Orientador: Leandro Gustavo de Oliveira / Resumo: Introdução: A gestação é uma condição fisiológica que pode apresentar maior suscetibilidade ao desequilíbrio entre fatores pró e antioxidativos, evoluindo assim com dano celular e resposta inflamatória. A autofagia é um processo que elimina organelas e proteínas danificadas do citoplasma, com potente mecanismo anti-inflamatório responsável pela manutenção da homeostase celular. A autofagia pode controlar a inflamação por meio da inibição da ativação do inflamassoma, complexo essencial para a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Assim, alterações nesses processos podem relacionar-se com disfunções celulares e doenças sistêmicas. Objetivos: Este projeto teve como objetivo avaliar se a exposição de explantes placentários a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) é capaz de induzir autofagia e levar a ativação do inflamassoma NLRP3. Métodos: Explantes placentários de gestantes normais obtidos após o parto foram cultivados em diferentes concentrações de H2O2 por 4 e 24 h após a avaliação da viabilidade dos mesmos nesses períodos. As enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase foram avaliadas nos sobrenadantes das culturas após 4 h. As expressões gênicas de marcadores de autofagia (LC3-II, beclin-1 e p62), do inflamassoma (NLRP3 e caspase-1) e das citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram avaliadas por RT-qPCR. Os níveis de gonadotrofina coriônica (hCG), proteína de choque térmico 70 (Hsp70) e citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram determinados por ensaio imunoenz... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome clinicamente identificada por hipertensão arterial e proteinúria e está associada à produção excessiva de citocinas proinflamatórias, deficiência na produção de citocinas reguladoras e aumento nos níveis séricos de anticorpos antifosfolípides (aPLs) em pacientes com PE grave. Os aPLs são uma família de autoanticorpos que reagem com proteínas ligantes de fosfolipídios, sendo seu principal alvo a beta-2 glicoproteina I (β2GPI). Estes anticorpos são responsáveis por inibir a diferenciação do sinciciotrofoblasto e restringir a migração trofoblástica, resultando em remodelação anormal das arteríolas espiraladas, alteração característica da PE. O inflamassoma é um complexo proteico que promove a secreção das citocinas proinflamatórias interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina 18 (IL-18) e, também a secreção da proteína “high-mobility group box 1” (HMGB1) após ativação por patógenos e/ou produtos endógenos associados ao dano celular. A autofagia é uma via de degradação celular ou de eliminação de organelas e proteínas através de processos lisossomais que são importantes para a manutenção da homeostase celular, promovendo a sobrevivência das células em resposta ao estresse. O presente trabalho teve como objetivos: 1. Investigar as proteinas relacionadas ao inflamassoma e à autofagia em placenta de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia e de normotensas; 2. Avaliar a relação existente entre inflamassoma e autofagia em células de trofoblasto extravil... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Preeclampsia (PE) is a syndrome clinically identified by hypertension and proteinuria and is associated with excessive production of proinflammatory cytokines, deficiency in the production of regulatory cytokines, and increased serum levels of antiphospholipid antibodies (aPLs) in patients with severe forms of PE. aPLs are a family of autoantibodies that react with phospholipid binding proteins, which the main target is beta 2 glycoprotein-I (β2GPI). These antibodies are responsible for inhibiting the differentiation of syncytiotrophoblast and restrict trophoblast migration, resulting in abnormal remodeling of the spiral arterioles, characteristic alteration in PE. The inflammasome is a protein complex that promotes the secretion of the proinflammatory cytokines interleukin-1 beta (IL-1β) and interleukin 18 (IL-18), and also the secretion of high-mobility group box 1 (HMGB1) protein after activation by pathogens and/or endogenous products associated with cellular damage. Autophagy is a pathway of cell degradation or elimination of organelles and proteins by lysosomal processes that are important for the maintenance of cellular homeostasis by promoting the survival of cells in response to stress. The objectives of the present study are: 1. To investigate the proteins related to inflammasome and autophagy in placenta from pregnant women with PE and from normotensive control; 2. To evaluate the relationship between inflammasome and autophagy in human extravillous trophoblast cel... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Carlos Rossa Junior / Banca: Shannon Margaret Wallet / Banca: Karina Gonzales Silvério Ruiz / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Paulo Sérgio Cerri / Resumo: Inflammasomes are multi-protein complexes that can amplify the inflammatory signal in situations involving host-microbial interactions and host tissue destruction, such as chronic periodontal disease. There is a relative scarcity of information on the role of NLRC4 and NLRP3 inflammasomes in periodontal disease. In this study, we used a model of bacteria-initiated periodontal disease in WT, Ipaf-knockout (Ipaf-KO), Caspase 1-knockout (Casp1-KO) and NLRP3-knockout (NLRP3-KO) mice to describe the effect of those inflammasomes on inflammation and alveolar bone resorption. Heat-killed Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) were injected in the gingival tissues on the palatal aspect adjacent to first molars of wild-type (WT), Ipaf-KO, Casp1-KO and NLRP3-KO mice, and control animals received the suspension vehicle (PBS). Severity of bone resorption was quantitated by μCT analysis. Inflammation was assessed by immunofluorescence, verifying the presence and intensity of a pan-leukocyte (CD45) and a neutrophil (Ly6G) markers. Osteoclast number was determined by TRAP and gene expression of RANKL, MMP-13, TNF-a, IL-6 and IL-10 in the gingival tissues was evaluated by RT-qPCR. In the first publication, μCT analysis showed a significantly greater inflammatory bone resorption in Ipaf-KO mice; however there was no difference between WT and Ipaf-KO on osteoclast numbers of inflammatory infiltrate. Expression of candidate genes was also similarly increased by the induction of experimental... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Inflamassomos são complexos multi protéicos capazes de amplificar o sinal inflamatório em condições de interações microbiota-hospedeiro e destruição tecidual, como a doença periodontal crônica. Devido à escassez de informações sobre o papel dos inflamassomos NLRC4 e NLRP3 na doença periodontal, utilizamos neste estudo um modelo de doença periodontal induzida por bactérias em camundongos WT, Ipafknockout (Ipaf-KO), Caspase 1-knockout (Casp1-KO) e NLRP3-knockout (NLRP3-KO) para descrever o efeito destes na inflamação e reabsorção óssea alveolar. Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) inativadas pelo calor foram injetadas nos tecidos gengivais palatais adjacentes aos primeiros molares dos camundongos normais e knockout, e os grupos controle receberam o mesmo volume do veículo de suspensão (PBS). A severidade da reabsorção óssea foi quantificada por análise de μCT. A inflamação foi avaliada por imunofluorescência, verificando-se presença e intensidade da coloração por marcadores de leucócitos (CD45) e neutrófilos (Ly6G). O número de osteoclastos foi determinado por TRAP e a expressão gênica de RANKL, MMP-13, TNF-a, IL-6 e IL-10 nos tecidos gengivais avaliada por RT-qPCR. A publicação 1 mostra uma reabsorção óssea inflamatória significativamente maior nos camundongos Ipaf-KO, sem diferenças, porém, no número de osteoclastos entre WT e Ipaf-KO. A expressão dos genes-alvo aumentou com a indução da doença periodontal, exceto de TNFa e IL-10, que foram altas n... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

