Activation of the NLRP3 inflammasome has been shown in response to numerous activators; here we show that the oxazolidinone antibiotic linezolid results in both the NLRP3-dependent in vitro release of the proinflammatory cytokine IL-1 Α; and in vivo neutrophilic influx following its intraperitoneal administration. Clinical use of linezolid is commonly limited by hematologic side effects; herein we also show NLRP3-deficiency protected animals against linezolid-induced effects on the bone marrow. Importantly, all previously described activators of the NLRP3 inflammasome have required the generation of reactive oxygen species (ROS). Linezolid is however unique amongst NLRP3 agonists in that its ability to activate the NLRP3 inflammasome in a ROS-independent manner. The pathways for ROS-dependent and ROS-independent NLRP3 activation converge upon mitochondrial dysfunction and specifically the mitochondrial lipid cardiolipin. We demonstrated that interference with cardiolipin synthesis specifically inhibits NLRP3 inflammasome activation. These findings firstly suggests that ROS generation is not the canonical activator of NLRP3 but rather an intermediary step leading to the mitochondrial perturbation that is tied to NLRP3 inflammasome activation and also implicate the involvement of mitochondrial lipid cardiolipin in this process; secondarily, linezolid-induced NLRP3 activation may account for thetoxicity associated with prolonged usage of this antibiotic.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21626号 / 医博第4432号 / 新制||医||1033(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 高橋 淳, 教授 宮本 享, 教授 林 康紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24500号 / 医博第4942号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 萩原 正敏, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Innate immunity has received impressive attention in the past decade owing to the discovery of the Toll like receptors (TLRs) and the NOD-like receptors (NLRs). While the TLRs specialize in fighting microbes at the cell surface, the NLRs complement by detecting and responding to intracellular microbes. Recently, the non-microbe sensing NLR called inflammasomes, have been identified, which senses metabolic stress as well as certain pathogenic microbes and elicits host’s inflammatory response. The NLR, NALP3 (formerly known as cryopyrin) forms a large cytoplasmic complex called the ‘inflammasome’ when NALP3, activated by a stimuli, associates with the adaptor proteins ASC and CARD-8. This interaction leads to the activation of pro-inflammatory caspase-1 which subsequently results in the formation of Interleukin (IL)-1β and IL-18. Mutations in the gene encoding NALP3, termed NLRP3 can lead to its constitutive activation resulting in an uncontrolled production of IL-1β. These mutations have been implicated in hereditary inflammatory diseases, often grouped under cryopyrin associated periodic syndromes (CAPS). This thesis describes a patient with a long history of arthritis and antibiotic resistant fever, but without the typical symptoms of CAPS. The patient was found to be a heterozygous carrier of two common polymorphisms Q705K in NLRP3 and C10X in the CARD-8. Experimental studies showed elevated levels of caspase-1 and IL-1β in the patient, and a total clinical remission was achieved by IL-1β blockade. These two polymorphisms combined, were found to occur in approximately 4% of the control population, suggesting the possibility of a genetic predisposition for inflammation in these individuals. Therefore, a cohort of rheumatoid arthritis (RA) patients, where elevated IL-1β could be one of the reasons behind chronic inflammation, was investigated. We found that carrying the combined polymorphisms resulted in increased RA susceptibility and a more severe disease course. Hypothetically, this subgroup of patients might benefit from IL-1β blockade. Additional studies are warranted to elucidate the functional effects of the two polymorphisms and to determine whether they identify a subgroup of patients that could benefit from IL-1 targeted therapy. Given the structural similarity of NALP3 to other NALPs, the possibility of involvement of the alternative, homologous genes cannot be eliminated.

