Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado \"A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos\" foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado \"A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos\" foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado \"Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro\", verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, \"O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino\", constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs. / The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled \"in vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines\" cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, \"Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes\" we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled \"Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos\", we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, \"in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines\", we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21. / Investigate the cultivation of insect cells is related to its use in the production of biopesticides among others. For many years, chemical pesticides have contributed in pest control in agriculture. However, the use of these compounds for prolonged periods has resulted in the selection of resistant insects and environmental pollution. Therefore, it is necessary the development and improvement of biopesticides. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent of the plague of soy Anticarsia gemmatalis. Thus, studies that enhance the production of these viruses in vitro would allow a more controlled production and better quality of biopesticides. In the present research, it was investigated the susceptibility of different Sf21 cell lines to infection by AgMNPV and the growth of these cells in different systems: cultivations in schotts, in spinner flasks and in bioreactor, varying the inoculum age (IA) and initial cell concentration (X0). Variation was observed in the lineage\'s infection profile. The most appropriate lineage for the production of biopesticida where the ones denominated EMBRAPA, UFRN and GibcoG, since these showed more than 40% of the infected cells with polyhedra, while the one denominated GibcoSF had less than 2% of the infected cells with polyhedra. When studying the effect of the number of subcultures in morphology and in cell growth, an increase of 10% of the diameter and 26% in the volume of the UFRN cells was observed compared to the GibcoSF cells. Moreover, the cell growth of UFRN was 49% lower than the GibcoSF\'s. When performed the Rotational Central Composite Design (RCCD) to analyze the effect of IA and X0, the maximum specific growth rate (?max) and the maximum cell concentration (Xvmax) in cultures in schott with UFRN cells, it was obtained an empirical model. When the IA and X0 were separately analysed, it was not found significant differences for Xvmax and ?max in relation to X0. For IA, however, it was achieved the most satisfactory results for inocula with IA of 72 and 96 hours: Xvmax equals to 5.97x106 cells/mL and to 5.99x106 cells/ml, and ?max of 0.70 day-1 and 0.63 day-1, respectively. Cultures in spinner with UFRN cells clumped what led to Xvmax of 2.00x106 cells/mL. In cultivation in bioreactor with UFRN cells, was reached Xvmax of 6.21x106 cells/mL, ?max of 0.70 day-1, Qo2 in the exponential phase of 67.3 ± 3.6x10-18 molO2/cell/s, glucose to the cell yield equal to 1.0x109 cell/g of glucose and glutamine to cell yield of 3.0x109 cell/g of glutamine. It was shown, therefore, the existence of the infection alterations among different lineages of Sf21, the importance of the physiological state of the cell for the subcultivation, the occurrence of changes in cell growth according to the cultivation systems and the effect of the number of subcultivation in morphology and in growth of Sf21 cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 μM methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of β-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 μg.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of β-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-08Bitstream added on 2014-06-13T19:45:13Z : No. of bitstreams: 1 nogueira_e_dr_jabo.pdf: 663672 bytes, checksum: f044bd71ec8b6a869bb1626ab1b3b25b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da suplementação energética e com diferentes fontes de gordura na produção de embriões FIV e no perfil metabólico em novilhas nelore. Foram realizados dois experimentos, no primeiro, vinte novilhas Nelore (Bos taurus indicus) com idade média de 30 meses, com peso médio de 417,0 ± 42,4 kg foram distribuidas aleatoriamente em 3 tratamentos: T1 (n= 7), animais receberam 100% das exigências de manutença de energia, calculados conforme NRC (1997), T2 onde os animais receberam 170% das exigências de manutenção de energia (1,7 X M), e T3, onde os animais receberam 170 % das exigências de manutenção de energia com adição de 200 g de gordura protegida-AGCL (Megalac®). No segundo experimento 12 novilhas Nelore (Bos taurus indicus) com idade variando de 14 a 18 meses, com peso médio inicial de 309,6 kg, foram distribuidas