Orientadores: Clarice Weis Arns, Helena Lage Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_MatheusCavalheiro_D.pdf: 16763908 bytes, checksum: 65c4aed6451181f383a10560fce87e51 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O vírus da Bronquite Infecciosa (VBI), pertencente à família Coronaviridae, é um importante patógeno à sanidade e fatores econômicos da produção avícola no Brasil e no mundo. O VBI possui múltiplos sorotipos e o frequente surgimento de novas variantes é um dos principais problemas relacionados a este vírus. Este trabalho tem como objetivo a investigação experimental da patogênese de um isolado de pombo (Columba/Brazil/2007/Unicamp/67T), caracterizado molecularmente pelo gene S1 como VBI sorotipo Massachusetts, e seus efeitos in vivo, em galinhas e camundongos. O presente estudo foi dividido em duas partes, na primeira um grupo de aves "specific pathogen free" (SPF) foi inoculado pela via óculo-nasal com a amostra viral proveniente de pombo. Os animais, de um dia de vida, foram sacrificados nos dias 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 21, 28, 35 e 42 dias pós-inoculação (dpi). Foram coletados suabes de traqueia, seio nasal e cloaca, além de órgãos como pulmão, íleo, pró-ventrículo (coletado entre 7 e 21 dpi), rim, tonsilas cecais (coletada a partir de 4dpi) e testículos (coletado a partir de 5 dpi). Sinais clínicos respiratórios como espirros, estertores, corrimento nasal, além de letargia, diarreia e perda de coordenação foram observados principalmente no 5dpi. A inibição da atividade ciliar ocorreu concomitantemente ao pico de sinais clínicos das aves. Foi analisado tropismo tecidual, através da quantidade de RNA viral detectado, pelo trato digestório. Os maiores títulos de RNA viral foram detectados na tonsila cecal, seguida pelo íleo (ambos no 5dpi) e cloaca (no 2dpi). Além disso, houve detecção de RNA viral no rim e trato respiratório, com maior título de RNA viral na traqueia. Os órgãos que apresentaram maiores danos teciduais através do exame histopatológico foram o rim, íleo e traqueia (todos no 5dpi). Por fim, as aves inoculadas com a amostra do VBI oriundo de pombo produziram anticorpos entre os dias 14 e 21dpi, detectados no soro destes animais através do ELISA. Na segunda parte do trabalho, a capacidade de replicação de diferentes variantes do VBI em camundongos foi avaliada. Para tanto, camundongos das linhagens Balb/C e A/J foram inoculados pela via nasal com duas amostras do sorotipo Massachussets (Mass) e com a variante brasileira (BR-I), e sacrificados no 3, 10 e 14 dpi. Não foram observados sinais clínicos nem lesões macroscópicas graves. O RNA viral foi detectado em todos os órgãos coletados, sendo os principais órgãos de replicação o seio nasal e pulmão (no 3dpi) para os camundongos da linhagem A/J e pulmão e duodeno (ambos no 3dpi) na linhagem de camundongos Balb/C, nos quais os títulos virais detectados foram mais altos. Pneumonia intersticial, edema e infiltrado mononuclear foram as principais alterações histopatológicas observadas no 3dpi em camundongos inoculados com as diferentes variantes. A presença da nucleoproteína viral, pela imunohistoquímica, foi detectada no duodeno, traqueia e pulmão de camundongos no 3dpi nas duas linhagens de camundongos. Os anticorpos contra o coronavírus aviário foram detectados somente no 3dpi. Assim, os resultados do presente estudo demonstraram que a variante Massachussets, com origem de pombo, causa a doença clínica em aves comerciais não vacinadas e pode replicar em modelo mamífero por um curto período de tempo, ressaltando a importância da vacinação e o papel