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies aériennes. Chez les individus sensibles, l’inhalation d’allergènes entraine une inflammation pulmonaire se traduisant par des épisodes récurrents de toux, de difficultés respiratoires et une sécrétion de mucus. Des études réalisées chez l’animal ont mis en évidence un rôle crucial des lymphocytes Th2 et des cytokines associées (IL-4, IL-5 et IL-13). Plus récemment, il a été montré que les lymphocytes Th17 participaient à la physiopathologie de l’asthme. La présente étude s’intéresse à une cytokine majoritairement produite par les Th17 : l’IL-22. Différents travaux indiquent que cette cytokine serait impliquée dans l’immunitémucosale où elle exercerait des effets protecteurs ou pro-inflammatoires en fonction du modèle expérimental étudié. En utilisant un modèle murin d’inflammation pulmonaire allergique induite par l’ovalbumine, nous avons montré que l’IL-22 jouait un rôle pro-inflammatoire au cours de l’induction de l’asthme allergique puisque les souris déficientes en IL-22 développent une forme atténuée de la maladie. A l’inverse, nous avons constaté que l’IL-22 avait un effet protecteur dans la phase effectrice, et que cet effet était dépendant de l’IL-17A. Nos travaux mettent donc en lumière une double fonction de l’IL-22 dans l’asthme allergique chez la souris. En parallèle de ce travail, nous nous sommes intéressés au rôle de l’IL-1 et de l’inflammasome NLRP3 dans ce même modèle d’inflammation pulmonaire. Enfin, une troisième étude a permis de mettre en lumière un rôle encore inconnu de l’interleukine-33 dans l’activation des cellules dendritiques au cours de la mise en place de la réponse asthmatique. / Asthma is a heterogenous inflammatory disorder of the airways characterized by chronic airway inflammation, airway hyper-reactivity and by symptoms of recurrent wheezing, coughing and shortness breath. Understanding of the role of allergy and Th2 cells in asthma has benefited from mouse model of allergic asthma. Recently, several studies highlighted Th17 involvement in asthma pathogenesis. In the present study, we investigate the role of IL-22, a Th17-related cytokine, in a mouse model of allergic lung inflammation induced by ovalbumin. First, using IL-22 deficient mice, we demonstrated a pro-inflammatory role of IL-22 during the sensitization phase. In contrast, we observed a protective function of IL-22 during the effective phase. This protective effect of IL-22 seems to be dependent of IL-17. In conclusion, we demonstrate here a dual role of IL-22 in asthma pathogenesis. Since interleukin-1_ is critical for Th17 polarization in human, we also investigated the role of IL-1 signalling and NLRP3 inflammasome in our model of allergic airway inflammation. We showed that NLRP3 inflammasome and IL-1R/IL-1 pathway are critical to induce allergic lung inflammation, even in the absence of adjuvant. Finally, we studied the effect of interleukin-33 on dendritic cells activation and Th2 priming during antigen sensitization and in established asthma.

L'inflammasome est une voie de signalisation du système immunitaire inné impliquée dans la lutte contre les pathogènes et notamment dans la réponse aux infections bactérienne. L'activation de l'inflammasome entraine la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et une mort cellulaire caspase-1 dépendante. Des dérégulations de l'inflammasome conduisent aussi à des syndromes auto-inflammatoires graves ; il est donc essentiel de mieux comprendre sa régulation. Francisella tularensis est une bactérie intracellulaire facultative responsable de la tularémie. Son pouvoir pathogène est lié à sa capacité à s'échapper rapidement de son phagosome. Le système de surveillance du macrophage détecte la présence de F. tularensis via l'inflammasome AIM2. La détection de l'ADN bactérien induit la formation d'un large complexe composé de AIM2, le récepteur, d'ASC, l'adaptateur et de caspase-1, l'effecteur ; ce complexe forme un speck visible dans la cellule. Nous avons utilisé l'infection par F. tularensis de macrophages primaires murins pour étudier la régulation de l'inflammasome AIM2 dans un contexte physiologique. Nous avons ainsi identifié une boucle de rétrocontrôle, médiée par la caspase-1, qui régule négativement la formation/stabilité des specks AIM2. Nous avons étudié le rôle de facteurs vacuolaires et des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote dans l'activation de l'inflammasome AIM2 lors de l'infection par Francisella. Nous avons ainsi mis en évidence le rôle clef des péroxynitrites dans cette activation. Nos résultats suggèrent que des décomposeurs catalytiques des péroxynitrites pourraient avoir un rôle thérapeutique dans les maladies liées à l'inflammasome / The inflammasome is an innate immune signaling pathway involved in the fight against pathogens. This pathway can also be activated by danger signals. Inflammasome activation induces the release of the pro-inflammatory cytokines