A bactéria Legionella pneumophila é um bacilo Gram-negativo, flagelado causador da doença dos legionários e febre de Pontiac. O inflamassoma mais importante no controle da replicação desta bactéria é o composto por Naip5/NLRC4, que é responsável pelo reconhecimento de flagelina. A ativação do inflamassoma de Naip5/NLRC4 pela flagelina induz a ativação de caspase-1, induzindo a formação de poros na membrana, piroptose e controle da replicação desta bactéria. A participação da proteína adaptadora ASC é essencial para a nucleação deste complexo e secreção de citocinas inflamatórias como IL-1? e IL-18 por esta via. Além do controle da replicação de L. pneumophila pelo inflamassoma NLRC4 dependente de caspase-1, foi demonstrado que existe uma via induzida por NLRC4 independente de caspase- 1/11. Dessa forma, camundongos e células Nlrc4-/- são mais susceptíveis à infecção por esta bactéria do que as células Casp1/11-/-. Neste trabalho, nós identificamos que a via independente de caspase-1/11 é composta por Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-8 e é essencial para o controle da replicação de Legionella spp. flageladas em macrófagos e in vivo. Através da utilização de BMDMs Casp1/11-/- e Asc/Casp1/11-/- transduzidos com NLRC4-GFP ou ASC-GFP, identificamos que a formação de punctas de NLRC4 e ASC dependem do reconhecimento de flagelina e que ASC é essencial para a formação desses punctas. Também foi identificado que a infecção com L. pneumophila que expressa flagelina leva à ativação de caspase-8 de maneira dependente de ASC e Naip5, mas independente de caspase-1/11. De acordo com esses dados, o silenciamento de caspase-8 em macrófagos Casp1/11-/- aumentou a susceptibilidade dessas células à infecção com L. pneumophila flagelada. Além disso, macrófagos e camundongos Asc/Casp1/11-/- foram tão susceptíveis quanto os Nlrc4- /- e mais susceptíveis que os Casp1/11-/-. Nós observamos que o inflamassoma de NLRC4/ASC/Caspase-8 induz formação de poros e morte celular independente de gasdermina-D (GSDMD). Por meio da utilização de células de camundongos C57BL/6, foi observado que caspase-8 é recrutada para o inflamassoma de Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-1. Entretanto, a ativação de caspase-8 só ocorre na 10 ausência de caspase-1 ou GSDMD. Nossos dados sugerem que a ativação de caspase-8 no inflamassoma composto por NLRC4/ASC/Caspase-8 representa uma via alternativa que opera para garantir o controle da replicação de bactérias flageladas em situações nas quais ou caspase-1 ou GSDMD estão inibidas. / Legionella pneumophila is a flagellated Gram-negative bacillus that is the causative agent of the legionnaire\'s disease and Pontiac fever. The most important inflammasome for the control of L. pneumophila replication is the Naip5/NLRC4, responsible for the flagellin recognition. The activation of the Naip5/NLRC4 inflammasome leads to caspase-1 activation, consequently pore formation, pyroptosis and control of bacterial replication. The participation of the adaptor molecule ASC is essential for this complex nucleation and the secretion of inflammatory cytokines like IL-1? and IL-18 by this pathway. Besides the control of L. pneumophila replication by Naip5/NLRC4/Caspase-1 inflammasome, it was demonstrated there are NLRC4 responses independent of caspase-1/11. These explain why mice and macrophages Nlrc4-/- are more susceptible than Casp1/11-/-. In this work, we identified that the caspase-1/11-independent pathway is composed of Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-8 and it is essential for the control of flagellated Legionella spp. replication in macrophages and in vivo. Infection of Casp1/11-/- and Asc/Casp1/11-/- macrophages, transduced with NLRC4-GFP or ASC-GFP, showed that flagellin-positive bacteria triggered puncta formation that is ASC-dependent. Accordingly, Naip5 and ASC, but not caspase-1/11, were required for caspase-8 activation in response to flagellated bacteria. Silencing caspase-8 in Casp1/11-/- BMDMs increased the susceptibility to L. pneumophila infection. Furthermore, the macrophages and mice Asc/Casp1/11-/- are as susceptible as Nlrc4-/-, but more susceptible than Casp1/11-/-. We also found that the NLRC4/ASC/Caspase-8 inflammasome induces GSDMD-independent pore formation and cell death. Using C57BL/6 cells, we observed that caspase-8 is recruited to Naip5/NLRC4/ASC/Caspase-1 inflammasome. However, caspase-8 is just activated in the absence of caspase-1 or GSDMD. Our data suggest that caspase-8 activation in the NLRC4/ASC/Caspase-8 inflammasome represents an alternative pathway that operates to ensure the control of flagellated bacteria replication in situations which either caspase-1 or GSDMD are inhibited.