potencial dos roedores como possível reservatório e carreador do vírus / Abstract: Infectious bronchitis virus (IBV) belonging to the family Coronaviridae is an important pathogen to sanity and economics of poultry production in Brazil and worldwide. The VBI has multiple serotypes and the frequent emergence of new variants is one of the main problems related to this virus. This work aims to experimentally investigate the pathogenesis of pigeon sample (Columba/Brazil/2007/Unicamp/67T), molecularly characterized by S1 gene as IBV Massachusetts serotype, and its effects in vivo in chickens and mice. This study was divided into two parts. In the first part, a group of birds "specific pathogen free" (SPF) was inoculated by oculo-nasal route with the viral sample from pigeon. The animals with one-day-old, were sacrificed on 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 21, 28, 35 and 42 days post-inoculation (dpi). Tracheal swabs, nasal sinus and cloaca were collected, and organs such as lung, ileum, pro-ventricular (collected between 7 and 21dpi), kidney, caecal tonsils (collected from 4dpi) and testes (collected from 5 dpi). Clinical signs such as sneezing, rales, nasal discharge, lethargy, diarrhea, and loss of coordination were observed mainly in the 5dpi. Inhibition of ciliary activity occurred concomitantly with the peak of clinical signs of birds. Tissue tropism was analyzed by the amount of viral RNA detected by the gastrointestinal tract. The higher titers of viral RNA were detected in the cecal tonsil, followed by the ileum (both in 5dpi) and cloaca (in 2dpi). In addition, viral RNA was detected in the kidney and respiratory tract, with highest titer of viral RNA in the trachea. The organs that showed severe tissue damage by histopathology were the kidney, ileum and trachea (all in 5dpi). Finally, the birds inoculated with the sample originated from IBV Pigeon produced antibodies between 14 and 21dpi, detected in the serum of these animals by ELISA. In the second part, the replication capacity of different variants of IBV in mice was evaluated. For this, mice of strains BALB/C and A/J were inoculated intranasally with two strains of Massachusetts (Mass) serotype and the Brazilian variant (BR-I), and sacrificed at 3, 10 and 14 dpi. No clinical signs or severe macroscopic lesions were observed. The viral RNA was detected in all organs collected, higher tittles were detected on sinus and lung (in 3dpi) for mice of strain A/J and on lung and duodenum (both in 3dpi) in the line of Balb/C; in this line the viral titles were higher than the strain A/J. Interstitial pneumonia, edema and mononuclear cell infiltration were the main histopathological changes observed in 3dpi in inoculated mice with different variants. The presence of viral nucleoprotein, immunohistochemistry was detected in the duodenum, trachea and lungs of mice in 3dpi in both mice strains. Antibodies against avian coronaviruses have been detected only in 3dpi. Thus, the results of this study demonstrate that the Massachusetts variant, originating from pigeon, cause clinical disease in commercial poultry unvaccinated and can replicate in mammalian model for a short period of time, emphasizing the importance of vaccination and the potential role of rodents as possible reservoir and the carrier virus / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Thesis (M.S.)--University of Delaware, 2007. / Principal faculty advisor: Jack Gelb, Dept. of Animal & Food Sciences. Includes bibliographical references.

Dissertation (Ph.D.)--Auburn University, 2006. / Abstract. Vita. Includes bibliographic references.