IL-1b and IL-18 and cell death in a caspase-1 dependent manner. The inflammasome pathway is a key antibacterial pathway. Deregulation of the inflammasome pathway can lead to serious auto-inflammatory syndromes ; it is therefore critical to better understand inflammasome regulation. Francisella tularensis is a facultative intracellular bacterium responsible for tularemia. Its ability to cause disease is linked to its ability to rapidly escape from the phagosome into the host cytosol where it replicates. The macrophage surveillance system can detect F. tularensis presence in the cytosol through the AIM2 inflammasome. Recognition of DNA induces the formation of a large complex consisting of AIM2, the receptor; ASC, the adaptor and caspase-1, the effector; this complex is visible as a speck within the cell. We used F. tularensis infection of bone marrow derived macrophages to study the activation of the AIM2 inflammasome in a physiological context. We have identified a feedback loop, dependent on caspase-1, negatively regulating speck formation/stability. Then, we studied the role of vacuolar factors and reactive oxygen and nitrogen species in the AIM2 inflammasome activation during Francisella infection. We also described a key role for peroxynitrite in this activation. Our results suggest that catalytic decomposer of peroxynitrite may have a therapeutic potential in diseases linked to inflammasome

L'infarctus du myocarde est la première cause de mortalité dans le monde. La reperfusion précoce est le traitement central de la prise en charge thérapeutique. Mais bien que salvatrice, la reperfusion s'accompagne elle-même de lésion dite de reperfusion. La mitochondrie et l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) sont au centre de ces lésions de reperfusion. Le dysfonctionnement mitochondrial et la nécrose entraine par ailleurs une intense réponse inflammatoire locale et systémique. Le post-conditionnement ischémique et pharmacologique (par la cyclosporine A, CsA) constitue une voie de recherche importante afin de limiter les lésions de reperfusion. Mes travaux de thèse se sont attachés à étudier le rôle de la Sirtuine 3 dans la cardioprotection ainsi que d'étudier la réponse inflammatoire locale et systémique induite par l'ischémie/reperfusion (I/R) myocardique.Nous avons précisé le mécanisme d'action du post-conditionnement, qui semble médié par l'activation de la sirtuine 3 et la désacétylation de la cyclophiline D qui contribue à inhiber l'ouverture du mPTP. Nous avons ensuite montré que l'I/R myocardique induisait une intense réponse inflammatoire chez l'homme avec un rôle particulier d'IL-17A, IL-6, IL-8 et IL-10. Cependant, cette réponse inflammatoire n'était pas modifiée par l'utilisation de CsA. Enfin, nous avons pu montrer que le facteur induit par l'hypoxie (HIF-1a), qui est surexprimé lors de l'I/R est un important activateur la réponse inflammatoire, notamment sur l'inflammasome, et que le Nicotinamide Mononucléotide possède un rôle anti-inflammatoire en empêchant la stabilisation de HIF-1a. Tous ces éléments sont autant de cibles thérapeutiques potentielles à développer avec de nouvelles études / Myocardial infarction (MI) is the first cause of death in the world. Reperfusion is the key treatment of MI. However, reperfusion can cause reperfusion injuries. Mitochondria and mitochondrial permeablility transition pore are the target of reperfusion injuries. Mitochondrial dysfonction and necrosis lead to an intense local and systemic inflammation. Ischemic post-conditioning (PC) and pharmacologic PC (with cyclosporine A, CsA) are used to limit reperfusion injuries. During my thesis, I worked on cardioprotective effet of sirtuin 3 and I studied inflammation induced by myocardial ischemia/reperfusion (I/R). I have shown that ischemic PC involve sirtuin 3 and deacetylation of cyclophilin D. I demonstrated that myocardial I/R induce an intense inflammatory response in Human with a key role of IL-17A, IL-6, IL-8 and IL-10. However, this inflammatory response is not modulated by the administration of CsA. A least, we studied the role of HIF-1a that is over expressed during I/R. We showed that HIF-1a activate inflammasome and the secretion of IL-1beta and IL-18. Furthermore, Nicotinamied Mononucleotide has anti-inflammatory effets with an action of HIF-1a. Taken together, these data contribute to develop new target for cardioprotection