em 4 tratamentos, de acordo com peso e população folicular avaliada por ultrasonografia: T1, animais receberam 100% dos requerimentos de mantença de energia, calculados conforme NRC (1997), T2- animais receberam 170% das exigências de mantença de energia, T3- idem ao T2, com adição de 4% de óleo de soja na MS, e T4- idem ao T2, com adição de 200 g de AGCL (Megalac ®). O período de adaptação foi quinze dias, onde os animais receberam feno de capim Brachiaria e ração concentrada... / Two experiments were carried to evaluate the effect of the energy and fat in the metabolic profile, follicular dynamic, oocyte and in vitro embryo production in Nelore heifers (Bos taurus indicus). In the first, twenty Nelore heifers with 30 months old, and average weight 417,0 ± 42,4 were allocated in 3 treatments, in accordance with weight and follicular population evaluated by ultrasound: T1, animals received 100% of energy maintenance, calculated as NRC (1997), T2- animals received 170% of energy maintenance; T3: animals received 170% of energy maintenance with addition of 200 g Megalac ®. In the second experiment, 12 Nelore heifers with 14-18 months and 309,6 kg average weight, were allocated in 3 treatments, in tree periods: T1, animals received 100% of energy maintenance, calculated as NRC (1997), T2- animals received 170% of energy maintenance; T3: animals received 170% of energy maintenance with addition of 4% soybean oil in Dry Matter and T4: animals received 170% of energy maintenance with addition of 200 g Megalac ®. After adaptation period, the treatment initiated, animals had synchronized ovulation, blood samples were collected, and follicular aspiration was carried to evaluate the oocytes and in vitro embryo production. Follicular development was monitored daily by ultrasonography until day post heat. The consumption of MS and the weight gain were lower in group T1 (P< 0.05), in relation to the others treatments. The FSH, LH, and albumin concentrations were not different (P > 0.05) among treatments. The cholesterol concentrations were higher in the T3 and T4 groups (P< 0.05) only in the second experiment... (Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-03T15:02:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFA_TESE.pdf: 1420174 bytes, checksum: c5656fd03fcd0a38acd22f419f0567c7 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3?0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9?1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process. / A preocupa??o da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substitui??o dos inseticidas qu?micos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utiliza??o de controle biol?gico contra pragas ? altamente desej?vel, pois reduz os riscos ambientais e p?blicos da utiliza??o de produtos qu?micos convencionais. Em particular, os v?rus do tipo baculov?rus s?o uma grande alternativa devido ? especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propaga??o. No Brasil, o baculov?rus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) ? o principal agente de controle biol?gico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produ??o in vitro de baculov?rus. Deste modo, poder? aumentar a oferta de v?rus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estrat?gias de produ??o in vitro do baculov?rus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGT?-LacZ, como influ?ncia do isolado, da cin?tica e do modo de opera??o, foram analisadas como alternativa para futura amplia??o de escala na produ??o deste bioinseticida viral. A produ??o em batelada de tr?s isolados selvagens do baculov?rus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclus?o a partir das infec??es em c?lulas de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avalia??o comparativa com recombinante vAgEGT?-LacZ. A sele??o identificou o isolado AgMNPVMP5 como melhor produtor de corpos de oclus?o de (5,30?0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infec??o. A produ??o in vitro do vAgEGT?-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois n?o h?, na literatura, a produ??o deste recombinante em sistemas de cultivo em suspens?o. Foi realizado estudo da multiplicidade de infec??o para identificar a quantidade de in?culo viral para o cultivo. A partir da?, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9?1,42)x1014 corpos de oclus?o para um volume final de 10m? de suspens?o de c?lulas infectadas. O aumento da produ??o de corpos de oclus?o obtidos a partir do vAgEGT?-LacZ foi analisado utilizando a estrat?gia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infec??o. Esta estrat?gia permitiu aumento de tr?s vezes na produ??o de corpos de oclus?o quando comparada ? produ??o em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculov?rus recombinante vAgEGT?-LacZ mostrou-se competitivo em rela??o ao baculov?rus selvagem AgMNPV-MP5