A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença altamente contagiosa causada por múltiplos genotipos/sorotipos do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV), um coronavirus do grupo 3. Embora classicamente associado ao trato respiratório, alguns tipos de IBV têm sido descritos com tropismo pelos rins e pelos tratos reprodutivos e entéricos, o IBV pode ser detectado em diversos tipos de tecidos, e também pode acometer aves de todas as idades. Este estudo tem como objetivo verificar a freqüência do IBV em amostras de diversos órgãos e conteúdo entérico de avós, matrizes, poedeiras comerciais e frangos de corte, genotipar as amostras detectadas e estudar a diversidade molecular entre as amostras brasileiras de IBV. Um total de 844 pools de diversos órgãos e conteúdos entéricos provenientes de 200 lotes de avós, matrizes, poedeiras comerciais e frangos de corte, das regiões Sul, Sudeste, Centro-oeste e Nordeste do Brasil, colhidas durante o período de 2007 a 2009 foram testadas para a presença de IBV com um RT-PCR dirigido à região não traduzida 3′(3′UTR). As aves amostradas apresentaram sinais clínicos compatíveis com a BIG. Todas as amostras de IBV detectadas foram tipificadas utilizando uma RT-PCR dirigida ao gene de espícula do vírus. Dezenove amostras tipificadas como variante foram submetidas ao seqüenciamento parcial da região codificadora da subunidade S1 e à análise genealógica. Considerando os pools de órgãos e de conteúdo entérico, 45,50% foram positivos para a presença de IBV, dos quais, 84,63% pertencem ao genotipo Variante e 9,89% ao sorotipo/genotipo Massachusetts. Considerando os lotes, 73,50% foram positivos para IBV, sendo 77,55% variantes e 6,12% Massachusetts. A análise genealógica revelou quatro linhagens virais, todas agrupadas em um exclusivo grupamento de genotipo brasileiro. Estes resultados demonstram que o IBV está disseminado em todas as regiões avícolas brasileiras, com um predomínio massivo de genotipos não Massachusetts e uma elevada diversidade molecular, que deve ser levada em consideração para desenvolver medidas preventivas contra o IBV. / Infectious bronchitis (IB) is a highly contagious disease of poultry caused by multiple geno/serotypes of avian infectious bronchitis virus (IBV), a group 3 coronavirus. Though classically associated to the respiratory tract, IBV strains also have been described which harbor tropism for the kidneys and the reproductive and enteric tracts, and might be detected in multiple tissues and can also affect birds of all ages. This survey aimed to assess the frequency of in multiple organs and enteric content samples from grandparents, breeders, layers and broilers, to genotype the IBV strains detected and to study the molecular diversity amongst Brazilian IBV strains. A total of 844 pools of multiple organs and enteric contents from 200 flocks of grandparents, breeders, layers and broilers from the Southern, Southeastern, Central-Western and Northeastern Brazilian regions collected between 2007 and 2009 was screened for the presence of IBV with an RT-PCR target to the 3 untranslated region (UTR). The sampled birds presented symptoms compatible with IB. All IBV strains detected were then typed using an RT-PCR target to the spike gene of the virus. Nineteen strains type as variants were submitted to partial sequencing of the S1 coding region and genealogic analysis. Regarding the organs and enteric content pools, 45.50% were positive for the presence of IBV, from which 84.63% were variant and 9.89% Massachusetts. Taking into account the flocks, 73.50% were positive for IBV, being 77.55% variants and 6.12% Massachusetts. Genealogic analysis revealed four viral lineages, all grouped in an exclusive Brazilian genotype cluster. This results shown that IBV is widespread in all Brazilian poultry regions, with a massive predominance of non-Massachusetts genotypes and a high molecular diversity, which must be taken into account in order to develop preventive measures against IB.