O reconhecimento da flagelina é compartilhado pelo receptor transmembrânico TLR5 e citosólico NAIP5/NLRC4. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos efetores individuais induzidos a partir do reconhecimento extra e intracelular da flagelina. Aqui, nós demonstramos que macrófagos estimulados com a flagelina citosólica (FLA-BSDot) induziu a expressão de iNOS, enzima responsável pela produção do óxido nítrico (NO). A expressão de iNOS foi dependente do eixo NAIP5/NLRC4/caspase-1 e independente de IL-1β, IL-18 e MyD88, descartando a via de ativação dos TLRs. Ainda, esta via não requer a ativação do fator de transcrição IRF-1, mas envolve a ativação do NF-kB, assim como a clivagem da enzima PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Por fim, avaliamos a relevância biológica desta via no controle das infecções por L. pneumophila e S. Typhimurium, dados que definem um mecanismo efetor adicional no controle de patógenos. / Recognition of flagellin is shared by transmembranic TLR5 and cytosolic NAIP5/NLRC4. However, little is known about the individual effector mechanisms induced by extra and intracellular flagellin. Here, we have demonstrated that cytosolic flagellin-stimulated macrophages (FLA-BSDot) induced iNOS expression, an enzyme responsible for the production of nitric oxide (NO). iNOS expression was dependent of the NAIP5/NLRC4/caspase-1 axis and independent of IL-1β, IL-18 and MyD88, discarding TLRs signaling pathway. Still, this pathway do not require the activation of IRF-1 transcriptional factor, but involves NF-kB activation as well as the cleavage of the enzyme, PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Finally, we have evaluated the biological relevance of this pathway in the control of the infections by L. pneumophila e S. Typhimurium, which define an additional effector mechanism to the control of pathogens.

La sécheresse oculaire est une pathologie fréquente qui peut impacter fortement la qualité de vie des patients. D’origine multifactorielle complexe, elle présente de nombreuses étiologies et son diagnostic est difficile en raison de présentations cliniques variées, en termes de symptômes et de tests cliniques, et en l'absence d'un marqueur spécifique. En outre, elle ne bénéficie actuellement que d’une seule molécule thérapeutique, cependant non curative, la ciclosporine. Devenant un réel problème de santé publique, la recherche visant à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à son apparition reste indispensable. L'état actuel des connaissances sur la sécheresse oculaire reconnaît à l'inflammation et à l'hyperosmolarité un rôle central. Ce travail de thèse a eu pour objectif d'étudier le comportement pro-inflammatoire des cellules conjonctivales dans un modèle in vitro classique de sécheresse oculaire induite par une hyperosmolarité saline. Nous avons ainsi montré que les cellules conjonctivales sécrètent une chimiokine pro-inflammatoire majeure, CCL2/MCP-1, et que cette induction est totalement sous la dépendance du facteur de transcription osmoprotecteur NFAT5/TonEBP ainsi que partiellement liée à la voie des MAPKs et de NFκB. Nous avons également observé que cette induction était en partie inhibée par la ciclosporine et la dexaméthasone. Nous avons ensuite complété ce travail par l'étude de l'inflammasome à la fois sur ces cellules et sur des monocytes, type cellulaire majeur ciblé par CCL2, en utilisant différents activateurs classiques dans le modèle d’hyperosmolarité. Nos résultats ont montré l’absence d’activation de l’inflammasome par l'hyperosmolarité seule. En revanche, l'hyperosmolarité aurait un rôle inhibiteur de l’inflammasome dans les monocytes. Ces résultats ouvrent des pistes nouvelles d’exploration afin de mieux comprendre les relations entre monocytes et cellules épithéliales de la conjonctive. Ils nous ont permis d'identifier le rôle incontournable de cellules épithéliales conjonctivales dans l'apparition ou le maintien de l'inflammation dans la pathologie et de caractériser certaines voies intracellulaires impliquées dans ce processus, ouvrant de nouvelles perspectives en termes de thérapeutiques. / Dry eye disease is a common condition that significantly impacts the quality of life of patients. It is a complex multifactorial disease with many etiologies and a diagnosis recognized as difficult due to the multiple clinical presentations in terms of symptoms and clinical tests, and lacking of a reliable and specific marker. There is currently only one therapeutic molecule to treat this disease, cyclosporin. However it is not curative. Dry eye disease is becoming an important public health problem and it is necessary to focus research on its underlying mechanisms, as they remain largely unknown. The current state of knowledge in dry eye disease recognizes inflammation and hyperosmolarity as central elements in the pathology. This work aimed to study the pro-inflammatory behavior of conjunctival cells in an in vitro model of dry eye disease by NaCl-induced hyperosmolarity. We showed that conjunctival cells secrete a major pro-inflammatory chemokine known as CCL2/MCP-1. This induction depends entirely on the osmoprotectant transcription factor NFAT5/TonEBP and is partially related to the MAPKs and the NFκB pathways. We showed that the process could be partially inhibited by cyclosporin and dexamethasone. We also studied the inflammasome in conjunctival cells and monocytes, the major cell type targeted by CCL2, using various classical inflammasome activators in this hyperosmolarity model. We did not observe any inflammasome activation induced by hyperosmolarity alone. On the other hand, hyperosmolarity shows signs of inhibiting inflammasome activation in monocytes. These results open new ways of understanding the relations between monocytes and conjunctival epithelial cells. They highlight the crucial role of the conjunctival epithelial cell type in the inflammation process in dry eye disease and make it possible to characterize intracellular pathways involved in this process, opening new therapeutic prospects.

