes for this divergency. For that, ten bulls were retrospectively selected in high (HF; n=5) and low (LF; n=5) in vitro fertility from a database of approximately 140 bulls used in commercial IVP ranked based on embryo development rate (blastocyst/cleaved rate). IVP embryos from 5 manipulations were classified by their stage of development (2 cell, 3-4 cell, 6 cell, 8 cell), at 24, 36, 48, 60, 72 hpi, to evaluate embryo kinetics. Pronuclei were evaluated 24 hpi, cleavage rate was assessed on day 3 (D3) of in vitro culture, development rate and blastocyst rate (Grade I and II) were assessed on day 7 (D7). Abundance of 96 transcripts was analyzed in embryos at 8-cell stage and blastocysts from each bull and each manipulation. Total cell counting, and DNA fragmentation were assessed on blastocysts as well. There was no difference in early embryo kinetics (p&gt;0.05), and cleavage rate (HF=86.7%; LF= 84.9%; p= 0.25). However, fertilization rate was higher on high fertility group (72%) than low fertility (62%) and polyspermy rate was lower on high fertility compared to low fertility group (HF:16,2% LF:29,2%). As expected, blastocyst rate (HF=29.4%; LF= 16.0%; p&lt;0.0001) and development rate (HF=33.9 % LF= 18.9%; p&lt;0.0001) were higher in the high fertility group than in the low fertility. At 8 cell stage, 30 transcripts were differentially represented (p&lt;0.10) between the two groups. Only PGK1, PPIA and TFAM levels were higher in high fertility group. Stress related genes (9/27, 33%), cell proliferation (8/27, 30 %), lipid metabolism genes (6/27, 22%), and other cellular functions (4/27, 15%) were highly expressed on low fertility embryos. Blastocysts had only 12 differentially represented transcripts (plt;0.10); only ACSL3, ELOV1 and IFNT were higher in high fertility. Lipid metabolism genes (3/9, 33%) and other cellular functions (6/9, 67%) were higher in low fertility group. Results demonstrate that although there was no paternal effect on early in vitro embryo kinetics, sire in vitro fertility influences the content of transcripts at 8-cell stage and at blastocyst stage, but at a lower extent. An increase in apoptotic and oxidative stress genes at EGA stage suggest that embryo development is impaired in LF group causing reduction of blastocyst rate.

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:46:17Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_dr_jabo.pdf: 8403632 bytes, checksum: 32d25390bda4a085595ac038827009d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... / The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

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