A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença altamente contagiosa causada por múltiplos genotipos/sorotipos do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV), um coronavirus do grupo 3. Embora classicamente associado ao trato respiratório, alguns tipos de IBV têm sido descritos com tropismo pelos rins e pelos tratos reprodutivos e entéricos, o IBV pode ser detectado em diversos tipos de tecidos, e também pode acometer aves de todas as idades. Este estudo tem como objetivo verificar a freqüência do IBV em amostras de diversos órgãos e conteúdo entérico de avós, matrizes, poedeiras comerciais e frangos de corte, genotipar as amostras detectadas e estudar a diversidade molecular entre as amostras brasileiras de IBV. Um total de 844 pools de diversos órgãos e conteúdos entéricos provenientes de 200 lotes de avós, matrizes, poedeiras comerciais e frangos de corte, das regiões Sul, Sudeste, Centro-oeste e Nordeste do Brasil, colhidas durante o período de 2007 a 2009 foram testadas para a presença de IBV com um RT-PCR dirigido à região não traduzida 3′(3′UTR). As aves amostradas apresentaram sinais clínicos compatíveis com a BIG. Todas as amostras de IBV detectadas foram tipificadas utilizando uma RT-PCR dirigida ao gene de espícula do vírus. Dezenove amostras tipificadas como variante foram submetidas ao seqüenciamento parcial da região codificadora da subunidade S1 e à análise genealógica. Considerando os pools de órgãos e de conteúdo entérico, 45,50% foram positivos para a presença de IBV, dos quais, 84,63% pertencem ao genotipo Variante e 9,89% ao sorotipo/genotipo Massachusetts. Considerando os lotes, 73,50% foram positivos para IBV, sendo 77,55% variantes e 6,12% Massachusetts. A análise genealógica revelou quatro linhagens virais, todas agrupadas em um exclusivo grupamento de genotipo brasileiro. Estes resultados demonstram que o IBV está disseminado em todas as regiões avícolas brasileiras, com um predomínio massivo de genotipos não Massachusetts e uma elevada diversidade molecular, que deve ser levada em consideração para desenvolver medidas preventivas contra o IBV. / Infectious bronchitis (IB) is a highly contagious disease of poultry caused by multiple geno/serotypes of avian infectious bronchitis virus (IBV), a group 3 coronavirus. Though classically associated to the respiratory tract, IBV strains also have been described which harbor tropism for the kidneys and the reproductive and enteric tracts, and might be detected in multiple tissues and can also affect birds of all ages. This survey aimed to assess the frequency of in multiple organs and enteric content samples from grandparents, breeders, layers and broilers, to genotype the IBV strains detected and to study the molecular diversity amongst Brazilian IBV strains. A total of 844 pools of multiple organs and enteric contents from 200 flocks of grandparents, breeders, layers and broilers from the Southern, Southeastern, Central-Western and Northeastern Brazilian regions collected between 2007 and 2009 was screened for the presence of IBV with an RT-PCR target to the 3 untranslated region (UTR). The sampled birds presented symptoms compatible with IB. All IBV strains detected were then typed using an RT-PCR target to the spike gene of the virus. Nineteen strains type as variants were submitted to partial sequencing of the S1 coding region and genealogic analysis. Regarding the organs and enteric content pools, 45.50% were positive for the presence of IBV, from which 84.63% were variant and 9.89% Massachusetts. Taking into account the flocks, 73.50% were positive for IBV, being 77.55% variants and 6.12% Massachusetts. Genealogic analysis revealed four viral lineages, all grouped in an exclusive Brazilian genotype cluster. This results shown that IBV is widespread in all Brazilian poultry regions, with a massive predominance of non-Massachusetts genotypes and a high molecular diversity, which must be taken into account in order to develop preventive measures against IB.