38 PIVs carried through in two laboratories of the Uberaba MGBRASIL had been used in this work with the objective to evaluate the relationship between condensation chromatin and head morphometry of spermatozoa and cleavages and blastocyst formation rates using semen of zebu bulls with normal routine tests of fertility. Smears of semen stained with of Toluidine Blue and computer image analysis had been used to evaluate the morphometry and chromatin condensation. Area (A), perimeter (P), width (L), length (C), width:length ratio (L/C), ellipticity (E), shape factor (FF), side symmetry (SL), anterior-posterior symmetry (SAP) and the three first Fourier values (F0, F1, F2) had been evaluated in the morphometric analysis. The chromatin was evaluated in relation to intensity of condensation and homogeneity. The results allowed concluding that the influence of light variations in the sperm head morphometry and the chromatin condensation on the cleavage and number of normal morfologic blastocyst in the PIV is small. / Foram utilizados os dados de 38 programações de produção in vitro de embriões (PIV), realizadas em dois laboratórios da cidade de Uberaba-MG-Brasil, com o objetivo de se avaliar a correlação entre compactação da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozóides com a taxa de clivagem e formação de blastocisto utilizando sêmen de touros zebuínos com testes de rotina normais para fertilidade. Foram utilizados esfregaços de sêmen corados com Azul de Toluidina e análise de imagem por computador para avaliar a morfometria e a compactação de cromatina. Na análise morfométrica foram avaliados: área (A), perímetro (P), largura (L), comprimento (C), razão largura:comprimento (L/C), elipsidade (E), fator forma (FF), simetria lateral (SL), simetria ântero-posterior (SAP) e descritores Fourier com amplitude de 0 a 2 (F0, F1, F2). A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação e homogeneidade. Os resultados permitiram concluir que é discreta a influência de pequenas variações observadas na morfometria da cabeça e na compactação da cromatina espermática sobre a clivagem e número de blastocistos morfologicamente normais na PIV. / Mestre em Ciências Veterinárias

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 &#956;M, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de &#946;-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 &#956;g.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de &#946;-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 &#956;M methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of &#946;-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 &#956;g.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of &#946;-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21. / Investigate the cultivation of insect cells is related to its use in the production of biopesticides among others. For many years, chemical pesticides have contributed in pest control in agriculture. However, the use of these compounds for prolonged periods has resulted in the selection of resistant insects and environmental pollution. Therefore, it is necessary the development and improvement of biopesticides. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent of the plague of soy Anticarsia gemmatalis. Thus, studies that enhance the production of these viruses in vitro would allow a more controlled production and better quality of biopesticides. In the present research, it was investigated the susceptibility of different Sf21 cell lines to infection by AgMNPV and the growth of these cells in different systems: cultivations in schotts, in spinner flasks and in bioreactor, varying the inoculum age (IA) and initial cell concentration (X0). Variation was observed in the lineage\'s infection profile. The most appropriate lineage for the production of biopesticida where the ones denominated EMBRAPA, UFRN and GibcoG, since these showed more than 40% of the infected cells with polyhedra, while the one denominated GibcoSF had less than 2% of the infected cells with polyhedra. When studying the effect of the number of subcultures in morphology and in cell growth, an increase of 10% of the diameter and 26% in the volume of the UFRN cells was observed compared to the GibcoSF cells. Moreover, the cell growth of UFRN was 49% lower than the GibcoSF\'s. When performed the Rotational Central Composite Design (RCCD) to analyze the effect of IA and X0, the maximum specific growth rate (?max) and the maximum cell concentration (Xvmax) in cultures in schott with UFRN cells, it was obtained an empirical model. When the IA and X0 were separately analysed, it was not found significant differences for Xvmax and ?max in relation to X0. For IA, however, it was achieved the most satisfactory results for inocula with IA of 72 and 96 hours: Xvmax equals to 5.97x106 cells/mL and to 5.99x106 cells/ml, and ?max of 0.70 day-1 and 0.63 day-1, respectively. Cultures in spinner with UFRN cells clumped what led to Xvmax of 2.00x106 cells/mL. In cultivation in bioreactor with UFRN cells, was reached Xvmax of 6.21x106 cells/mL, ?max of 0.70 day-1, Qo2 in the exponential phase of 67.3 ± 3.6x10-18 molO2/cell/s, glucose to the cell yield equal to 1.0x109 cell/g of glucose and glutamine to cell yield of 3.0x109 cell/g of glutamine. It was shown, therefore, the existence of the infection alterations among different lineages of Sf21, the importance of the physiological state of the cell for the subcultivation, the occurrence of changes in cell growth according to the cultivation systems and the effect of the number of subcultivation in morphology and in growth of Sf21 cells.