Depuis plusieurs années, l’influence des pathologies parodontales sur certaines pathologies systémiques, notamment les maladies cardio-vasculaires et l’athérosclérose apparait de plus en plus évidente. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à l’évaluation des effets induits par Porphyromonas gingivalis, une des principales bactéries parodontopathogènes, et son lipopolysaccharide sur les cellules endothéliales, qui forment une interface entre le flux sanguin et la paroi vasculaire, d’où un rôle important dans l’initiation et le développement de la plaque d’athérome. Nous avons surtout ciblé les effets induits sur la cathepsine B, une protéase impliquée dans le développement de la plaque d’athérome, et sur l’inflammasome, un complexe impliqué dans la production d’IL-1beta. Les résultats de nos travaux montrent que l’infection par Porphyromonas gingivalis et la stimulation par son LPS sont capables d’induire une augmentation de l’activité enzymatique de la cathepsine B, ceci suivant différentes cinétiques. Dans les deux cas, ces augmentations d’activité se font sans modifications de la synthèse d’ARNm, ni de la concentration protéique de l’enzyme. Nos résultats démontrent également que l’infection par Porphyromonas gingivalis entraine une augmentation de l’expression ARN de l’inflammasome NLRP3, mais celle ci n’est pas observée au niveau protéique du fait d’un processus de protéolyse de la protéine NLRP3 suite à l’infection. Dans un deuxième temps, nous avons développé un modèle de parodontite expérimentale, fiable et reproductible, nous permettant d’envisager une expérimentation in vivo afin d’observer les interactions à distance entre maladies parodontales et athérosclérose sur dessouris apolipoprotéine-E -/-. / Periodontal diseases have been linked to systemic diseases especially cardiovascular diseases and atherosclerosis. In our study, we investigated the effects induced by an infection with Porphyromonas gingivalis, a major periodontal pathogen, and stimulation by its lipopolysaccharide on endothelial cells at the interface between the inner part of arteries and blood flow. We focused on the effects induced on cathepsin B, a protease involved in atherosclerosis and on the activation of inflammasome, an intracellular complex linked to secretion of IL-1beta. Results showed that infection with Porphyromonas gingivalis and stimulation by its lipopolysaccharide increase enzymatic activity of cathepsin B with different kinetics. These modifications are observed without any modifications of RNAm expression and protein concentration. We also showed that infection with Porphyromonas gingivalis increases RNAm expression of NLRP3 but this increase at the RNAm level is not associated with an increase of the protein concentration due to an induced proteolysis. Furthermore, we developed a reliable model of experimental periodontitis that will be used to analyze interactions between periodontitis and systemic diseases in vivo, especially in apolipoprotein-E -/- mice.

L’inflammasome NLRP3 est très impliqué dans de nombreuses pathologies inflammatoires comme la fibrose pulmonaire, la polyarthrite rhumatoïde, la goutte ou la maladie de Crohn. Cette voie de signalisation permet la libération de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β après activation par des signaux de danger comme l’ATP ou les cristaux d’acide urique (MSU). L’objectif de cette étude est de mieux comprendre le rôle des récepteurs purinergiques dans l’activation de l’inflammasome NLRP3 dans les macrophages humains. Nous montrons ici que le MSU ou les analogues de l’ATP (ATPγS ou BzATP) induisent la libération d’IL-1β dans des macrophages pré-activés par du LPS. Ces macrophages proviennent de la différenciation de monocytes issus de poches de sang périphérique (buffy coat) obtenues à l’EFS (Rennes). Nous observons que des antagonistes du récepteur purinergique P2X7, des inhibiteurs de la cathepsine B ou de la caspase-1 et des siRNA ciblant les récepteurs P2X7 et P2Y2 sont capables de réduire la libération d’IL-1β par les macrophages activés. De plus, dans cette étude nous mettons en évidence le rôle des récepteurs purinergiques dans la sécrétion d’autres cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-1α ou l’IL-6. Ce travail suggère que la voie d’activation de l’inflammasome NLRP3 par les récepteurs purinergiques représente une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des pathologies inflammatoires. / NLRP3-inflammasome pathway activation appears as the corner stone of manyinflammatory diseases including pulmonary fibrosis, rheumatoid arthritis, gout and Crohn disease. This pathway is known to be activated by danger signals such as ATP or Monosodium urate (MSU) leading to the pro-inflammatory cytokine IL-1β release. The aim of this study is to investigate the role of purinergic receptors in the activation of NLRP3-inflammasome pathway in human macrophages. We found here that MSU or analogs of ATP (ATPγS or BzATP) induced the release of IL-1β from LPS-primed MDM obtained from buffy coat (EFS, Rennes). We observed that purinergic P2X7 receptor antagonists, cathepsin B or caspase-1 inhibitors, siRNA targeting P2Y2R or P2X7R were able to reduce the release of IL-1β from activated macrophages. Furthermore we studied the role of purinergic receptors in pro-inflammatory cytokines release, such as IL-1α or IL-6. This study suggests that P2 receptors-NLRP3 inflammasome pathway represents a novel potential therapeutic target to control inflammation in inflammatory diseases.