A bronquite infecciosa é uma doença viral, aguda e altamente contagiosa que afeta as aves da espécie Gallus gallus, de todas as idades, causando grandes perdas econômicas devido à mortalidade, queda na produção e qualidade dos ovos. Variações na sequência de aminoácidos na região hipervariável da subunidadade S1 da proteína de espícula (S) levam à emergência de novos sorotipos do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Este estudo teve como objetivo seqüenciar parcialmente o gene S1 para determinar a relação filogenética entre amostras vacinais e de campo com o intuito de investigar os genótipos circulantes. Cento e sessenta amostras foram coletadas, na forma de pools, de plantéis sintomáticos durante 2009/2010. Cada pool continha tecidos de 3 a 5 aves e foram compostos por diferentes órgãos (traquéia, pulmões, rins, conteúdo entérico, trato reprodutivo e swabs traqueais). As amostras foram triadas para a presença de IBV utilizando-se uma nested RT-PCR, direcionada a região 3UTR. As amostras positivas, (n=89) foram submetidas a nova nested RT-PCR dirigida para o gene S, resultando em 10 amplicons de 390pb que foram então submetidos a seqüenciamento de DNA e análise filogenética. As amostras brasileiras segregaram-se em dois grupos filogenéticos: Massachusetts (Mass) e tipos marcadamente brasileiros. Seis amostras agruparam-se no grupo Mass, com vacinas vivas atenuadas utilizadas no Brasil. Quatro amostras agruparam com cepas de campo brasileiras previamente descritas (acesso no GeneBank: FJ791257 to FJ791273). A identidade de aminoácidos no grupo Mass variou de 98% a 100%, sugerindo a detecção de vírus vacinal. Enquanto que entre as amostras brasileiras e o grupo Mass, a variabilidade de aminoácidos foi de 79% a 81%. Esses resultados mostram uma variação importante em genótipos virais circulantes nos plantéis industriais avícolas brasileiros. Portanto, o presente estudo reforça a contínua emergência e disseminação de novas linhagens de IBV no Brasil e a importância de constantes pesquisas e monitoramento, para que se compreendam aos fenômenos de emergência de novas linhagens e suas consequências, bem como para otimizar as medidas de controle do vírus. / Infectious bronchitis is a viral disease, acute and highly contagious that affects birds of the Gallus gallus species, of all ages, causing huge economic losses due to mortality, drop in production and quality eggs. Differences between serotypes of IBV are due to variations in the amino acids sequence in S1 hypervariable region subunit of spike protein (S). This study aimed to partially sequence the S1 gene to determine the phylogenetic relationship between field and vaccine viral types, and to investigate circulating genotypes in Brazil. One hundred and sixty pool samples were collected from symptomatic flocks during 2009/2010. Each pool contained tissues from 3 to 5 birds and was composed by different organs (tracheas, lungs, kidneys, enteric contents, tract reproductive and tracheal swabs). Samples were screened for the presence of IBV using a nested RT-PCR targeted to the 3UTR. Positive samples (n=56) were submitted to a nested RT-PCR target to S gene resulting in 10 amplicons of 390pb that were then submitted to DNA sequencing and analysis. Brazilian IBV genotypes segregated in two phylogenetic groups: Massachusetts (Mass) and Brazilian types. Six samples clustered in the Mass group, with live attenuated vaccines used in Brazil. Four samples grouped with field Brazilian strains previously described (GeneBank accession: FJ791257 to FJ791273). In Mass cluster aminoacids identity range from 98% to 100%, suggesting vaccine virus detection, in this last case. Moreover, the verified identity between samples from this study and Mass group ranged 79% to 81%. Therefore the present study reinforces the emergence and circulation of news lineages of IBV in commercial Brazilian flocks, as well as the importance of consistent research and monitoring to better understand this phenomen and its consequences, aiming to improved control measures against the virus.

A bronquite Infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença respiratória aguda e altamente contagiosa que acomete galinhas de diferentes idades. Foram utilizadas duas amostras do VBIG de problemas respiratórios e entéricos em frangos. As amostras foram classificadas como variantes do VBIG através da técnica de RT-PCR multiplex e sequenciamento parcial do gene S1. As amostras foram inoculadas em frangos de corte e aves SPF (specific pathogen free). As aves apresentaram sinais respiratórios 36 horas após inoculação independente da origem viral, entérica ou respiratória, sendo mais discretos nas aves SPF. As alterações macroscópicas mais evidentes foram congestão da mucosa traqueal, pulmão e rins. A análise histopatológica mostrou lesões semelhantes àquelas encontradas em outros sorotipos. A análise filogenética mostrou que as duas amostras eram similares e diferentes das amostras Massachusetts. Esses resultados sugerem que os isolados classificados como variantes apresentam potencial patogênico para aves. / Infectious bronchitis (IB) is an acute respiratory disease, highly contagious which affects chickens of different ages. This study was composed with two isolates obtained from broilers with respiratory and enteric problems. These isolates were classified as IBV variants by the multiplex RT-PCR and by sequencing of S1 gene. Isolates were inoculated in broilers and SPF birds. The birds showed respiratory signs 36 hours post inoculation, independently of the enteric or respiratory source. The respiratory signs were less evident on SPF birds. The histopathology analysis showed significant lesions on the trachea, lungs and kidneys. The phylogenetic analysis of S1 gene showed that both isolates were similar and different from Massachusetts strains. These results suggest that the isolates classified as variant have pathogenic potential for birds.