Um dos grandes problemas que afetam a produção in vitro de embriões é a variação entre touros em relação à fertilidade e o maior nascimento de embriões do sexo masculino. Muitos fatores podem alterar a razão de 1:1 entre os gêneros tanto na produção in vitro de embriões, como no método de Inseminação Artificial. No sentido de tentar alterar esta proporção sexual in vitro, estudamos em um primeiro momento, a variação entre touros no desenvolvimento de embriões machos e fêmeas, distribuídos nas fases de blastocisto jovem, blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido, bem como, a proporção macho: fêmea em relação a fase do blastocisto. Para tanto, oócitos foram coletados de ovários oriundos de matadouro e maturados em meio de maturação em incubadora por 24h. Espermatozóides viáveis de 17 touros do Programa de Melhoramento Genético da Raça Nelore, obtidos por centrifugação em gradiente de Percoll, foram utilizados para Fecundação in vitro. Após 12h, os supostos zigotos foram cultivados em meio de cultivo e células do cumulus em incubadora. Ao sétimo dia após a fertilização in vitro foi feita a seleção dos blastocistos viáveis que foram sexados com a utilização de primers Y-específico bovino e autossômico bovino, com visualização dos fragmentos amplificados em gel de agarose. Posteriormente, para obtenção de maior conhecimento a respeito dos animais testados, coletamos dados de progênie a campo destes animais e verificamos a proporção sexual de seus filhos nascidos pelo método da inseminação artificial, monta natural e possíveis correlações com características quantitativas. Diferenças entre touros foram observadas em relação à proporção dos sexos para as fases de blastocisto inicial e blastocisto expandido. Não foi observado desvio da proporção sexual em relação ao touro utilizado na produção in vitro de embriões e progênie a campo. Nosso dados sugerem que é possível alterar a proporção macho:fêmea em sistemas de produção in vitro de embriões pela seleção do estágio do blastocisto para transferência, e ainda, sugerem que touros apresentam variação em relação ao desenvolvimento in vitro de embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio do blastocisto. / Some of the main problems that affect the in vitro production of embryos is the variation among bulls in relation to fertility and the greater birth of male embryos. Many factors can change the ratio 1:1 between the genders, both in the in vitro production of embryos and in the method of artificial insemination. To try to change this sex ratio in vitro, we studied at first, the variation among bulls in the development of female and male embryos, the blastocyst-stage distributed in young blastocyst, blastocyst, expanded blastocyst and hatched blastocyst and the proportion male: female in relation to the blastocyst stage. For this, oocytes were collected from slaughterhouse ovaries and matured in maturation medium in an incubator for 24h. Viable sperm from 17 bulls belonging to the Breeding Program of Nellore, obtained by Percoll gradient centrifugation were used for in vitro fertilization. After 12 hours, the presumptive zygotes were cultured in culture medium and cumulus cells in an incubator. After 168 hours of in vitro fertilization the viable embryos in the blastocyst stage were classified. The determination of the sex of the blastocysts was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using a Y-specific sequence and bovine autosomal sequence visualized in agarose gel. Data analysis was conducted using the Statistical Analysis System software. Later, to obtain more knowledge about the animals tested, data was collected from the field progeny of these animals and established the sex ratio of the offspring produced by the method of artificial insemination, natural mating and possible correlations with quantitative traits. Differences between bulls were observed relating to the proportion of genders at the initial stages of blastocyst and expanded blastocyst. No deviation was observed in the sex ratio in relation to the bull used for in vitro production of embryos and offspring in the field. Our data suggest that it is possible to change the male to female proportion in production systems of in vitro embryos through the selection of the blastocyst stage for transfer, and also suggest that bulls show variation in relation to the in vitro development of male and female embryos, depending on the blastocyst stage.

Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado \"A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos\" foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado \"A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos\" foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado \"Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro\", verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, \"O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino\", constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs. / The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled \"in vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines\" cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, \"Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes\" we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled \"Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos\", we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, \"in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines\", we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.