Les canaux anioniques ont toujours été sous-estimés par rapport aux canaux cationiques principalement en raison des difficultés à caractériser leurs identités moléculaires et par l'absence d'inhibiteurs sélectifs puissants. C’est une classe comportant une grande hétérogénéité et une importante complexité comprenant entre autres le CFTR activé par l’AMP cyclique, les anoctamines activées par le calcium intracellulaire et les canaux VRAC activés lors d’un gonflement cellulaire. L’identité moléculaire d’une protéine essentielle aux courants ioniques déclenchés par le gonflement cellulaire a été découverte en 2014, permettant de pouvoir enfin investiguer le fonctionnement et le rôle de ces canaux. Dans une première partie, nous avons démontré l’absence de spécificité des inhibiteurs des principaux canaux chlorures. Cette étude met en exergue le besoin de développer de nouveaux inhibiteurs permettant de discriminer les différents canaux chlorures, mais aussi la nécessité de coupler l’approche pharmacologique à une approche génétique. Dans une deuxième partie, nous avons mis en évidence la perméabilité des canaux anioniques sensibles au gonflement cellulaire au glutathion, principal antioxydant cellulaire. Nos résultats suggèrent donc que les canaux VRAC pourraient être impliqués dans la régulation du stress oxydatif. Dans la troisième partie de ma thèse, nous avons montré que le facteur de croissance TGFβ1 stimule l’ouverture des canaux anioniques sensibles au gonflement cellulaire. Cette activation s’accompagne d’une perte de glutathion et d’une accumulation intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène. Cette dernière est à l’origine d’une transition épithélio-mésenchymateuse des cellules rénales. L’inhibition pharmacologique ainsi que la répression génétique des canaux VRAC réduit significativement les effets du TGFβ1. Enfin dans la dernière partie, nous avons caractérisé le rôle des canaux anioniques sensible au gonflement cellulaire dans la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires par les macrophages stimulés par un choc hypotonique. En collaboration, nous avons montré que le blocage de la régulation du volume cellulaire, sous le contrôle de ces canaux, entraine une inhibition de l’activation de l’inflammasome et donc de la sécrétion des facteurs pro-inflammatoires. Bien que les mécanismes de signalisation cellulaire restent à déterminer, ces travaux mettent en lumière l’importance des canaux anioniques sensibles au gonflement cellulaire dans la transition épithéliomésenchymateuse et l’inflammasome. Il apparait que ces canaux pourraient être des cibles thérapeutiques prometteuses dans un certain nombre de pathologies et qu’il est primordial de poursuivre les investigations dans ce domaine. / Anion channels have always been underestimated compared to cationic channels mainly because of the difficulty in characterizing their molecular identities and the absence of potent selective inhibitors. It is a class with great heterogeneity and complexity, including CFTR activated by cAMP, anoctamines activated by intracellulaire calcium and VRAC channels activated by cell swelling. The molecular identity of an essential protein to the ionic currents triggered by cell swelling was discovered in 2014, allowing the scientist community to investigate the role of these channels. In a first part, we highlighted the lack of specificity of the inhibitors of different chloride channels. This study shed lights on the need to develop new inhibitors to discriminate the different chloride channels, but also the need to couple the pharmacological approach to a genetic approach. In a second part, we have demonstrated the glutathione permeability of Volume Regulated Anion Channels. Our results therefore suggest that VRAC channels might be involved in the regulation of oxidative stress as glutathione is the main antioxidant within the cell. In the third part of my thesis, we have shown that TGFβ1 growth factor stimulates the opening of Volume Regulated Anion Channels which is correlated with both a loss of glutathione and an intracellular accumulation of reactive oxygen species. The latter is at the origin of an epitheliomesenchymal transition of renal cells. The pharmacological inhibition as well as the genetic repression of the VRAC channels significantly reduces the effects of TGFβ1. Finally, in the last part, we characterized the role of Volume Regulated Anion Channels in the secretion of pro-inflammatory factors by macrophages stimulated by hypotonic shock. In collaboration, we have shown that blocking the regulation of cell volume, under the control of these channels, leads to an inhibition of the inflammasome and therefore of the secretion of pro-inflammatory factors. Although cell signaling mechanisms remain to be determined, this work highlights the importance of VRAC in the epithelial-mesenchymal transition and inflammasome. It appears that these channels could be promising therapeutic targets in a certain number of pathologies and that it is essential to continue the investigations in this field.