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Andréa Fontes Garcia / Resumo: O Vírus da Bronquite Infecciosa, assim como outras doenças infecciosas, é um dos principais limitantes à produção de frango de corte. O coronavírus responsável por causar essa doença influencia na perda de desempenho das aves acometidas prejudicando o perfil financeiro do setor. Considerando o Brasil hoje, o segundo maior exportador mundial de carne de frango e esse coronavírus altamente contagioso por suas perdas em níveis financeiro e industrias, este trabalho objetivou avaliar a presença do vírus em uma região do noroeste paulista sem vacinação compulsória. Para investigar a presença de anticorpos contra o mesmo, foram coletados de 100 aviários 10 soros de cada, os animais eram alojados de forma aleatória em 2 regiões que formam um ângulo de 360º com a unidade de abate integradora parceira deste trabalho. Por fim, as amostras foram mensuradas através do teste de ELISA® indireto, que abordou o método estatístico X 2 . Os resultados indicaram que há circulação do vírus p<0.1, demonstrando uma necessidade em se adotar um novo protocolo de vacinação para a região. / Abstract: - Infectious Bronchitis Virus is one of the main limiting factors for the production of broiler chickens, and is still responsible for the loss of performance of these birds and even motivating high mortality rates. Considering Brazil today, the second largest exporter of poultry in the world and this highly contagious coronavirus, due to its losses to the financier of the industries, this work aimed to evaluate the presence of the virus in a region of the northwest of São Paulo without compulsory vaccination. Thus, to investigate the presence of antibodies against it, 10 sera of each 100 birds were randomly housed in 2 regions that form a 360 degree angle with the integrating slaughter unit partner of this work. Finally, the samples were measured through the indirect ELISA, which approached the chi - square statistical method. The results indicated that there is circulation of the virus p <0.1, demonstrating a need to adopt a new vaccination protocol for the region / Mestre

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-18T14:52:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2107997 bytes, checksum: 9af3c7a1788cd5f34e07226a97b0fc13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T14:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2107997 bytes, checksum: 9af3c7a1788cd5f34e07226a97b0fc13 (MD5) Previous issue date: 2015-07-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A criação de aves em sistemas industrializados vem adquirindo, mundialmente, características que envolvem uma elevada densidade animal, o que, consequentemente, leva ao surgimento de condições epidemiológicas capazes de predisporem ao aparecimento de problemas sanitários. Diante deste contexto, aumenta-se a preocupação com as doenças infecciosas, dentre elas, a Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), cujo agente etiológico é o Infectious bronchitis virus (IBV). O presente estudo teve como objetivo reconstruir a epidemiologia molecular do IBV, por meio de análises filogenéticas e filogeográficas dos genes estruturais N e S1, para estudo da evolução viral. Estas informações são importantes para estabelecer um padrão de dispersão em um contexto histórico geográfico, entender eventos biológicos no passado relacionados à dinâmica populacional e ajudar no desenvolvimento de estratégias efetivas de controle do IBV. Para isso, foram montados dois bancos de dados com sequências moleculares completas e parciais dos genes N e S1 obtidos no GenBank. O primeiro banco de dados (IBV1) contemplou sequências completas de S1 (N=256) e N (N=154) e o segundo banco de dados (IBV2) foi montado com sequências parciais de S1 (N=390) e N (N=173). Importantes parâmetros para estudo da evolução viral foram analisados nesse trabalho para os genes S1 e N do IBV, incluindo estimativas de eventos de recombinação, taxa de mutação, pressão de seleção, dinâmica populacional e dispersão espacial. Os