Objetivo do estudo foi estudar a participação dos adipócitos e do fígado na inflamação e o papel da microbiota ao longo da progressão da caquexia. Para verificar o comportamento dos adipócitos e do fígado utilizamos ratos Wistar macho de 8 semanas, divididos em dois grupos: i) controle; ii) tumor. Este último foi subdividido em 2 grupos: a) 7º. e b) 14º. dia após a inoculação das células tumorais. Para avaliar o comportamento da microbiota durante o quadro de caquexia utilizamos camundongos C57Bl/6 convencional e germ free de 8-10 semanas, divididos em quatro grupos: i) Convencional controle; ii) Germ Free controle; iii) Convencional tumor; iv) Germ Free tumor. A célula tumoral usada para esse modelo foi Lewis Lung Carcinoma. Adipócitos isolados dos TAB, mesentérico, mais o fígado, mostraram que a via do inflamassoma esta ativa na fase terminal da caquexia. No modelo Germ Free, observamos que a caquexia apresenta-se é acelerada no tecido adiposo epididimal comparado aos camundongos convencionais tumor. Em conclusão, os adipócitos e o fígado desempenha papel importante no estabelecimento da inflamação, enquanto que a simbiose da microbiota parece ser essencial para combater a redução do tecido adiposo. / The goal of this study the role of adipocytes and liver inflammation and the role of microbiota along the progression of cachexia. The main aspects evaluated were increased of the inflammation, alteration in both pathways NF-kB and the inflammasome, and importance of the microbiota during progression of cachexia. To verify the behavior of adipocytes and liver I used Eight weeks-old male rats, I divided into two main groups: i) control; ii) tumor. The latter was divided into 2 groups: a) 7º. and b) 14º. day after tumor cell. To assess the microbial behavior during the development of cachexia I used C57BL/6 conventional mice and Germ Free 8-10 weeks, they were divided into four groups: i) Conventional control; ii) Germ Free control; iii) Conventional tumor; iv) Germ Free tumor. The tumor cell used in this model was Lewis Lung Carcinoma. Adipocytes isolated from TAB, mesenteric further the liver, showed that the inflammasome pathway is active in the terminal phase of cachexia. In model of Germ free mice we observed that cachexia is accelerated in epididymal adipose tissue compared to conventional tumor. In conclusion, adipocytes and liver seem to play a relevant role in the establishment of inflammation, while the microbial symbiosis seems to be essential for combating the reduction of adipose tissue.