resultados apontam que, na ausência de uma elevada taxa de mutação e pelo fato da seleção purificadora ser a principal forma de seleção natural no IBV, o processo de recombinação tem um papel fundamental na evolução do IBV. As análises de dinâmica populacional sugerem que, até meados da década de 2000, os diferentes programas de vacinação, juntamente com os métodos de biosseguridade, foram eficazes para controlar o crescimento do tamanho efetivo populacional do IBV. Contudo, a partir de 2007, o aumento da população de variantes do IBV, pode indicar que os protocolos vacinais, usados no presente, não estão sendo mais eficazes. Os resultados das análises de dispersão viral do gene S1 e N foram analisados de forma conjunta, a fim de reconstruir um padrão de dispersão do IBV ao longo de sua história evolutiva. O ponto de origem de todas as cepas atuais do IBV foi a China que, após dispersão local, disseminou para os Estados Unidos e, por conseguinte, se dispersou para diferentes países e continentes até alcançar a ampla distribuição mundial encontrada nos dias atuais. Os principais centros de dispersão atuais do IBV foram a China, Estados Unidos, Brasil, Taiwan e Europa. / The intensification of poultry in industrial systems has acquired, worldwide, features that involve a high stock density, which, consequently, leads to the emergence of epidemiological conditions that may predispose to the appearance of health problems. Given this context, the concern with infectious diseases increases, among the diseases is the Avian Infectious Bronchitis (IB), whose etiologic agent is the Infectious bronchitis virus (IBV). This study aimed to reconstruct the molecular epidemiology of IBV through phylogenetic and phylogeographic analyzes of structural genes N and S1, to the study of viral evolution. These pieces of information are important to establish a pattern of dispersion in a geographical historical context, to understand biological events in the past related to population dynamics and to help develop effective strategies for control of IBV. To establish a better outlook for discussion of IBV molecular epidemiology, there were created two databases with complete and partial molecular sequences of genes N and S1 obtained from GenBank. The first database (IBV1) considered complete sequences of the S1 (N = 256) subunit and of the N (N = 154) gene of IBV. To increase the extension of countries from which sequences are available, a second database (IBV2) was created with partial sequences of the S1 (N = 390) gene and the N (N = 173) gene. Important parameters for the study of viral evolution were analyzed in this work for the S1 and N genes of the IBV, including estimates of recombination events, mutation rate, selection pressure, population dynamics and spatial dispersion. The results show that, in the absence of a high mutation rate and because of the purifying selection to be the main form of natural selection in IBV, the recombination process plays a key role in the evolution of IBV. The analysis of population dynamics suggest that, until the mid-2000s, the different vaccination programs, along with the biosecurity methods have been effective in controlling the growth of effective population size of the IBV. However, since 2007, the increase in the population of IBV variants may indicate that the vaccine protocols, used in the present, have not been effective anymore. The results of analyzes of the viral spread of the gene S1 and N were analyzed together, in order to reconstruct a pattern of the IBV dispersion along its evolutionary history. The point of origin of all current strains of IBV was China, which after local dispersion spread to the United States of America and thus dispersed to different countries and continents until reaching the worldwide distribution found today. The current main scattering centers of the IBV were China, the United States, Brazil, Taiwan and Europe.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T14:27:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1652814 bytes, checksum: eb04b97fc0b892ebed6c35181487174a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1652814 bytes, checksum: eb04b97fc0b892ebed6c35181487174a (MD5) Previous issue date: 2015-08-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Infectious bronchitis virus (IBV) é uma das principais causas de perdas econômicas na indústria avícola, afetando galinhas de todas as idades, apesar das tentativas de controle por vacinação. Os objetivos deste estudo de três capítulos propôs-se: 1) analisar a composição genética das vacinas vivas H120 e Ma5 de IBV disponíveis comercialmente no Brasil, 2) promover a caracterização molecular de IBV acometendo um plantel de matrizes e, 3) investigar persistência viral nesse lote ao final do ciclo de produção e verificar a ocorrência de transmissão vertical. No capítulo 1 foi obtida a sequência completa do gene S1 das vacinas produzidas por diferentes laboratórios, sendo verificada que as vacinas H120 possuem subpopulações de IBV distintas, refletindo em até 14 diferenças na sequência de aminoácidos entre as vacinas. Na análise do cromatograma de S1 obtida da vacina Ma5 também foi detectado pico secundário, sugerindo a presença de subpopulação do vírus. Para abordar essa questão foi desenvolvido um sistema para identificar a população de espécies de RNA dessa vacina. Apesar de ser clonada foram identificadas pelo menos cinco subpopulações do vírus intra-vacina. Portanto, essa grande diversidade genética entre as vacinas poderia justificar os diferentes resultados da vacinação. No capítulo 2, a sequência parcial de S1 de IBV foi obtida diretamente de amostras clínicas. A vacina Ma5, previamente utilizada nesse lote, foi detectada na traqueia e no intestino delgado; enquanto subpopulação de IBV variante foi identificada em órgão específico das aves. Esse achado tem grande importância sob o ponto de vista aplicado porque ele ilustra o potencial repertório patogênico que a infecção por IBV de campo pode imputar sobre um lote de galinhas acometidas pela doença. Finalmente, no capítulo 3, diferentes órgãos dessas galinhas em final de produção e líquido cório-alantoide (LCA) de embriões vivos com 18 dias de incubação oriundos desse lote foram utilizados para a detecção e identificação de IBV. A vacina Ma5 foi detectada no intestino delgado, rins e oviduto das galinhas e no LCA de embriões. No entanto, nas tonsilas cecais foi detectado IBV com significativa diferença genética na comparação com a vacina Ma5 previamente utilizada e aqueles identificados nos diferentes órgãos das aves na época da doença. Esses achados sugerem que além da vacina, outras subpopulações de IBV podem persistir por longos períodos no hospedeiro e, pelo menos em galinhas em final de produção a vacina Ma5 pode ser transmitida verticalmente. / Infectious bronchitis virus (IBV) is a major cause of economic losses in the poultry industry, affecting chickens of all ages, despite attempts to control by vaccination. The objectives of this three-chapter study were: 1) analyze the genetic makeup of the 120 and Ma5 IBV vaccines strains available commercially in Brazil, 2) promote the molecular characterization of IBV affecting one broiler breeding flock and, 3) to investigate IBV persistence in this flock at the end of the production cycle and to verify the occurrence of vertical transmission. In chapter 1, the complete sequence of the S1 gene of vaccines produced by different laboratories was obtained and verified that the vaccines of the strain H120 have different subpopulations, resulting in up to 14 amino acid sequence substitutions among the vaccines. On the other hand, the analysis of Ma5 strain S1 gene an additional peak was detected suggesting the presence of subpopulation of the virus. To address this issue a system to identify the population of RNA species of the vaccine was developed. Despite being cloned, at least five subpopulations of genotypes were detected with in a Ma5 batch. Therefore, this great genetic diversity among the vaccines could justify the different vaccination reactions/results. In chapter 2, partial sequence of S1 of the IBV was obtained directly from clinical specimens. In alignment with the Ma5, which was previously used therein, the same was detected in the trachea and small intestine; while subpopulation of IBV variant was identified in specific organ of birds. This finding has great importance from the applied point of view because illustrates the potential pathogenic repertoire that infection by field IBV can charge on the same lot of chickens affected by the disease. Finally, in chapter 3, different organs of breeders at the end of production and allantoic fluid of embryos with 18 days of incubation deriving this flock were used for the detection and identification of IBV. The Ma5 vaccine was detected in small intestine, kidneys and oviduct of the chickens, and also in the allantoic fluid embryos. However, in the cecal tonsils, IBV was detected in significant genetic difference in comparison with the previously used Ma5 vaccine and those detected in different organs of the birds at the time of disease. These results suggest that in addition to vaccine, other (s) subpopulation (s) of IBV can persist for long periods in the lost least chickens at the end of production Ma5 vaccine can be transmitted vertically.