Wear particles and ions from cobalt-chromium-molybdenum (CoCrMo)-based implants have been shown to cause adverse immune responses, including periprosthetic osteolysis leading to aseptic loosening, the main cause of implant failure. Previous studies have shown that these wear and corrosion products can lead to the release of inflammatory cytokines, including interleukin-1β (IL-1β), suggesting the involvement of the NLRP3 inflammasome. However, the mechanisms leading to IL-1β release have not been fully elucidated. The primary objectives of this thesis were to determine if, in murine macrophages, IL-1β release induced by micrometre-size CoCrMo particles and nanometre-size chromium oxide (Cr2O3) particles is: 1. Caspase-1-dependent; 2. Reduction-oxidation (redox)-dependent; and 3. NLRP3 inflammasome-dependent. Additionally, the effects of metal ions (Co2+, Cr3+, and Ni2+) on NLRP3 inflammasome activation and the effects of matrix metalloproteinase (MMP) inhibition on IL-1β release induced by CoCrMo particles were analyzed. Results showed that IL-1β release induced by CoCrMo particles was partly caspase-1-, redox-, and MMP-dependent, but NLRP3 inflammasome-independent. On the other hand, IL-1β release induced by Cr2O3 particles appeared to be NLRP3 inflammasome-dependent. Finally, IL-1β release induced by Cr3+, but not Co2+, appeared to be NLRP3 inflammasome-dependent, while Ni2+-induced IL-1β release appeared to be only partially NLRP3 inflammasome-dependent, suggesting that other pathways may also be involved. These findings, which provide additional insights into the mechanisms leading to IL-1β release induced by wear particles and ions from CoCrMo-based implants, may help the future development of therapeutic treatments to modulate wear product-induced inflammation and increase implant longevity.

Les inflammasomes sont des complexes protéiques impliqués dans l’immunité innée, qui sont activés par de multiples signaux de danger. Des mutations héréditaires des protéines de l’inflammasome peuvent être responsables de son activation excessive et in fine de la survenue de pathologies auto-inflammatoires chez l’être humain. À l’heure actuelle, aucun modèle cellulaire ne permet d’étudier spécifiquement la dynamique d’activation des inflammasomes et de préciser les conséquences des mutations activatrices sur celles-ci. J’ai donc généré un modèle humain macrophagique exprimant une protéine recombinante FLAG3x-ASC endogène, commune aux différents inflammasomes dans la lignée cellulaire humaine monocytaire/macrophagique THP-1. Cette lignée a été générée par édition génique par la technologie CRISPR-Cas9 en utilisant un substrat de recombinaison permettant d’insérer la séquence codant pour le FLAG3X in frame du locus PYCARD codant pour ASC. J’ai pu générer 6 clones FLAG3x-ASC dans la lignée THP-1. Les clones générés ont été validés en confirmant l’expression et la fonctionnalité de la protéine recombinante FLAG3x-ASC et en vérifiant l’absence de mutations indésirables hors-cible générée par la nucléase Cas9. Une fois ce modèle généré, j’ai pu également reproduire un variant génétique du gène NLRC4, protéine sensor de l’inflammasome du même nom, retrouvé chez un patient présentant une maladie auto-inflammatoire. La validation des clones mutant pour NLRC4 est en cours. Ce projet permettra la caractérisation de la dynamique d’activation de l’inflammasome dans un modèle physiologique et pathologique. Ceci permettra une avancée importante dans la compréhension de l’inflammasome et son agrégation ainsi que la régulation de ce complexe face aux signaux de danger. / Inflammasomes are multiproteic complexes that are involved in innate immunity and are activated by multiple signals of dangers. Hereditary mutations in inflammasome components lead to its excessive activation that is responsible for human auto-inflammatory disease. While these mutations are supposed to alter the dynamic of inflammasome activation, there is no current human model allowing the dynamic study of this complex. I generated a human cellular model expressing an endogenous FLAG3x ASC protein, an adaptator protein common to several inflammasomes, in the human monocytic/macrophagic THP-1 cell line. This model was created through CRISPR-Cas9 genome engineering using a recombination template allowing the in frame integration of the sequence encoding the FLAG3X peptide at the PYCARD locus encoding ASC. I generated and validated the expression and the functionality of 6 FLAG3x-ASC THP-1 cell lines. Furthermore, these cell lines are devoided of CRISPR-Cas9 off-target effect. In this model, I further reproduced a genetic variant of the inflammasome component NLRC4 observed in a patient presenting with autoinflammatory manifestation. The functional validation of the FLAG3x-ASC THP-1 harboring the NLRC4 variant is on-going. This project will allow to study the dynamic of the activation of the inflammasome in healthy and pathological conditions. Those results will help refine our comprehension of inflammasome complexation and regulation in response to danger signals.